Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Źródło: Smaa Koraym z Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa, MD, USA
W pierwszej części tego eksperymentu przygotujesz roztwór fosforanu sodu buforowany o pH 7,0. Fosforan monosodowy jest słabym kwasem ze sprzężoną zasadą, fosforanem disodowym. Niedostosowane roztwory fosforanu monosodowego mają zwykle pH około 4 - 6.
są najbardziej skuteczne w pobliżu ich pKa, które wynosi 6,8 do 7,2 dla fosforanu sodu. Tak więc użyjesz NaOH, aby popchnąć równowagę w kierunku sprzężonej zasady bez zmiany ogólnego składu równowagi buforowej.
| Masa molowa NaH2PO4 = 119.98 g/mol | |
| Objętość roztworu (ml) | 200 |
| Molarność (mM) | 50 |
| Mole NaH2PO4 (mol) | |
| Potrzebna masa (mg) | |
| Początkowa objętość 1 M NaOH (ml) | |
| Końcowa objętość 1 M NaOH (ml) | |
| Objętość użytego NaOH (ml) | |
| Potrzebna objętość wody DI (ml) | |
mogą być używane do oceny związków przy określonych wartościach pH. W tej sekcji zarejestrujesz widmo absorbancji wskaźnika neutralnego czerwonego w różnych. Protonowana forma neutralnej czerwieni jest czerwona, a forma zdeprotonowana jest żółto-pomarańczowa, co oznacza, że pochłaniają odpowiednio światło zielone i niebiesko-fioletowe. Tak więc formy kwaśne i zasadowe mają różne długości fal absorpcyjnych. Wiązanie białek zmienia właściwości neutralnej czerwieni, zmieniając zarówno jej absorbancję, jak i pKa.
Po zmierzeniu widma absorbancji wolnej neutralnej czerwieni przy kilku wartościach pH, dodasz do roztworów białko wiążące ryboflawinę lub RP i ponownie zmierzysz absorbancję. Intensywność absorbancji jest związana ze stężeniem, więc po laboratorium użyjesz widm do określenia pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni
.| Kuweta # | pH buforu | Abs. at λmax (Free NRH+) | Abs. at λmax (Bound NRH) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | puste |
Przeanalizujmy teraz nasze dane dotyczące absorbancji, aby określić pKa neutralnej czerwieni.
| Bezpłatny NRH+ | Związany NRH+ | |
| λmaks. (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Punkt środkowy (nm) | ||
| pKa |
Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 3
W pierwszej części tego eksperymentu przygotujesz roztwór fosforanu sodu buforowany o pH 7,0. Fosforan monosodowy jest słabym kwasem ze sprzężoną zasadą fosforanu disodowego. Niedostosowane roztwory fosforanu monosodowego mają zwykle pH około 4 do 6.
Bufory są najbardziej skuteczne w pobliżu ich pKa, które wynosi 6,8 do 7,2 dla fosforanu sodu. Tak więc użyjesz wodorotlenku sodu, aby popchnąć równowagę w kierunku sprzężonej zasady bez zmiany ogólnego składu równowagi buforowej. Przed rozpoczęciem laboratorium oblicz masę fosforanu monosodowego, która będzie potrzebna do przygotowania 200 mililitrów 50-milimolowego roztworu.
W tej części laboratorium wykorzystuje się wodorotlenek sodu, który jest żrący i toksyczny. Zachowaj ostrożność podczas nalewania i transportu wodorotlenku sodu. A teraz zacznijmy.
Najpierw załóż fartuch laboratoryjny, odporne na zachlapanie okulary ochronne i rękawice nitrylowe. Następnie napełnij 250-mililitrową plastikową butelkę do mycia wodą dejonizowaną. Oznaczyć dwie 100-mililitrowe zlewki odpowiednio dla neutralnych i zasadowych odpadów wodnych.
Następnie skalibruj pH-metr za pomocą dostarczonych buforów. Po zakończeniu przechowuj sondę w roztworze do przechowywania. Teraz przynieś 400-mililitrową zlewkę do obszaru wagi analitycznej, aby uzyskać potrzebny fosforan monosodowy.
