Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Odkrycie DNA jako cząsteczki dziedzicznej we wszystkich organizmach doprowadziło do ogromnych przełomów naukowych i medycznych oraz znacznie poszerzyło nasze zrozumienie nas samych i innych organizmów. Izolacja i profilowanie DNA były podstawowymi pierwszymi krokami dla wielu postępów w minionym stuleciu; Od identyfikacji funkcji genów po rewolucje w rolnictwie i kryminalistyce.
Izolacja DNA to dość prosta procedura, która wymaga kilku, ale niezbędnych kroków: zbierania komórek, lizy, degradacji białek i wreszcie wytrącania DNA. Ogólnie rzecz biorąc, DNA można pobrać z niewielkich ilości tkanki, takich jak pojedynczy liść rośliny, mieszki włosowe zwierząt lub komórki nabłonkowe, które można łatwo złuszczyć w jamie ustnej za pomocą prostego roztworu soli fizjologicznej. Ponieważ DNA jest podzielone na przedziały wewnątrz jądra lub mitochondriów w komórkach eukariotycznych, naukowcy najpierw rozbijają komórkę i błonę jądrową, aby odsłonić DNA, co odbywa się na etapie lizy. Jednak po wystawieniu DNA może zostać zdegradowane przez jony metali ciężkich i ekstremalne pH. Dlatego roztwór buforowy zawierający detergent służy nie tylko do rozpuszczenia błony komórkowej, ale także do ochrony DNA przed rozkładem pierwiastków w roztworze. Co więcej, DNA jest niezwykle długą cząsteczką, która jest skondensowana wewnątrz jądra poprzez ciasne upakowanie wokół specjalnych białek zwanych histonami. Dlatego dodaje się enzym zwany proteinazą K, który degraduje wiązania peptydowe białek, w celu oddzielenia DNA od histonów i innych białek. Następnie naukowcy oddzielają DNA od reszty ekstraktu komórkowego, wykorzystując jego właściwości chemiczne. Ze względu na ujemnie naładowaną strukturę kwasów nukleinowych, jony Na+ w roztworze chlorku sodu wiążą się i integrują ze splątanymi niciami DNA. Gdy DNA jest zlepione, można je zaobserwować gołym okiem. DNA jest nierozpuszczalne w alkoholu i łatwo wytrąca się w niskich temperaturach, dlatego naukowcy dodają zimny alkohol, aby wytrącić DNA. Wreszcie, wytrącone DNA można rozpuścić i przechowywać w dejonizowanej wodzie lub łagodnym buforze, wolnym od jakichkolwiek enzymów, które mogą rozkładać kwasy nukleinowe, dopóki nie zostanie użyte.
Reakcje z wykorzystaniem DNA często wymagają wysokiej czystości i precyzyjnych ilości DNA. Dlatego po izolacji DNA naukowcy używają spektrofotometru do ilościowego określenia ilości DNA w próbce, a także czystości DNA w próbce. Spektrofotometr mierzy natężenie wiązki światła przechodzącej przez próbkę w funkcji jej długości fali. Kwasy nukleinowe pochłaniają światło przy 260 nm, podczas gdy białka pochłaniają światło przy 280 nm. Mierząc intensywność wiązki światła o długości fali 260 nm, naukowcy mogą określić stężenie DNA. Ponadto, oceniając natężenie światła zarówno przy 260 nm, jak i 280 nm, można określić czystość zawartości DNA. W próbce czystego DNA stosunek 260/280 nm powinien zbliżać się do wartości 2.
W przypadku wielu analiz, takich jak klonowanie, sekwencjonowanie i mapowanie fragmentów i genomów DNA, wyizolowane DNA musi zostać przecięte w określonych sekwencjach przy użyciu enzymów restrykcyjnych. Enzymy te są wytwarzane przez bakterie jako mechanizmy wrodzonej odporności na intruzję wirusowego DNA i działają jak nożyczki molekularne. W związku z tym, po tym, jak enzymy restrykcyjne zidentyfikują DNA wirusa, zaczynają je rozbijać, dzieląc je na segmenty w określonych sekwencjach nukleotydowych, które rozpoznają. Te sekwencje nukleotydowe mają często od sześciu do dwunastu nukleotydów i są na ogół palindromiczne, co oznacza, że mają tę samą sekwencję nukleotydów w kierunkach 3'-5' i 5'-3'. Na przykład enzym restrykcyjny EcoRI tnie DNA w sekwencji 3'... GAATTC...-5', który czyta się tak samo w kierunku 5'-3'. Podobnie jak EcoRI, istnieją setki enzymów, które odpowiadają wielu różnym sekwencjom palindromicznym. Gdy DNA zostanie przecięte przez te enzymy, naukowcy mogą załadować DNA na żel w komorze elektroforetycznej i przepuścić prąd elektryczny przez żel. DNA przenosi ładunki ujemne, co powoduje migrację fragmentów DNA w kierunku anody. Jednak pory żelu spowalniają większe fragmenty DNA w stosunku do mniejszych sekwencji DNA, dzięki czemu kawałki rozdzielają się w zależności od ich wielkości. Po zakończeniu elektroforezy fragmenty DNA można uwidocznić za pomocą barwników, które specyficznie wiążą się z cząsteczkami DNA.
