Uzupełniające DNA

Przegląd

Tylko geny, które ulegają transkrypcji do informacyjnego RNA (mRNA), są aktywne lub ulegają ekspresji. Naukowcy mogą zatem wyodrębnić mRNA z komórek, aby zbadać ekspresję genów w różnych komórkach i tkankach. Naukowiec przekształca mRNA w komplementarny DNA (cDNA) poprzez odwrotną transkrypcję. Ponieważ mRNA nie zawiera intronów (regionów niekodujących) i innych sekwencji regulacyjnych, cDNA — w przeciwieństwie do genomowego DNA — umożliwia także badaczom bezpośrednie określenie sekwencji aminokwasów peptydu kodowanego przez gen.

Synteza cDNA

cDNA można wytworzyć kilkoma metodami, ale powszechnym sposobem jest najpierw ekstrakcja całkowitego RNA z komórek, a następnie izolacja mRNA z bardziej dominujących typów — RNA transferowego (tRNA) i rybosomalnego (rRNA). Dojrzały eukariotyczny mRNA ma ogon poli(A) — ciąg nukleotydów adeninowych — dodany do jego końca 3’ koniec, podczas gdy inne typy RNA nie. Dlatego ciąg nukleotydów tyminowych (oligo-dT) można przyłączyć do podłoża, takiego jak kolumna lub kulki magnetyczne, w celu specyficznego sparowania zasad z ogonami poli(A) mRNA. Podczas wychwytywania mRNA z ogonem poli(A) inne typy RNA są wypłukane.

Następnie do wytworzenia cDNA z mRNA wykorzystuje się odwrotną transkryptazę — enzym polimerazę DNA z retrowirusów. Ponieważ, podobnie jak większość polimeraz DNA, odwrotna transkryptaza może dodawać nukleotydy tylko do 3’ końcu łańcucha, dodaje się starter poli(T), aby związać się z ogonem poli(A) i zapewnić punkt wyjścia do syntezy cDNA. Nić cDNA kończy się pętlą typu spinka do włosów. RNA jest następnie degradowany — zwykle poprzez działanie alkaliami lub enzymami RNazy — pozostawiając jednoniciowy cDNA nienaruszony.

Druga nić DNA komplementarna do cDNA jest następnie syntetyzowana przez polimerazę DNA — często wykorzystując jako starter pętlę w kształcie spinki do włosów pierwszej nici cDNA lub nacięty fragment mRNA.

Powstały dwuniciowy cDNA można wstawić do wektorów bakteryjnych lub wirusowych i sklonować przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Bibliotekę cDNA—reprezentującą wszystkie mRNA w komórkach lub tkankach będących przedmiotem zainteresowania—można również skonstruować na potrzeby dodatkowych badań.