Wytaruj kawałek papieru do ważenia i użyj czystej szpatułki, aby odmierzyć wymaganą ilość fosforanu sodu zgodnie z własnymi obliczeniami. Fosforan sodowy pochłania wilgoć z powietrza, więc pracuj szybko, aby uzyskać dokładny pomiar i szczelnie zamknij pojemnik, gdy skończysz. Zapisz dokładną ilość odmierzonego fosforanu sodu w zeszycie laboratoryjnym.
Następnie umieść fosforan sodowy w zlewce i wyczyść szpatułkę chusteczką laboratoryjną. Wyrzuć papier wagowy i chusteczkę laboratoryjną przed powrotem do dygestorium. Teraz użyj cylindra z podziałką, aby odmierzyć 175 mililitrów wody dejonizowanej.
Wlej wodę do zlewki z fosforanem sodu i dodaj mieszadło magnetyczne. Mieszać roztwór na płytce mieszającej, aż sól całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie wyglądał na jednorodny. Zwykle zajmuje to od dwóch do trzech minut.
Następnie odmierz 15 mililitrów wody dejonizowanej za pomocą cylindra z podziałką. Wlej zdejonizowaną wodę do zlewki i kontynuuj mieszanie roztworu, aż znów stanie się jednorodny, co zwykle zajmuje od jednej do dwóch minut. Następnie wyłącz silnik mieszający.
Przepłucz sondę pH wodą dejonizowaną, a następnie zaciśnij ją w roztworze za pomocą czujnika znajdującego się nad mieszadłem. Teraz przynieś 10-mililitrowy cylinder z podziałką i szkiełko zegarkowe do okapu dozującego i odmierz 10 mililitrów 1 molowego wodorotlenku sodu. Przykryj wodorotlenek sodu szkiełkiem zegarka i ostrożnie przynieś go do okapu wyciągowego.
Zanotuj dokładną objętość w cylindrze z podziałką. Następnie wznowić mieszanie roztworu fosforanu monosodowego. Monitorując odczyt pH, użyj jednorazowej pipety, aby powoli dodawać wodorotlenek sodu do roztworu mieszającego w kroplach.
Gdy pH buforu osiągnie wartość 7,0, włóż wodorotlenek sodu znajdujący się jeszcze w pipecie do cylindra z podziałką. Następnie oblicz objętość wodorotlenku sodu, który dodałeś z początkowej i końcowej objętości w cylindrze z podziałką. Odejmij tę objętość od 10 mililitrów, aby określić, ile wody dejonizowanej należy dodać do buforu, aby osiągnąć całkowitą objętość roztworu wynoszącą 200 mililitrów.
Odmierz potrzebną wodę dejonizowaną za pomocą innego 10-mililitrowego cylindra z podziałką i dodaj ją do roztworu mieszającego, aby zakończyć tworzenie buforu. Wypłucz czujnik pH wodą dejonizowaną, przykryj go nakrętką wypełnioną roztworem do przechowywania, a następnie odłącz lub wyłącz sondę. Następnie oznacz 250-mililitrową butelkę polietylenową jako 50-milimolowy bufor fosforanu monosodowego, pH 7,0'Użyj kleszczy, aby wyjąć mieszadło magnetyczne z roztworu.
Następnie umieść lejek w otworze butelki i wlej roztwór buforowy do butelki. Wyjmij lejek i szczelnie zakręć butelkę. Jesteś teraz gotowy, aby przejść do sekcji spektroskopii absorpcyjnej.
Bufory mogą być używane do oceny związków przy określonych wartościach pH. W tej sekcji zarejestrujesz widmo absorbancji wskaźnika neutralnego czerwonego w różnych buforach. Protonowana forma neutralnej czerwieni jest czerwona, a forma zdeprotonowana jest żółto-pomarańczowa, co oznacza, że pochłaniają odpowiednio światło zielone i niebiesko-fioletowe.
