Fotosynteza
- Chromatografia pigmentów roślinnych
- UWAGA: W tym eksperymencie oddzielisz pigmenty od liści szpinaku za pomocą bibuły chromatograficznej. Poszczególne pigmenty przemieszczają się po papierze w różnym tempie i mogą mieć różne kolory. Obliczając względną odległość, jaką pokonują pigmenty, ich współczynnik rozdzielczości i porównując je z wartościami literaturowymi, można zidentyfikować różne pigmenty. HIPOTEZY: W tym ćwiczeniu hipoteza eksperymentalna jest taka, że w liściach szpinaku będzie wiele pigmentów, które pochłaniają różne długości fal światła słonecznego. Hipoteza zerowa jest taka, że w liściu szpinaku znajduje się tylko jeden rodzaj pigmentu.
- Użyj ołówka, aby narysować linię dwa centymetry od jednego końca bibuły chromatograficznej.
- Następnie połóż środek do czyszczenia rur poziomo na wierzchu czystej zlewki o pojemności 400 ml.
- Umieść zaznaczoną ołówkiem stronę paska chromatograficznego na dnie zlewki.
- Następnie owiń papier wokół środka do czyszczenia rur tak, aby dolna krawędź ledwo dotykała dna zlewki, a następnie zabezpiecz go spinaczem do papieru.
- Gdy papier zostanie zabezpieczony wokół czyścika do fajek, wyjmij go ze zlewki, a następnie umieść oklepany suchy liść szpinaku nad zaznaczoną linią na bibule chromatograficznej.
- Rzuć monetę na liść szpinaku wzdłuż linii ołówka, poruszając się wiele razy w przód i w tył i wywierając stały nacisk. Po usunięciu liścia powinna być wyraźnie widoczna zielona linia.
- Następnie umieść 8 ml rozpuszczalnika chromatograficznego w zlewce.
- Opuść pasek chromatograficzny do zlewki tak, aby krawędź papieru stykała się z rozpuszczalnikiem, ale zielona linia nie. W razie potrzeby wyreguluj czyścik do rur.
- Nie naruszając zlewki, obserwuj, jak rozpuszczalnik przesuwa się w górę papieru, a poszczególne pigmenty oddzielają się.
- Gdy rozpuszczalnik przemieści się do połowy bibuły chromatograficznej, co zajmie około 10 minut, a pigmenty rozdzielą się na dobrze zdefiniowane pasma, wyjmij bibułę ze zlewki.
- Zaznacz ołówkiem, jak daleko przebył rozpuszczalnik, a następnie pozwól papierowi wyschnąć. UWAGA: Rozpuszczalnik szybko odparowuje.
- Następnie zapisz liczbę widocznych pasm i opisz ich kolor oraz względny rozmiar.
- Zmierz, jak daleko przebyły rozpuszczalnik i pigmenty, i zapisz te informacje dla każdego pigmentu w Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 1
- Rozpuszczalnik chromatograficzny należy wyrzucić do pojemnika na odpady pod wyciągiem. Wyrzuć paski chromatograficzne do zwykłego kosza, a następnie wyczyść zlewki wodą z mydłem.
- Pływające krążki liściowe w próżni
- UWAGA: W tym eksperymencie będziesz pośrednio obserwować fotosyntezę i oddychanie komórkowe za pomocą pływającego dysku liściowego w roztworze. Podczas fotosyntezy pęcherzyki powietrza spowodują, że liście będą unosić się na wodzie, a podczas oddychania dyski opadną. HIPOTEZY: W tym ćwiczeniu hipoteza eksperymentalna jest taka, że krążki liści będą miały większą szybkość fotosyntezy w roztworze wodorowęglanu, ponieważ wodorowęglan dostarcza dodatkowy CO2 do napędzania fotosyntezy, powodując unoszenie się większej liczby krążków liści. Dodatkowo wszystkie dyski zapadną się w ciemności podczas oddychania komórkowego. Hipoteza zerowa jest taka, że nie będzie różnicy w tempie fotosyntezy, a tym samym w liczbie pływających dysków, między wodorowęglanem a wodą lub jasnymi i ciemnymi zabiegami.
- Aby umieścić krążki z liśćmi w próżni, najpierw wyjmij tłoki z dwóch strzykawek o pojemności 20 ml, a następnie umieść 10 krążków liściowych w każdej probówce strzykawki. Oznacz jedną strzykawkę jako "wodorowęglan", a drugą strzykawkę jako "woda".
- Wymień tłoki i naciskaj tłok, aż w strzykawce pozostanie tylko niewielka ilość powietrza. Uważaj, aby nie uszkodzić talerzy liściowych.
- Wyciągnąć 5 ml roztworu wodorowęglanu do jednej ze strzykawek. Odwrócić i zakręcić strzykawką, aby zawiesić krążki liściowe w roztworze.
- Wypchnij jak najwięcej powietrza, nie wyrzucając roztworu ani nie uszkadzając krążków liściowych.
- Następnie wciągnij 5 ml roztworu wodnego do drugiej strzykawki i zakręć nim zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 3).
- Aby wytworzyć próżnię, przytrzymaj jeden palec na końcówce strzykawki, jednocześnie odciągając tłok. Przytrzymaj to przez 10 sekund, jednocześnie obracając strzykawką, aby utrzymać krążki liściowe w zawiesinie.
- Następnie zwolnij próżnię. UWAGA: Dyski powinny wchłonąć roztwór do przestrzeni powietrznych w swoich tkankach i powinieneś zobaczyć, jak toną. Jeśli dyski nie toną, możesz powtórzyć wytwarzanie próżni do trzech razy.
