Analiza enzymów izolacyjnych i restrykcyjnych DNA
Odkrycie DNA jako cząsteczki dziedzicznej we wszystkich organizmach doprowadziło do ogromnych przełomów naukowych i medycznych oraz znacznie poszerzył…
Ekstrakcja DNA to usuwanie i oczyszczanie DNA z komórek. Po pierwsze, komórki są poddawane lizie - rozłupywane - zwykle poprzez połączenie fizycznego rozerwania i traktowania chemikaliami, takimi jak detergent, który rozpuszcza błony komórkowe i jądrowe. SDS lub dodecylosiarczan sodu jest powszechnie stosowanym detergentem, który działa poprzez rozpuszczanie białek i lipidów tworzących te błony. Zawartość może następnie swobodnie unosić się w otaczającym roztworze.
Następnie DNA musi zostać oddzielone od innych obecnych cząsteczek. Proteinaza K dodana do reakcji rozbije wiązania peptydowe i strawi białka zanieczyszczające. Następnie do próbki dodaje się sól, która stabilizuje ujemnie naładowane grupy fosforanowe w szkielecie DNA i po dodaniu lodowatego alkoholu wytrąca DNA z roztworu. Biały osad zbiera się przez odwirowanie go w wirówce, gdzie osiada na dnie probówki. Po umyciu i ponownym zawieszeniu w roztworze buforowym, wyekstrahowane DNA może być ostatecznie wykorzystane w badaniach lub zastosowaniach biotechnologicznych.
Niektóre zastosowania biotechnologiczne, takie jak odciski palców DNA, które mogą identyfikować nowe wzorce w DNA specyficzne dla danej osoby lub osób, obejmują stosowanie enzymów restrykcyjnych. Enzymy restrykcyjne to cząsteczki, które oddziałują z DNA i rozpoznają określone sekwencje. Po zidentyfikowaniu ich konkretnego miejsca przecinają DNA. Spowoduje to, że pasmo zostanie pocięte na jeden lub więcej liniowych kawałków. Jeśli wyekstrahowane DNA było plazmidem, okrągłym fragmentem DNA najczęściej występującym u bakterii, wszelkie cięcia spowodują, że DNA utworzy liniowy fragment lub fragmenty. Różne enzymy restrykcyjne rozpoznają różne sekwencje DNA, więc użycie ich kombinacji może spowodować powstanie odrębnych fragmentów.
W przypadku odcisków palców DNA możemy następnie zbadać te fragmenty za pomocą techniki zwanej elektroforezą DNA lub elektroforezą żelową. Aby przygotować żele, sproszkowaną agarozę miesza się z buforem i podgrzewa do rozpuszczenia. Do ciepłej mieszaniny dodaje się następnie barwienie nukleotydowe, a następnie roztwór ten wlewa się do formy odlewniczej. Wkładany jest grzebień, aby uformować dołki. Po zestaleniu żel przenosi się do pudełka żelowego wypełnionego buforem, a grzebień jest usuwany. Do jednego dołka dodaje się mieszaninę referencyjną barwionych fragmentów DNA o znanej długości, drabinę DNA, a barwione próbki DNA będące przedmiotem zainteresowania są ładowane do pozostałych studzienek. Skrzynka jest podłączona do źródła zasilania, a włączenie zasilania indukuje migrację ujemnie naładowanych grup fosforanowych w nukleotydach DNA przez żel w kierunku anody, końca dodatniego. Mniejsze kawałki poruszają się szybciej niż większe fragmenty, które migrują z trudem.
Po zakończeniu cyklu żel jest wystawiany na działanie światła ultrafioletowego w celu uwidocznienia barwienia nukleotydów w próbkach DNA. Ich obecność można potwierdzić na podstawie ich względnego położenia w stosunku do taśm drabiny. Ponieważ DNA o różnych sekwencjach będzie miało miejsca cięcia w różnych miejscach, może to spowodować powstanie nowych wzorów prążków lub odcisków palców, które można wykorzystać do rozróżnienia osób lub wariantów profili DNA.
W tym laboratorium wykonasz ekstrakcje DNA przy użyciu buforu z SDS i bez, aby ocenić znaczenie detergentów w izolacji DNA, a następnie trawisz plazmidowe DNA za pomocą różnych enzymów restrykcyjnych w celu zbadania uzyskanych profili DNA.
Ekstrakcja DNA to usuwanie i oczyszczanie DNA z komórek. Po pierwsze, komórki są poddawane lizie - rozłupywane - zwykle poprzez połączenie fizycznego rozerwania i traktowania chemikaliami, takimi jak detergent, który rozpuszcza błony komórkowe i jądrowe. SDS lub dodecylosiarczan sodu jest powszechnie stosowanym detergentem, który działa poprzez rozpuszczanie białek i lipidów tworzących te błony. Zawartość może następnie swobodnie unosić się w otaczającym roztworze.
Następnie DNA musi zostać oddzielone od innych obecnych cząsteczek. Proteinaza K dodana do reakcji rozbije wiązania peptydowe i strawi białka zanieczyszczające. Następnie do próbki dodaje się sól, która stabilizuje ujemnie naładowane grupy fosforanowe w szkielecie DNA i po dodaniu lodowatego alkoholu wytrąca DNA z roztworu. Biały osad zbiera się przez odwirowanie go w wirówce, gdzie osiada na dnie probówki. Po umyciu i ponownym zawieszeniu w roztworze buforowym, wyekstrahowane DNA może być ostatecznie wykorzystane w badaniach lub zastosowaniach biotechnologicznych.