Tak więc formy kwaśne i zasadowe mają różne długości fal absorpcyjnych. Wiązanie białek zmienia właściwości neutralnej czerwieni, zmieniając zarówno jej absorbancję, jak i pKa. Po zmierzeniu widma absorbancji wolnej neutralnej czerwieni przy kilku wartościach pH, dodasz do roztworów białko wiążące ryboflawinę lub RP i ponownie zmierzysz absorbancję.
Intensywność absorbancji jest związana ze stężeniem, więc po laboratorium użyjesz widm do określenia pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni. Przed rozpoczęciem tej sekcji narysuj tabelę w zeszycie laboratoryjnym, zawierającą numer kuwety, pH buforu, absorbancję na poziomie lambda max dla wolnej protonowanej czerwieni neutralnej i absorbancję na poziomie lambda max dla związanej protonowanej czerwieni neutralnej. Ponumeruj kuwety od 1 do 10 i wymień dziewięć wartości pH buforu, których będziesz używać.
Dziesiąta kuweta będzie ślepym zbiornikiem na wodę dejonizowaną. Zawsze trzymaj kuwety za teksturowane boki i wytrzyj przezroczyste boki tuż przed włożeniem kuwety do spektrofotometru. Pamiętaj, aby wyrównać przezroczyste boki z wiązką światła w spektrofotometrze.
A teraz zacznijmy. Zdobądź dziesięć 1,5-mililitrowych kuwet i nakrętek i oznacz je od 1 do 10, aby pasowały do tabeli w notatniku laboratoryjnym. Oznacz 25-mililitrową zlewkę jako DIH2O'i napełnij ją wodą dejonizowaną.
Następnie spłucz neutralne odpady wodne do odpływu i ponownie oznacz zlewkę jako wodne odpady buforowe"Oznacz również 400-mililitrową zlewkę na zużyte końcówki do mikropipet. Następnie przymocuj końcówkę do mikropipety o pojemności 1 mililitra i użyj jej do dozowania 1000 mikrolitrów wody dejonizowanej do kuwety 10. To będzie twój ślepy półfabrykat rozpuszczalnika.
Teraz wysuń końcówkę, ustaw mikropipetę na dozowanie 925 mikrolitrów i załóż nową końcówkę. Umieść 925 mikrolitrów buforu fosforanu monosodowego o pH 7,0 w kuwecie piątej. Wysuń końcówkę i zakryj kuwetę.
Następnie przenieś pozostałe puste kuwety do stołu buforowego. Kierując się tabelą w zeszycie laboratoryjnym, dozuj 925 mikrolitrów każdego buforu do odpowiedniej kuwety za pomocą oznaczonych mikropipet. Należy uważać, aby nie używać tej samej końcówki pipety do różnych buforów.
Po zakończeniu przenieś bufory z powrotem do stołu roboczego. Tam ustaw mikropipetę o pojemności 200 mikrolitrów, aby dozować 75 mikrolitrów i przymocuj końcówkę do mikropipety. Teraz zdobądź fiolkę lub probówkę z neutralnym czerwonym roztworem, którą można podzielić się z inną grupą uczniów.
Dozuj 75 mikrolitrów neutralnej czerwieni do każdej z dziewięciu kuwet buforowych. Wymień końcówkę pipety, jeśli dotyka bufora. Po zakończeniu wysuń końcówkę pipety i zakryj kuwety.
Teraz odwróć każdą kuwetę kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwory. Po zmieszaniu neutralnej czerwieni z każdym buforem zrób zdjęcie lub zapisz kolory roztworów. Następnie włącz ręczny spektrofotometr i poczekaj, aż źródło światła się rozgrzeje.
Gdy będzie gotowy, utwórz nowy eksperyment, aby zmierzyć absorbancję w funkcji długości fali dla wolnej neutralnej czerwieni. Następnie włóż kuwetę z wodą dejonizowaną. Uzyskaj widmo wody dejonizowanej i ustaw je jako tło rozpuszczalnika lub ślepą próbę.
Następnie wyjmij ślepą próbę ze spektrofotometru i włóż kuwetę czerwieni obojętnej do buforu o najniższym pH, który będzie miał najwyższe stężenie protonowanej czerwieni obojętnej. Zdobądź widmo, które powinno pokazywać jeden silny pik. Zidentyfikuj długość fali odpowiadającą najwyższemu punktowi tego piku lub maksimum.
