Bufory

Źródło: Smaa Koraym z Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa, MD, USA

1. Przygotowanie 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7Rozwiń

   W pierwszej części tego eksperymentu przygotujesz roztwór fosforanu sodu buforowany o pH 7,0. Fosforan monosodowy jest słabym kwasem ze sprzężoną zasadą, fosforanem disodowym. Niedostosowane roztwory fosforanu monosodowego mają zwykle pH około 4 - 6.

   są najbardziej skuteczne w pobliżu ich pKa, które wynosi 6,8 do 7,2 dla fosforanu sodu. Tak więc użyjesz NaOH, aby popchnąć równowagę w kierunku sprzężonej zasady bez zmiany ogólnego składu równowagi buforowej.

   • Zanim rozpoczniesz eksperyment, oblicz masę fosforanu monosodowego, która będzie potrzebna do sporządzenia 200 ml 50 mM roztworu.

     Tabela 1: Przygotowanie 50 mM buforu NaH₂PO₄, pH 7,0

     Masa molowa NaH2PO4 = 119.98 g/mol
     Objętość roztworu (ml)	200
     Molarność (mM)	50
     Mole NaH2PO4 (mol)
     Potrzebna masa (mg)
     Początkowa objętość 1 M NaOH (ml)
     Końcowa objętość 1 M NaOH (ml)
     Objętość użytego NaOH (ml)
     Potrzebna objętość wody DI (ml)

     Kliknij tutaj, aby pobrać Tabelę 1
   • Na początek załóż niezbędne środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, odporne na zachlapanie okulary ochronne i rękawice. nuta: Ta sekcja laboratorium wykorzystuje NaOH, który jest i toksyczny. Zachowaj ostrożność podczas nalewania i transportu NaOH.
   • Napełnij 250-mililitrową plastikową butelkę do mycia wodą dejonizowaną.
   • Oznacz dwie zlewki o pojemności 100 ml, jedną dla neutralnych odpadów wodnych i jedną dla podstawowych odpadów wodnych.
   • Skalibruj swój pH-metr za pomocą dostarczonych. Po zakończeniu przechowuj sondę w roztworze do przechowywania.
   • Sprowadź papier do ważenia i użyj czystej szpatułki, aby odmierzyć wymaganą ilość fosforanu sodu zgodnie z twoimi obliczeniami. Zapisz dokładną ilość fosforanu sodu w zeszycie laboratoryjnym. nuta: Fosforan sodowy pochłania wilgoć z powietrza, więc pracuj szybko, aby uzyskać dokładny pomiar i szczelnie zamknij pojemnik, gdy skończysz.
   • Umieść fosforan sodu w zlewce o pojemności 400 ml i wyczyść szpatułkę chusteczką laboratoryjną. Wyrzuć papier wagowy i chusteczkę laboratoryjną przed powrotem do dygestorium.
   • Użyj cylindra z podziałką, aby odmierzyć 175 ml wody dejonizowanej. Wlej wodę do zlewki z fosforanem sodu i dodaj mieszadło magnetyczne.
   • Mieszaj roztwór, aż sól całkowicie się rozpuści i roztwór stanie się jednorodny. Trwa to zwykle 2 - 3 minuty.
   • Odmierz 15 ml wody dejonizowanej i wlej ją do zlewki. Kontynuuj mieszanie roztworu, aż znów stanie się jednorodny (około 1 – 2 min). Wyłącz silnik mieszania.
   • Przepłucz sondę pH wodą dejonizowaną, a następnie zaciśnij ją w roztworze za pomocą czujnika nad mieszadłem.
   • Przynieś 10-mililitrowy cylinder z podziałką i szkiełko zegarkowe do okapu dozującego i odmierz 10 ml 1 M NaOH. Zanotuj dokładną objętość w cylindrze z podziałką.
   • Przykryj swoje NaOH szkiełkiem zegarka i ostrożnie przynieś je do swojego dygestorium.
   • Wznowienie mieszania roztworu fosforanu monosodowego. Monitorując odczyt pH, użyj jednorazowej pipety, aby powoli dodawać NaOH do roztworu mieszającego w kroplach. Gdy pH buforu osiągnie wartość 7,0, włóż NaOH z powrotem do cylindra miarowego.
   • Oblicz objętość NaOH, którą dodałeś do bufora. Odejmij tę objętość od 10 ml, aby określić, ile wody dejonizowanej należy dodać do buforu, aby osiągnąć całkowitą objętość roztworu wynoszącą 200 ml.
   • Zmierz wodę dejonizowaną innym 10-mililitrowym cylindrem z podziałką i dodaj ją do roztworu mieszającego, aby zakończyć tworzenie buforu.
   • Przepłucz czujnik pH wodą dejonizowaną, przykryj go nakrętką z roztworem do przechowywania i odłącz lub wyłącz sondę.
   • Oznacz butelkę z polietylenu o pojemności 250 ml jako '50 mM bufor fosforanu monosodu, pH 7,0'. Wyjmij mieszadło magnetyczne z roztworu.
   • Użyj lejka, aby wlać roztwór buforowy do oznaczonej butelki i szczelnie ją zakorkować.
2. Spektroskopia absorpcyjna wolnego i związanego neutralnego czerwonego <button class="expand">Rozwiń

