15.13
Prawie każda komórka w ciele ma to samo DNA, ale różne typy komórek, takie jak neurony i komórki mięśniowe, wyrażają różne geny, ponieważ tylko niektóre geny są transkrybowane na informacyjny RNA lub mRNA w każdej komórce. W laboratorium mRNA można wykorzystać jako matrycę do syntezy komplementarnego DNA, cDNA, do badania ekspresji genów. Powszechną metodą jest ekstrakcja RNA z komórek, a następnie wyizolowanie mRNA z innych typów RNA, takich jak rybosomalny RNA lub transfer RNA, poprzez przeciągnięcie próbki przez kolumnę kulek z przyłączonymi odcinkami nukleotydów tyminy.
Wiążą się one z ogonem poli-A, łańcuchem nukleotydów adeninowych specyficznie obecnych na 3-pierwszych końcach eukariotycznego mRNA. Inne typy RNA nie wiążą się i są wypłukiwane.
Po wyizolowaniu mRNA starter poli-T jest wiązany z ogonem poli-A, zapewniając punkt wyjścia dla enzymów odwrotnej transkryptazy do transkrypcji jednoniciowego cDNA z mRNA. Substancje chemiczne, takie jak enzymy RNazy, są następnie dodawane w celu degradacji RNA.
Enzymy polimerazy DNA są następnie wykorzystywane do syntezy nici komplementarnej do cDNA, w wyniku czego powstaje dwuniciowe cDNA, które można wprowadzić do wektora bakteryjnego lub wirusowego i wykorzystać w badaniach biologii molekularnej.
Tylko geny, które ulegają transkrypcji do informacyjnego RNA (mRNA), są aktywne lub ulegają ekspresji. Naukowcy mogą zatem wyodrębnić mRNA z komórek, aby zbadać ekspresję genów w różnych komórkach i tkankach. Naukowiec przekształca mRNA w komplementarny DNA (cDNA) poprzez odwrotną transkrypcję. Ponieważ mRNA nie zawiera intronów (regionów niekodujących) i innych sekwencji regulacyjnych, cDNA — w przeciwieństwie do genomowego DNA — umożliwia także badaczom bezpośrednie określenie sekwencji aminokwasów peptydu kodowanego przez gen.
cDNA można wytworzyć kilkoma metodami, ale powszechnym sposobem jest najpierw ekstrakcja całkowitego RNA z komórek, a następnie izolacja mRNA z bardziej dominujących typów — RNA transferowego (tRNA) i rybosomalnego (rRNA). Dojrzały eukariotyczny mRNA ma ogon poli(A) — ciąg nukleotydów adeninowych — dodany do jego końca 3’ koniec, podczas gdy inne typy RNA nie. Dlatego ciąg nukleotydów tyminowych (oligo-dT) można przyłączyć do podłoża, takiego jak kolumna lub kulki magnetyczne, w celu specyficznego sparowania zasad z ogonami poli(A) mRNA. Podczas wychwytywania mRNA z ogonem poli(A) inne typy RNA są wypłukane.
Następnie do wytworzenia cDNA z mRNA wykorzystuje się odwrotną transkryptazę — enzym polimerazę DNA z retrowirusów. Ponieważ, podobnie jak większość polimeraz DNA, odwrotna transkryptaza może dodawać nukleotydy tylko do 3’ końcu łańcucha, dodaje się starter poli(T), aby związać się z ogonem poli(A) i zapewnić punkt wyjścia do syntezy cDNA. Nić cDNA kończy się pętlą typu spinka do włosów. RNA jest następnie degradowany — zwykle poprzez działanie alkaliami lub enzymami RNazy — pozostawiając jednoniciowy cDNA nienaruszony.
Druga nić DNA komplementarna do cDNA jest następnie syntetyzowana przez polimerazę DNA — często wykorzystując jako starter pętlę w kształcie spinki do włosów pierwszej nici cDNA lub nacięty fragment mRNA.
Powstały dwuniciowy cDNA można wstawić do wektorów bakteryjnych lub wirusowych i sklonować przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Bibliotekę cDNA—reprezentującą wszystkie mRNA w komórkach lub tkankach będących przedmiotem zainteresowania—można również skonstruować na potrzeby dodatkowych badań.
Prawie każda komórka w ciele ma to samo DNA, ale różne typy komórek, takie jak neurony i komórki mięśniowe, wyrażają różne geny, ponieważ tylko niektóre geny są transkrybowane na informacyjny RNA lub mRNA w każdej komórce. W laboratorium mRNA można wykorzystać jako matrycę do syntezy komplementarnego DNA, cDNA, do badania ekspresji genów. Powszechną metodą jest ekstrakcja RNA z komórek, a następnie wyizolowanie mRNA z innych typów RNA, takich jak rybosomalny RNA lub transfer RNA, poprzez przeciągnięcie próbki przez kolumnę kulek z przyłączonymi odcinkami nukleotydów tyminy.
Wiążą się one z ogonem poli-A, łańcuchem nukleotydów adeninowych specyficznie obecnych na 3-pierwszych końcach eukariotycznego mRNA. Inne typy RNA nie wiążą się i są wypłukiwane.
Po wyizolowaniu mRNA starter poli-T jest wiązany z ogonem poli-A, zapewniając punkt wyjścia dla enzymów odwrotnej transkryptazy do transkrypcji jednoniciowego cDNA z mRNA. Substancje chemiczne, takie jak enzymy RNazy, są następnie dodawane w celu degradacji RNA.
Enzymy polimerazy DNA są następnie wykorzystywane do syntezy nici komplementarnej do cDNA, w wyniku czego powstaje dwuniciowe cDNA, które można wprowadzić do wektora bakteryjnego lub wirusowego i wykorzystać w badaniach biologii molekularnej.
From Chapter 15:
Now Playing
Biotechnology
28.3K Views
Biotechnology
72.8K Views
Biotechnology
49.7K Views
Biotechnology
93.7K Views
Biotechnology
30.1K Views
Biotechnology
28.3K Views
Biotechnology
26.3K Views
Biotechnology
23.4K Views
Biotechnology
15.3K Views
Biotechnology
179.6K Views
Biotechnology
23.0K Views
Biotechnology
29.0K Views
Biotechnology
49.1K Views
Biotechnology
194.7K Views
Biotechnology
38.0K Views