Cięcie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i oddzielanie fragmentów DNA za pomocą elektroforezy pozwala naukowcom zidentyfikować rozmiary nieznanych fragmentów w stosunku do standardowej drabiny. Te interesujące fragmenty mogą być następnie dalej izolowane i ligowane do wektora plazmidowego w celu klonowania genetycznego. Dzięki tym metodom inżynieria genetyczna i analizy laboratoryjne zostały znacznie ulepszone. Dzięki profilowaniu DNA naukowcy są w stanie sekwencjonować genomy, aby lepiej zrozumieć działanie organizmów, a także są w stanie zidentyfikować i scharakteryzować niektóre geny1.
Izolacja i profilowanie DNA są również praktyczne w przypadku wydarzeń mających bezpośredni wpływ na życie codzienne. Na przykład naukowcy zajmujący się kryminalistyką rutynowo analizują próbki DNA, aby dostarczyć dowodów w sprawach karnych i cywilnych2. Podobnie pracownicy służby zdrowia pobierają i analizują DNA, aby sprawdzić ojcostwo i choroby genetyczne. Ostatnio zestawy do analizy pochodzenia DNA stały się popularne, umożliwiając użytkownikom określenie ich linii genetycznej, znalezienie krewnych, a nawet odkrycie ich genetycznej predyspozycji do różnych schorzeń3. Wreszcie, wraz z postępem w biotechnologii i inżynierii genetycznej, medycyna spersonalizowana zyskuje na popularności wśród badaczy klinicznych w celu opracowania terapii z wykorzystaniem indywidualnych danych genetycznych, torując drogę do skutecznego leczenia pacjentów bez szkodliwych skutków ubocznych4.
Ekstrakcja DNA to usuwanie i oczyszczanie DNA z komórek. Po pierwsze, komórki są poddawane lizie - rozłupywane - zwykle poprzez połączenie fizycznego rozerwania i traktowania chemikaliami, takimi jak detergent, który rozpuszcza błony komórkowe i jądrowe. SDS lub dodecylosiarczan sodu jest powszechnie stosowanym detergentem, który działa poprzez rozpuszczanie białek i lipidów tworzących te błony. Zawartość może następnie swobodnie unosić się w otaczającym roztworze.
Następnie DNA musi zostać oddzielone od innych obecnych cząsteczek. Proteinaza K dodana do reakcji rozbije wiązania peptydowe i strawi białka zanieczyszczające. Następnie do próbki dodaje się sól, która stabilizuje ujemnie naładowane grupy fosforanowe w szkielecie DNA i po dodaniu lodowatego alkoholu wytrąca DNA z roztworu. Biały osad zbiera się przez odwirowanie go w wirówce, gdzie osiada na dnie probówki. Po umyciu i ponownym zawieszeniu w roztworze buforowym, wyekstrahowane DNA może być ostatecznie wykorzystane w badaniach lub zastosowaniach biotechnologicznych.
Niektóre zastosowania biotechnologiczne, takie jak odciski palców DNA, które mogą identyfikować nowe wzorce w DNA specyficzne dla danej osoby lub osób, obejmują stosowanie enzymów restrykcyjnych. Enzymy restrykcyjne to cząsteczki, które oddziałują z DNA i rozpoznają określone sekwencje. Po zidentyfikowaniu ich konkretnego miejsca przecinają DNA. Spowoduje to, że pasmo zostanie pocięte na jeden lub więcej liniowych kawałków. Jeśli wyekstrahowane DNA było plazmidem, okrągłym fragmentem DNA najczęściej występującym u bakterii, wszelkie cięcia spowodują, że DNA utworzy liniowy fragment lub fragmenty. Różne enzymy restrykcyjne rozpoznają różne sekwencje DNA, więc użycie ich kombinacji może spowodować powstanie odrębnych fragmentów.
W przypadku odcisków palców DNA możemy następnie zbadać te fragmenty za pomocą techniki zwanej elektroforezą DNA lub elektroforezą żelową. Aby przygotować żele, sproszkowaną agarozę miesza się z buforem i podgrzewa do rozpuszczenia. Do ciepłej mieszaniny dodaje się następnie barwienie nukleotydowe, a następnie roztwór ten wlewa się do formy odlewniczej. Wkładany jest grzebień, aby uformować dołki. Po zestaleniu żel przenosi się do pudełka żelowego wypełnionego buforem, a grzebień jest usuwany. Do jednego dołka dodaje się mieszaninę referencyjną barwionych fragmentów DNA o znanej długości, drabinę DNA, a barwione próbki DNA będące przedmiotem zainteresowania są ładowane do pozostałych studzienek. Skrzynka jest podłączona do źródła zasilania, a włączenie zasilania indukuje migrację ujemnie naładowanych grup fosforanowych w nukleotydach DNA przez żel w kierunku anody, końca dodatniego. Mniejsze kawałki poruszają się szybciej niż większe fragmenty, które migrują z trudem.
Po zakończeniu cyklu żel jest wystawiany na działanie światła ultrafioletowego w celu uwidocznienia barwienia nukleotydów w próbkach DNA. Ich obecność można potwierdzić na podstawie ich względnego położenia w stosunku do taśm drabiny. Ponieważ DNA o różnych sekwencjach będzie miało miejsca cięcia w różnych miejscach, może to spowodować powstanie nowych wzorów prążków lub odcisków palców, które można wykorzystać do rozróżnienia osób lub wariantów profili DNA.
W tym laboratorium wykonasz ekstrakcje DNA przy użyciu buforu z SDS i bez, aby ocenić znaczenie detergentów w izolacji DNA, a następnie trawisz plazmidowe DNA za pomocą różnych enzymów restrykcyjnych w celu zbadania uzyskanych profili DNA.