Zapisz tę długość fali w notatniku laboratoryjnym jako lambda max dla protonowanej wolnej neutralnej czerwieni. Zapisz dane i wyjmij kuwetę. Zapisz absorbancję w notatniku, a następnie zbierz widma dla kuwet od 2 do 9, korzystając z tej samej procedury.
Wszystkie widma powinny przecinać się w jednym punkcie, zwanym punktem izobestycznym. Zapisz długość fali tego punktu w notatniku laboratoryjnym. Jeśli widmo nie przecina się w tym punkcie, opróżnij i wyczyść kuwetę, przygotuj nową próbkę i spróbuj ponownie.
Po zakończeniu zbierania widm dla wszystkich 9 kuwet zapisz i wyeksportuj dane. Następnie utwórz nowy eksperyment, aby zmierzyć absorbancję w funkcji długości fali dla związanej neutralnej czerwieni. Dopasuj nową końcówkę do mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów i uzyskaj wspólny pojemnik z białkiem wiążącym ryboflawinę.
Dodaj 75 mikrolitrów roztworu białka wiążącego ryboflawinę do każdej kuwety, w tym do ślepej próby. Wysuń końcówkę, zabezpiecz nasadki kuwety i kilkakrotnie odwróć kuwetę, aby wymieszać roztwory. Teraz włóż kuwetę 10 do spektrofotometru i ustaw ją jako ślepą próbę rozpuszczalnika.
Następnie należy pobrać widmo próbki o najniższym pH i określić długość fali odpowiadającą maksimum najintensywniejszego piku. Zapisz to w swoim notatniku laboratoryjnym jako maksimum lambda neutralnej czerwieni związanej z protonem. Następnie uzyskaj widma dla kuwet od 2 do 9 w taki sam sposób, jak w przypadku bezpłatnych próbek neutralnej czerwieni.
Zapisz w tabeli intensywność przy lambda max dla neutralnej czerwieni związanej z protonem, wraz z długością fali w punkcie izobestycznym. Kiedy skończysz, zapisz dane, wyeksportuj je do późniejszej analizy i wyłącz spektrofotometr. Odłóż mikropipety, pudełka na końcówki, pH-metr i spektrofotometr.
Zużyte końcówki do pipet należy wyrzucić do zatwierdzonego pojemnika na odpady lub kosza na śmieci. Teraz opróżnij kuwety do wodnej zlewki buforowej na odpady i przepłucz kuwety do zlewki wodą dejonizowaną. W dygestorium opróżnij nadmiar wodorotlenku sodu do podstawowych odpadów i przepłucz butlę z podziałką wodą.
Podstawowe odpady wodne należy spłukać do kanalizacji dużą ilością wody z kranu wraz z innymi odpadami wodnymi. Umyj szkło, nasadki kuwety i mieszadło zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Na koniec wyczyść powierzchnie robocze wilgotnym ręcznikiem papierowym i wyrzuć zużyte ręczniki papierowe i chusteczki laboratoryjne do kosza laboratoryjnego.
Przeanalizujmy teraz nasze dane dotyczące absorbancji, aby określić pKa neutralnej czerwieni. Najpierw wykreśl oba zestawy danych intensywności z intensywnością absorbancji przy maksimum lambda na osi y i pH na osi x, z punktami połączonymi gładkimi liniami. Następnie dla każdej serii danych należy obliczyć różnicę między początkową i końcową intensywnością absorbancji.
Użyj tego, aby obliczyć absorbancję w połowie drogi między absorbancjami początkowymi i końcowymi dla każdej serii lub punkty środkowe absorbancji. Teraz znajdź miejsce, w którym występuje punkt środkowy na każdej linii i zidentyfikuj wartość pH w tym punkcie. Te wartości pH to pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni.
Tutaj widzimy wzrost pKa o około 1 między wolną a związaną czerwienią obojętną, co wskazuje, że związana protonowana czerwień obojętna jest słabszym kwasem niż wolna protonowana czerwień obojętna o rząd wielkości.
