Aktywność enzymatyczna
At the end of this lab, students should know...
Co to są enzymy?
Enzymy są katalizatorami biologicznymi, które zwiększają szybkość i wydajność reakcji biochemicznych. Większość enzymów to białka, ale niektóre cząsteczki kwasu rybonukleinowego mają również właściwości katalityczne.
W jaki sposób enzymy katalizują reakcje?
Enzymy katalizują reakcje poprzez obniżenie energii aktywacji reakcji.
Co...
-
Probówki200
-
Stojak na probówki10
-
Zakraplacz5
-
Zegar5
-
Wykres pH5
-
Taśma etykietująca5
-
Znacznik5
-
Aparat/telefon z kamerą5
-
Parafilm/folia uszczelniająca1 na stację
-
Płyta grzewcza1 na stację
-
Kostka lodu (1/2 tacy)1 na stację
-
Termometr1 na stację
-
pH-metr/paski pH1 dla całego laboratorium
-
Nóż1 dla całego laboratorium
-
Blender1 dla całego laboratorium
-
Ściereczka do sera (0,5 m)1 dla całego laboratorium
-
Filtr do kawy1 dla całego laboratorium
-
0,1 M fosforan sodu roztwór diozasadowy (250 ml)-1 W zależności od wielkości laboratorium
-
0,1 M fosforan sodu jednozasadowy (250 ml)-1 W zależności od wielkości laboratorium
-
Rzepa (1-2)-1 W zależności od wielkości laboratorium
-
Nadtlenek wodoru (3%) (15 mL)-1 W zależności od wielkości laboratorium
-
Guaiacol (roztwór koncentratu, 1-3mL)-1 W zależności od wielkości laboratorium
-
Alchohol do nacierania izopropylu (100mL)-1 W zależności od wielkości laboratorium
-
Kapsułki buforowe pH/pH (zakres pH- 3-8)-1 W zależności od wielkości laboratorium
- Badanie wpływu pH i temperatury na aktywność peroksydazy
- Aby przygotować bufor ekstrakcyjny dla enzymu peroksydazy, zmieszaj równe objętości 0,1 M jednozasadowego fosforanu sodu i 0,1 molowego roztworu dwuzasadowego fosforanu sodu, aby uzyskać końcową objętość 500 ml.
- Przetestuj otrzymany roztwór za pomocą pH-metru. Mieszanina powinna mieć pH od 6,8 do 7,2.
- Aby wyekstrahować peroksydazę rzepy, użyj noża, aby usunąć zewnętrzną warstwę rzepy, a następnie pokrój rzepę na około dwucentymetrową kostkę.
- Umieść 30 g kostek rzepy w blenderze z 300 ml buforu ekstrakcyjnego i zmiksuj kostki rzepy na wysokich obrotach trzy razy przez około 15 sekund za każdym razem.
- Przefiltruj homogenizowaną mieszaninę przez trzy warstwy gazy, a następnie przecedź otrzymany roztwór przez jeden filtr do kawy.
- Przechowuj filtrat w butelce o pojemności 500 ml i natychmiast umieść butelkę w lodówce.
- Następnie, aby przygotować roztwory substratów enzymatycznych, najpierw dodaj 15 ml 3% H2O2 do 435 ml wody destylowanej, aby rozcieńczyćH2O2 do stężenia 0,1%.
- Aby przygotować reagent zmieniający kolor, rozpuść 0,2 ml stężonego gwajakolu w 100 ml alkoholu izopropylowego i przechowuj ten roztwór gwajakolu w lodówce.
- Następnie, aby przygotować roztwory dla różnych warunków pH, dodaj 100 ml wody destylowanej do sześciu zlewek o pojemności 250 ml i umieść zawartość kapsułki buforowej o pH 3, 4, 5, 6, 7 i 8 w oddzielnych zlewkach.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: How do you prepare an extraction buffer for peroxidase enzyme experiments?
Mix equal volumes of 0.1 M sodium phosphate monobasic and 0.1 M sodium phosphate dibasic solutions to achieve a final volume of 500 mL. Test the resulting solution using a pH meter to ensure it falls between pH 6.8 and 7.2. This buffer maintains optimal enzyme stability during extraction and storage.
Q2: What steps are involved in extracting peroxidase from turnip tissue?
Remove the outer layer of a turnip and cut it into approximately two cm cubes. Place 30 g of turnip cubes into a blender with 300 mL extraction buffer, and blend at high speed three times for about 15 seconds each. Filter the homogenized mixture through three layers of cheesecloth, then strain through one coffee filter and refrigerate immediately.
Q3: How is the hydrogen peroxide substrate solution prepared for enzyme assays?
Add 15 mL of 3% hydrogen peroxide to 435 mL distilled water to dilute the H2O2 to a 0.1% concentration. This diluted substrate solution is used to measure enzyme activity by providing the substrate that the enzyme catalyzes, producing measurable color changes.
Q4: What is the purpose of guaiacol in peroxidase activity experiments?
Guaiacol serves as a color-changing reactant that indicates enzyme activity. Dissolve 0.2 mL concentrated guaiacol in 100 mL of isopropyl rubbing alcohol and store in the refrigerator. When peroxidase catalyzes the reaction with hydrogen peroxide, guaiacol undergoes oxidation, producing a visible color change that allows quantification of enzyme performance.
Q5: Why are multiple pH buffer solutions prepared separately in this experiment?
Multiple pH buffers allow investigation of how pH affects peroxidase activity. Add 100 mL distilled water to six 250 mL beakers and add buffer capsule contents with pH values of 3, 4, 5, 6, 7, and 8 to separate beakers. Testing enzyme activity across this pH range reveals the optimal pH for peroxidase function and demonstrates enzyme sensitivity to environmental conditions.
Q6: How does proper storage of extracted peroxidase enzyme affect experimental results?
The filtrate containing extracted peroxidase must be immediately placed in a refrigerator after preparation. Cold storage preserves enzyme structure and catalytic activity by slowing degradation and denaturation. Proper storage ensures consistent and reliable enzyme activity measurements throughout the experiment and maintains data integrity.
Q7: What role does enzyme substrate concentration play in measuring peroxidase activity?
The diluted 0.1% hydrogen peroxide substrate provides a consistent reaction medium for measuring enzyme kinetics and performance. Standardized substrate concentration ensures that observed activity changes reflect true differences in enzyme function under varying pH and temperature conditions rather than substrate availability limitations.