RNAi w C. elegans

Interferencja RNA, czyli RNAi, to powszechnie stosowana technika, w której do organizmu wprowadza się dwuniciowy RNA, co prowadzi do ukierunkowanego wyciszania genów. Noblowskie odkrycie interferencji RNA umożliwiło badaczom wyciszanie dowolnego genu u C. elegans w celu określenia jego funkcji. Możemy indukować RNAi u C. elegans, przygotowując najpierw szalki z E. coli wykazującymi ekspresję dsRNA docelowego genu, którym będą żywić się nicienie. Następnie nicienie w 4. stadium larwalnym są przenoszone na szalki RNAi i pozostawiane do zniesienia jaj. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i oceniane pod kątem fenotypów.

Technologia RNAi jest często wykorzystywana u C. elegans do przeprowadzania odwróconych badań genetycznych, zautomatyzowanych przesiewów wysokoprzepustowych oraz jako narzędzie do badania procesów rozwojowych. W tym filmie wyjaśnimy koncepcję interferencji RNA, zademonstrujemy, jak stosować technikę RNAi u C. elegans i omówimy, w jaki sposób naukowcy wykorzystują RNAi jako narzędzie do lepszego zrozumienia powszechnych procesów biologicznych.

Zacznijmy od przedstawienia mechanizmu działania interferencji RNA. W przypadku C. elegans nicienie są karmione bakteriami, które zostały przekształcone plazmidami kodującymi dwuniciowe RNA komplementarne do genu, który chcemy wyciszyć. Jak wspomniano wcześniej, C. elegans żywi się przekształconymi bakteriami. Poprzez obecnie nieznany mechanizm, dsRNA po spożyciu wnika do tkanek C. elegans.

Po dostaniu się do komórki enzym Dicer tnie dwuniciowe RNA na krótkie interferujące RNA, czyli siRNA, o długości od 21 do 23 nukleotydów. Następnie siRNA łączy się z kompleksem wyciszania indukowanego przez RNA, znanym również jako "RISC", i ulega rozpleceniu. Następnie kompleks siRNA/RISC wiąże docelowe mRNA poprzez komplementarne parowanie zasad. Prowadzi to do degradacji mRNA, co skutkuje wyciszeniem (knock-down) danego genu.

Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować bakterie wykazujące ekspresję interesującego nas dwuniciowego RNA. W handlu dostępne są biblioteki bakterii zawierające plazmidy kodujące dsRNA dla tysięcy genów. W przeciwnym razie sekwencję genu docelowego należy sklonować do plazmidu przy użyciu standardowych technik klonowania. Plazmid zawiera gen oporności na antybiotyk ampicylinę, który może zostać wykorzystany do selekcji kolonii bakteryjnych zawierających plazmid.

Następnie, stosując standardowe techniki, należy wprowadzić plazmid kodujący interesujące nas dsRNA do szczepu (DE3) bakterii E. coli, które będą eksprimować dwuniciowe RNA. Należy również przeprowadzić transformację bakterii pustym plazmidem w celu uzyskania kontroli. Co istotne, szczep E. coli wykorzystywany w tych eksperymentach nie posiada polimerazy RNA III, która w przeciwnym razie trawiłaby dwuniciowe RNA. Bakterie te zawierają również indukowany przez IPTG gen polimerazy DNA T7, która dokonuje transkrypcji dsRNA w plazmidzie. Na koniec, bakterie (DE3) są oporne zarówno na tetracyklinę, jak i karbenicylinę, co pozwala utrzymać ekspresję polimerazy RNA III i zapobiega niepożądanemu wzrostowi bakterii.

Przetransformowane bakterie HT115(DE3) należy wysiać na płytki z agarem LB zawierającym 12.5 μg/ml tetracykliny i 25 μg/ml karbenicyliny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C; następnego dnia rano na płytkach pojawią się kolonie bakteryjne. Następnie należy wybrać pojedynczą kolonię bakterii i przenieść ją do 1 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w celu selekcji bakterii zawierających plazmid. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Po inkubacji nocnej do hodowli należy dodać 5 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez kolejne 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.

Po przygotowaniu bakterii należy przygotować płytki RNAi do karmienia nicieni. Płytki RNAi zawierają: agar, wodę, karbenicylinę, mieszaninę pożywek dla nicieni oraz IPTG w celu indukcji polimerazy DNA T7 w bakteriach, która dokonuje transkrypcji dsRNA z plazmidu. Do płytek RNAi należy dodać 0,5 ml hodowli bakterii i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby utworzyć trawnik bakteryjny.