   mogą być używane do oceny związków przy określonych wartościach pH. W tej sekcji zarejestrujesz widmo absorbancji wskaźnika neutralnego czerwonego w różnych. Protonowana forma neutralnej czerwieni jest czerwona, a forma zdeprotonowana jest żółto-pomarańczowa, co oznacza, że pochłaniają odpowiednio światło zielone i niebiesko-fioletowe. Tak więc formy kwaśne i zasadowe mają różne długości fal absorpcyjnych. Wiązanie białek zmienia właściwości neutralnej czerwieni, zmieniając zarówno jej absorbancję, jak i pKa.

   Po zmierzeniu widma absorbancji wolnej neutralnej czerwieni przy kilku wartościach pH, dodasz do roztworów białko wiążące ryboflawinę lub RP i ponownie zmierzysz absorbancję. Intensywność absorbancji jest związana ze stężeniem, więc po laboratorium użyjesz widm do określenia pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni

   .
   • Narysuj następującą tabelę w swoim notatniku laboratoryjnym. Ponumeruj kuwety od 1 do 10 i wymień dziewięć wartości pH buforu, których będziesz używać. Dziesiąta kuweta będzie ślepym zbiornikiem na wodę dejonizowaną. nuta: Zawsze trzymaj kuwety za teksturowane boki i wytrzyj przezroczyste boki tuż przed włożeniem kuwety do spektrofotometru. Pamiętaj, aby wyrównać przezroczyste boki z wiązką światła w spektrofotometrze.

     Tabela 2: Absorbancja wolnej i związanej czerwieni neutralnej

     Kuweta #	pH buforu	Abs. at λmax (Free NRH+)	Abs. at λmax (Bound NRH)
     1	5.0
     2	5.5
     3	6.0
     4	6.5
     5	7.0
     6	7.5
     7	8.0
     8	8.5
     9	11
     10	puste

     Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 2
   • Zdobądź dziesięć 1,5-mililitrowych kuwet i nakrętek i oznacz je od 1 do 10, aby pasowały do tabeli w twoim zeszycie laboratoryjnym.
   • Oznacz zlewkę o pojemności 25 ml jako 'DIH2O' i napełnij ją wodą dejonizowaną.
   • Spłucz swoje neutralne odpady wodne do kanalizacji i ponownie oznacz zlewkę jako 'wodny odpad buforowy'.
   • Oznacz zlewkę o pojemności 400 ml na używane końcówki do mikropipet.
   • Podłącz końcówkę do mikropipety o pojemności 1 ml i użyj jej do dozowania 1000 μL wody dejonizowanej do kuwety 10. To jest twój ślepy pistolet rozpuszczalnikowy.
   • Umieść 925 μL swojego buforu fosforanu monosodowego pH 7.0 w kuwecie 5.
   • Przynieś pozostałe puste kuwety do stołu buforowego. Kierując się tabelą w zeszycie laboratoryjnym, dozuj 925 μl każdego buforu do odpowiedniej kuwety za pomocą oznakowanych mikropipet. Należy uważać, aby nie używać tej samej końcówki pipety do różnych.
   • Gdy skończysz, przynieś z powrotem do swojego środowiska pracy. Tam ustaw mikropipetę o pojemności 200 μl na dozowanie 75 μl i przymocuj końcówkę do mikropipety.
   • Dozuj 75 μL neutralnej czerwieni do każdej z dziewięciu kuwet buforowych. Odwróć każdą kuwetę kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwory. nuta: Wymień końcówkę pipety, jeśli dotyka bufora.
   • Gdy już zmieszasz neutralną czerwień z każdym buforem, zrób zdjęcie lub zapisz kolory roztworów.
   • Włącz ręczny spektrofotometr i pozwól źródłu światła się rozgrzać. Gdy będzie gotowy, utwórz nowy eksperyment, aby zmierzyć absorbancję w funkcji długości fali dla wolnej neutralnej czerwieni
     .
   • Włóż kuwetę z wodą dejonizowaną i uzyskaj spektrum wody dejonizowanej. Ustaw go jako tło rozpuszczalnika lub puste.
   • Następnie usuń puste miejsce i włóż kuwetę neutralnej czerwieni do buforu o najniższym pH, który będzie miał najwyższe stężenie protonowanej neutralnej czerwieni.
   • Zdobądź spektrum, które powinno pokazywać jeden silny szczyt. Zidentyfikuj długość fali odpowiadającą najwyższemu punktowi tego piku lub maksimum. Zapisz tę długość fali w notatniku laboratoryjnym jako lambda max dla protonowanej wolnej neutralnej czerwieni.
   • Zapisz dane i wyjmij kuwetę. Zapisz absorbancję w notatniku, a następnie zbierz widma dla kuwet 2 - 9, korzystając z tej samej procedury.
   • Zapisz długość fali punktu izobestowego w swoim notatniku laboratoryjnym. W tym miejscu wszystkie widma krzyżują się na jednej długości fali. Jeśli widmo nie przecina się w tym punkcie, opróżnij i wyczyść kuwetę, przygotuj nową próbkę i spróbuj ponownie.
   • Gdy zakończysz zbieranie widm dla wszystkich dziewięciu kuwet, zapisz i eksportuj dane.
   • Utwórz nowy eksperyment do pomiaru absorbancji w stosunku do długości fali dla związanego neutralnego koloru czerwonego.
   • Dopasuj nową końcówkę do mikropipety o pojemności 200 μl i dodaj 75 μl roztworu białka wiążącego ryboflawinę do każdej kuwety, łącznie z ślepą próbą. Wysuń końcówkę, zabezpiecz nasadki kuwety i kilkakrotnie odwróć kuwetę, aby wymieszać roztwory.
   • Włóż kuwetę 10 do spektrofotometru i ustaw ją jako ślepą próbę rozpuszczalnika.
   • Zdobądź widmo próbki o najniższym pH i zidentyfikuj długość fali odpowiadającą maksimum najbardziej intensywnego szczytu. Zapisz to w swoim notatniku laboratoryjnym jako maksimum lambda neutralnej czerwieni związanej z protonem.
   • Zdobądź widma dla kuwet 2 - 9 w taki sam sposób, jak to zrobiłeś dla bezpłatnych próbek neutralnej czerwieni. Zapisz w tabeli intensywność przy lambda max dla neutralnej czerwieni związanej z protonem, wraz z długością fali w punkcie izobestycznym.
   • Gdy skończysz, zapisz swoje dane, wyeksportuj je do późniejszej analizy i wyłącz spektrofotometr.
   • Odłóż cały sprzęt i wyrzuć zużyte końcówki do pipet do zatwierdzonego pojemnika na odpady lub kosza na śmieci.
   • Opróżnij kuwety do wodnej zlewki na odpady buforowe i przepłucz kuwety do zlewki wodą dejonizowaną.
   • Opróżnij nadmiar NaOH do podstawowego odpływu i przepłucz cylinder z podziałką wodą.
   • Spłucz podstawowe odpady wodne do kanalizacji dużą ilością wody z kranu, razem z innymi odpadami wodnymi.
   • Umyj swoje szkło, nakrętki do kuwet i mieszadło zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Wyczyść powierzchnie robocze wilgotnym ręcznikiem papierowym, a zużyte ręczniki papierowe i chusteczki laboratoryjne wyrzuć do kosza laboratoryjnego.
3. WynikiRozwiń

   Przeanalizujmy teraz nasze dane dotyczące absorbancji, aby określić pKa neutralnej czerwieni.

   Tabela 3: Oznaczanie neutralnych czerwonych pKa

   	Bezpłatny NRH+	Związany NRH+
   λmaks. (nm)
   ΔA (nm)
   Punkt środkowy (nm)
   pKa

   Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 3

   • Wykreśl oba zestawy danych intensywności z intensywnością absorbancji na poziomie lambda max na osi y i pH na osi x, z punktami połączonymi gładkimi liniami.
   • Oblicz różnicę między początkową i końcową intensywnością absorbancji dla każdej serii danych.
   • Określ absorbancję w połowie drogi między absorbancją początkową i końcową dla każdej serii, lub punkty środkowe absorbancji.
   • Znajdź miejsce, w którym występuje punkt środkowy na każdej linii i określ wartość pH w tym punkcie. Te wartości pH to pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni
     .
   • Tutaj widzimy wzrost pKa o około jeden między wolną a związaną neutralną czerwienią, co wskazuje, że neutralna czerwień związana protonowana jest słabszym kwasem niż wolna protonowana neutralna czerwień o rząd wielkości.