15.12: CRISPR

Technologie edycji genomu umożliwiają naukowcom modyfikowanie DNA organizmu poprzez dodawanie, usuwanie lub rearanżację materiału genetycznego w określonych lokalizacjach genomu. Tego typu techniki można potencjalnie zastosować w leczeniu chorób genetycznych, takich jak hemofilia i anemia sierpowatokrwinkowa. Jednym z popularnych i szeroko stosowanych narzędzi badawczych do edycji DNA, które może prowadzić do bezpiecznych i skutecznych leków na choroby genetyczne, jest system CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 oznacza Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats i białko 9 związane z CRISPR. Podstawowy system CRISPR-Cas9 składa się z endonukleazy Cas9 i małego RNA, który kieruje Cas9 do docelowego DNA.

Pochodzenie

Sekwencje CRISPR po raz pierwszy zaobserwowano u bakterii, a później zidentyfikowano u archeonów. Naukowcy odkryli, że system CRISPR-Cas9 zapewnia adaptacyjną obronę immunologiczną przed inwazją wirusów. Wiele bakterii i większość archeonów wychwytuje krótkie sekwencje wirusowego DNA, tworząc bibliotekę segmentów DNA wirusa, czyli macierze CRISPR. Kiedy prokarioty są ponownie wystawione na działanie tego samego wirusa lub klasy wirusów, do transkrypcji małych segmentów RNA stosuje się macierze CRISPR, które pomagają rozpoznać wirusowych najeźdźców, a następnie zniszczyć wirusowy DNA za pomocą Cas9 lub podobnej endonukleazy.

Korzystanie z technologii CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 jest powszechnie stosowany w laboratorium do usuwania DNA i wstawiania w jego miejsce nowej sekwencji DNA. Aby to osiągnąć, badacze muszą najpierw stworzyć mały fragment RNA zwany RNA kierującym, z krótką sekwencją zwaną sekwencją kierującą, która wiąże się z określoną sekwencją docelową w genomowym DNA. Przewodnik RNA może również łączyć się z Cas9 (lub innymi endonukleazami, takimi jak Cpf1). Kierujący RNA i białko Cas9 podaje się do interesującej komórki, gdzie kierujący RNA identyfikuje docelową sekwencję DNA, a Cas9 ją rozcina.

Maszyna komórkowa naprawia następnie uszkodzone nici poprzez wstawienie lub usunięcie losowych nukleotydów, czyniąc docelowy gen nieaktywnym. Alternatywnie, do komórki można wprowadzić dostosowaną sekwencję DNA wraz z kierującym RNA i Cas9, która służy jako matryca dla mechanizmu naprawczego i zastępuje wyciętą sekwencję. Jest to dla badaczy bardzo skuteczny sposób “wybijania“ genu w celu zbadania jego skutków lub zastąpienia zmutowanego genu normalną kopią w nadziei na wyleczenie choroby.

Rozważania etyczne i wykonalności u ludzi

W wyniku znaczących możliwości modyfikacji genów systemu CRISPR-Cas9 toczyła się wielka debata na temat jego zastosowania, szczególnie w odniesieniu do edycji zarodków. Chiński naukowiec oświadczył niedawno, że stworzył dzieci ze zmodyfikowanym genomem przy użyciu technologii CRISPR w celu wyłączenia genu odpowiedzialnego za zakażenie wirusem HIV. Doprowadziło to do ogólnoświatowego protestu naukowców zaniepokojonych względami etycznymi i bezpieczeństwem procedury. Wielu określiło to posunięcie jako przedwczesne, a inni wyrazili obawy związane z efektami genomicznymi odbiegającymi od docelowych. Chociaż liczba możliwych zastosowań biotechnologicznych systemu CRISPR-Cas9 jest duża, ważne jest, aby wziąć pod uwagę przyszłe wyzwania, które mogą pojawić się w wyniku jego wykorzystania.

System CRISPR-Cas9 to narzędzie do edycji DNA, które oznacza Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats i CRISPR Associated Protein 9.

Po raz pierwszy zaobserwowany u bakterii, CRISPR-Cas9 jest środkiem obrony przed wirusami. Gdy obce wirusowe DNA dostaje się do bakterii, jest przetwarzane na mniejsze fragmenty, które mogą zostać wstawione do regionu genomu bakteryjnego zwanego CRISPR Locus.

Kiedy region jest transkrybowany, produkt łączy się z mniejszymi RNA zwanymi tracrRNA, które mogą pomóc w orientacji zarówno białka Cas9, jak i RNAzy na cząsteczkę. Ten ostatni z nich rozszczepia transkrypcję.

Efektem końcowym jest kilka kompleksów, z których każdy składa się z białka Cas9, tracrRNA i crRNA pochodzącego z DNA w Locus. RNA CRISPR w tych strukturach rozpoznaje i prowadzi Cas9 do wirusowego DNA, które jest następnie rozszczepiane i niszczone.

Naukowcy wykorzystują CRISPR-Cas9 poprzez syntezę pojedynczych cząsteczek RNA, które naśladują tracrRNA i CRISPR RNA, które mogą celować w interesujący gen. Na przykład, gdy dwa takie przewodnikowe RNA są wprowadzane do komórek z Cas9 i oba celują w ten sam gen, sekwencja może zostać wycięta.

Po usunięciu tego obszaru docelowego odcięte końce są ponownie łączone i obserwuje się wpływ na komórki.

W ten sposób system CRISPR-Cas9 jest modyfikowany na podstawie mechanizmu bakteryjnego. I może być stosowany do szeregu technik edycji genów.