Przed przeniesieniem nicieni na płytki RNAi ważne jest zsynchronizowanie ich stadium rozwojowego, aby wszelkie zaobserwowane różnice w fenotypie nie były artefaktem wynikającym ze stadium rozwoju. W celu synchronizacji stadiów rozwojowych należy najpierw wysterylizować nad ogniem platynową igłę.

Za pomocą igły należy przenieść nicienie w stadium L4 na każdą płytkę RNAi i inkubować przez noc w temperaturze 20 °C, aż staną się młodymi dorosłymi osobnikami składającymi jaja. Następnie młode dorosłe osobniki należy przenieść na nową płytkę RNAi i inkubować przez 6-8 godzin w temperaturze 20 °C, podczas których następuje składanie jaj. Po usunięciu wszystkich dorosłych osobników jaja te będą zsynchronizowane rozwojowo. Na koniec należy pozwolić nicieniom rosnąć na płytkach RNAi, aż osiągną stadium rozwojowe interesujące dla prowadzonej analizy.

W celu wizualizacji nicieni należy przygotować preparat z podkładką z 4% agaru. Najpierw przyklej do dwóch szkiełek przedmiotowych taśmę opisową, tworząc dystanse zapewniające jednorodną grubość podkładki agarowej. Umieść czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy dwoma dystansami i nanieś pipetą około 150 μl 4% roztopionego agaru na szkiełko. Szybko przykryj roztopiony agar kolejnym szkiełkiem, ustawiając je prostopadle do dystansów. Delikatnie rozdziel szkiełka; podkładka agarowa pozostanie przytwierdzona do jednego z nich.

Następnie dodaj do podkładki agarowej 10 μl środka znieczulającego, np. azotku sodu, aby unieruchomić zwierzęta. Za pomocą platynowej igły przenieś nicienie na podkładkę z anestetykiem i nałóż szkiełko nakrywkowe. Na koniec obserwuj nicienie pod mikroskopem. Porównaj zwierzęta poddane wyciszeniu genów metodą RNAi z grupą kontrolną i odnotuj różnice w wielkości, stadium rozwojowym, morfologii, wzorcach lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie oraz inne potencjalne fenotypy.

Jednym z najcenniejszych zastosowań interferencji RNA jest możliwość łatwego przeprowadzania odwrotnych przesiewów genetycznych. Odwrotny przesiew genetyczny to podejście służące do odkrywania funkcji genów poprzez wyciszanie znanej grupy genów i ocenę uzyskanego fenotypu. Na przykład badacze mogą wykorzystać bibliotekę bakterii wykazujących ekspresję dsRNA dla niemal wszystkich genów w C. elegans genom. Bakterie te hoduje się na płytkach wielodołkowych, a następnie podaje nicieniom. Pozwala to na ocenę efektów fenotypowych wyciszenia wielu genów za pomocą metody RNAi, co daje wgląd w normalne funkcje genów in vivo.

Zautomatyzowane przesiewy genetyczne są rodzajem odwrotnych przesiewów genetycznych o niezwykle wysokiej przepustowości. W zautomatyzowanych przesiewach genetycznych cała C. elegans genom można bardzo łatwo wyciszyć, wykorzystując robotyczną obsługę tysięcy klonów bakteryjnych oraz specjalistyczne instrumenty do analizy ilościowej.

Na przykład nicienie wykazujące ekspresję transgenicznego fluorescencyjnego reportera dla genu peptydu przeciwdrobnoustrojowego nlp-29 są poddawane wyciszaniu tysięcy genów metodą RNAi poprzez karmienie bakteriami. Jednocześnie nicienie są eksponowane na zarodniki grzybów. Następnie można ocenić odpowiedź peptydu przeciwdrobnoustrojowego na obecność grzyba.

Rozwój *C. elegans* jest często badany z wykorzystaniem metody RNAi. Naukowcy mogą stosować interferencję RNA w celu wyciszenia dowolnego genu (lub grupy genów) i dokładnej oceny, w jaki sposób dany gen wpływa na procesy zachodzące podczas rozwoju i/lub na tempo rozwoju. Na przykład wyciszenie za pomocą RNAi może pozwolić na zidentyfikowanie genów, których znokautowanie opóźnia rozwój, lub genów zaangażowanych w rozwój organów.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do interferencji RNA w *C. elegans*. Przeglądaliśmy mechanizm działania interferencji RNA oraz sposób wykorzystania interferencji RNA w C. elegans poprzez karmienie bakteriami. Interferencja RNA jest cennym narzędziem w badaniach przesiewowych w genetyce odwrotnej, w tym w zautomatyzowanych badaniach wysokoprzepustowych, a także użytecznym narzędziem do badania rozwoju. Dziękujemy za oglądanie!