Niektóre zastosowania biotechnologiczne, takie jak odciski palców DNA, które mogą identyfikować nowe wzorce w DNA specyficzne dla danej osoby lub osób, obejmują stosowanie enzymów restrykcyjnych. Enzymy restrykcyjne to cząsteczki, które oddziałują z DNA i rozpoznają określone sekwencje. Po zidentyfikowaniu ich konkretnego miejsca przecinają DNA. Spowoduje to, że pasmo zostanie pocięte na jeden lub więcej liniowych kawałków. Jeśli wyekstrahowane DNA było plazmidem, okrągłym fragmentem DNA najczęściej występującym u bakterii, wszelkie cięcia spowodują, że DNA utworzy liniowy fragment lub fragmenty. Różne enzymy restrykcyjne rozpoznają różne sekwencje DNA, więc użycie ich kombinacji może spowodować powstanie odrębnych fragmentów.
W przypadku odcisków palców DNA możemy następnie zbadać te fragmenty za pomocą techniki zwanej elektroforezą DNA lub elektroforezą żelową. Aby przygotować żele, sproszkowaną agarozę miesza się z buforem i podgrzewa do rozpuszczenia. Do ciepłej mieszaniny dodaje się następnie barwienie nukleotydowe, a następnie roztwór ten wlewa się do formy odlewniczej. Wkładany jest grzebień, aby uformować dołki. Po zestaleniu żel przenosi się do pudełka żelowego wypełnionego buforem, a grzebień jest usuwany. Do jednego dołka dodaje się mieszaninę referencyjną barwionych fragmentów DNA o znanej długości, drabinę DNA, a barwione próbki DNA będące przedmiotem zainteresowania są ładowane do pozostałych studzienek. Skrzynka jest podłączona do źródła zasilania, a włączenie zasilania indukuje migrację ujemnie naładowanych grup fosforanowych w nukleotydach DNA przez żel w kierunku anody, końca dodatniego. Mniejsze kawałki poruszają się szybciej niż większe fragmenty, które migrują z trudem.
Po zakończeniu cyklu żel jest wystawiany na działanie światła ultrafioletowego w celu uwidocznienia barwienia nukleotydów w próbkach DNA. Ich obecność można potwierdzić na podstawie ich względnego położenia w stosunku do taśm drabiny. Ponieważ DNA o różnych sekwencjach będzie miało miejsca cięcia w różnych miejscach, może to spowodować powstanie nowych wzorów prążków lub odcisków palców, które można wykorzystać do rozróżnienia osób lub wariantów profili DNA.
W tym laboratorium wykonasz ekstrakcje DNA przy użyciu buforu z SDS i bez, aby ocenić znaczenie detergentów w izolacji DNA, a następnie trawisz plazmidowe DNA za pomocą różnych enzymów restrykcyjnych w celu zbadania uzyskanych profili DNA.
Q1: Why is SDS used during DNA extraction?
SDS, or sodium dodecyl sulfate, is a detergent that dissolves the lipids and proteins making up cell and nuclear membranes. By solubilizing these membrane components, SDS allows the cell contents, including DNA, to float freely into the surrounding solution, making DNA accessible for further purification steps.
Q2: What role does Proteinase K play in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that breaks down peptide bonds in proteins, digesting contaminating proteins like histones that bind to DNA. This separation is essential because DNA is tightly condensed around histone proteins inside the nucleus, and removing these proteins allows pure DNA to be recovered.
Q3: How does salt help precipitate DNA from solution?
Salt, typically sodium chloride, stabilizes DNA by allowing Na+ ions to bind to and integrate into the negatively charged phosphate groups in the DNA backbone. This causes DNA strands to clump together, making the precipitate visible and collectible by centrifugation.
Q4: What determines where restriction enzymes cut DNA?
Restriction enzymes recognize and cut DNA at specific nucleotide sequences, typically six to twelve nucleotides long and usually palindromic, meaning they read the same in both the 3'-5' and 5'-3' directions. Different restriction enzymes recognize different sequences, allowing researchers to produce distinct DNA fragments for analysis.
Q5: Why do smaller DNA fragments move faster through gel electrophoresis?
During gel electrophoresis, negatively charged DNA migrates toward the anode through the gel matrix. Smaller DNA fragments navigate the gel's pores more easily than larger fragments, which experience greater resistance and migrate with difficulty, causing size-based separation of DNA pieces.
Q6: How can restriction enzyme digestion create unique DNA fingerprints?
Because different DNA sequences have cut sites at different locations, digesting DNA with restriction enzymes produces novel band patterns specific to each individual's genetic profile. These unique patterns, visualized through gel electrophoresis, can distinguish individuals or variant DNA profiles for forensic and genetic analysis.
Q7: What happens to plasmid DNA when restriction enzymes cut it?
Plasmids are circular DNA molecules commonly found in bacteria. When restriction enzymes cut a plasmid at their recognition sites, the circular DNA becomes linear, forming one or more linear fragments. These fragments can then be isolated and ligated into vectors for bacterial transformation using plasmids procedure applications.