- Następnie dodaj 50 ml roztworu wodorowęglanu do plastikowego kubka lub szklanej zlewki, a następnie delikatnie dodaj krążki ze strzykawki próżniowej z wodorowęglanem.
- Dla kontroli, dodaj taką samą ilość wody do identycznej filiżanki, a następnie dodaj krążki liściowe ze strzykawki próżniowej wody. Odpowiednio oznacz pojemniki.
- Umieść obie filiżanki pod źródłem światła.
- Co pięć minut zapisuj liczbę krążków unoszących się na powierzchni kubka w Tabeli 3, aż minie 20 minut. Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 3
- Następnie wyjmij kubki ze źródła światła, a następnie zakręć nimi tak, aby krążki na powierzchni mieszały się z gazami również na powierzchni.
- Przenieś kubki w ciemne miejsce. Co pięć minut rejestruj liczbę krążków liściowych unoszących się na powierzchni do upływu 20 minut. Obracaj kubkiem za każdym razem przed umieszczeniem go z powrotem w ciemności.
- Aby posprzątać, wyrzuć krążki liści do kosza i wlej roztwór wodorowęglanu do odpływu. Dokładnie umyć strzykawki i kubki.
- Wyniki
- UWAGA: W pierwszym eksperymencie zaobserwowałeś, jak daleko przemieszczają się pigmenty z liści szpinaku na bibule chromatograficznej. Różne pigmenty pochłaniają światło o różnych długościach fal.
- Używając kolorowych pisaków lub ołówków, narysuj pozycje pasm pigmentu i rozpuszczalnika na rysunku 3.
- Oblicz współczynnik retencji, czyli wartości Rf dla pigmentów, co odbywa się poprzez podzielenie odległości, na jaką dany pigment przesunął się w górę papieru od linii, przez odległość, na jaką rozpuszczalnik przesunął się w górę papieru od linii.
- Porównaj obliczone wartości Rf z wartościami w Tabeli 2, aby określić tożsamość pigmentu. Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 2
- Zapisz te dane w Tabeli 1. UWAGA: W drugim eksperymencie zaobserwowałeś unoszące się i opadające dyski liściowe jako pośredni pomiar fotosyntezy i oddychania.
- Wykres wyników z czasem i minutami na osi x oraz liczbą pływających dysków na osi y. Użyj dwóch różnych linii, aby przedstawić kontrolę wody i uzdatnianie wodorowęglanów.
- Dodaj linię do wykresu, aby wskazać punkt, w którym dyski zostały usunięte ze stanu światła i umieszczone w ciemności.
- Następnie, zaczynając od stanu wodorowęglanu, użyj wykresu, aby określić punkt, w którym 50% krążków liściowych unosiło się. Nazywa się to czasem efektywnym lub ET50. UWAGA: Zauważysz, że dyski prawdopodobnie osiągną znak 50% pływania raz w stanie jasnym, a następnie ponownie w stanie ciemnym.
- Twoje próbki wody mogły, ale nie musiały, osiągnąć znak ET50. Jeśli tak, dodaj wiersz również dla tej próbki.
- Na koniec porównaj swoje wartości i wykresy ET50 z resztą klasy.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: Why do different pigments travel at different rates during plant pigment chromatography?
Different pigments have varying solubility in the chromatography solvent, causing them to travel at different rates up the paper. Pigments that dissolve more readily in the solvent move faster and travel farther, while less soluble pigments move slower. This separation allows you to identify individual pigments by calculating their retention factor (Rf) values and comparing them to literature standards.
Q2: What does the retention factor tell you about a pigment in chromatography?
The retention factor (Rf) is calculated by dividing the distance a pigment traveled by the distance the solvent traveled. This ratio is consistent for each pigment under the same conditions, allowing you to identify unknown pigments by comparing your calculated Rf values to reference values in literature tables. Higher Rf values indicate pigments that are more soluble in the solvent.
Q3: How does vacuum infiltration help measure photosynthesis in leaf discs?
Vacuum infiltration removes air from leaf tissue spaces, allowing the discs to sink initially. During photosynthesis, oxygen produced by the leaves fills these air spaces, causing the discs to float. By counting floating discs over time, you indirectly measure the rate of photosynthesis. This method also allows observation of cellular respiration quantification using microrespirometers procedure when comparing light and dark conditions.
Q4: Why do leaf discs sink in the dark during the floating disc experiment?
In darkness, photosynthesis stops and leaf cells perform cellular respiration, consuming oxygen from the air spaces in leaf tissue. As oxygen is depleted, the discs become denser and sink. This demonstrates that photosynthesis, not respiration alone, produces the oxygen that causes discs to float in light conditions.
Q5: What is the purpose of using bicarbonate solution versus water in the leaf disc experiment?
Bicarbonate solution provides additional carbon dioxide to fuel photosynthesis, increasing the rate at which leaf discs produce oxygen and float. The water control lacks this extra CO2 source, allowing you to compare photosynthetic rates between the two treatments. This comparison demonstrates how substrate availability affects the rate of photosynthesis.
Q6: What does ET50 represent in the leaf disc floating experiment?
ET50 is the effective time at which 50% of leaf discs are floating. By determining when this threshold occurs in both light and dark conditions, you can quantify the rate of photosynthesis and respiration. Comparing ET50 values between bicarbonate and water treatments reveals how substrate availability influences photosynthetic rate.
Q7: How do you prepare chromatography paper to separate spinach leaf pigments?
Draw a pencil line two centimeters from the paper's bottom, then roll a fresh spinach leaf over this line using steady pressure with a coin. This transfers pigment onto the paper as a concentrated band. The paper is then suspended in chromatography solvent, which travels up the paper and carries pigments at different rates, creating separated bands of distinct colors.