Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Bufory

Koncepcje Przygotowanie dla instruktora Protokół dla studentów

0 wyświetleń04:35 min.

to roztwory, które działają w celu utrzymania stałego pH w systemie niezależnie od dodania mocnych kwasów lub zasad. W przypadku braku dodanie mocnego kwasu lub zasady do roztworu znacznie zmienia pH. są kluczowe w życiu codziennym. Na przykład krew działa jak bufor i jest w stanie utrzymać pH między 7,35 a 7,45, ponieważ pH powyżej 7,8 lub poniżej 6,8 może spowodować śmierć.

Jak więc działa bufor? Bufor jest zasadniczo słabym kwasem lub zasadą i jego sprzężoną zasadą lub kwasem w równowadze ze sobą. Weźmy na przykład bufor wykonany z kwasu octowego i octanu sodu. Roztwór buforowy zawiera słaby kwas i jego sprzężoną sól, która dysocjuje, tworząc sprzężony octan zasadowy. Roztwór jest kwaśny, ponieważ K_a kwasu octowego jest wyższy niż K_b sprzężonej zasady.

Pamiętaj, że stała dysocjacji, K_a lub K_b, określa odpowiednio moc kwasu lub zasady, ponieważ jest to stała równowagi dla dysocjacji związku w wodzie. Stała dysocjacji może być również reprezentowana jako pK_a lub ujemny logarytm K_a, gdzie im mniejsze pK_a, tym silniejszy kwas. To samo dotyczy pK_b, gdzie im mniejsze pK_b, tym silniejsza podstawa.

Wracając do buforu octanowego, jeśli dodamy mocną zasadę, taką jak wodorotlenek sodu, jony wodorotlenkowe reagują z jonami hydroniowymi obecnymi w roztworze. Powoduje to, że więcej kwasu octowego reaguje z wodą, aby powrócić do równowagi, tworząc w ten sposób więcej jonów hydroniowych. Jeśli dodamy mocny kwas, taki jak kwas solny, w roztworze powstaje więcej jonów hydroniowych. Jony te reagują z jonami octanowymi, tworząc więcej kwasu octowego. W obu przypadkach zmiana pH roztworu jest bardzo niewielka.

Należy pamiętać, że każdy bufor ma określony zakres pH, w którym może buforować roztwór. Tutaj pokazujemy krzywą miareczkowania dla naszego buforu kwasu octowego. Zakres buforowania jest podświetlony. Obszar ten jest określony równaniem Hendersona-Hasselbalcha, które mówi nam, że pH buforu jest określone przez K_a słabego kwasu i stosunek sprzężonej zasady do słabego kwasu.

Daleko od tego pH słaby kwas lub zasada buforu jest wyczerpana i nie może buforować pH. Tak więc, wybierając bufor do swojego zastosowania, wybierz taki, którego pK_a jest bliskie pożądanemu pH.

Wreszcie, wszystkie mają ograniczenie swojej zdolności buforowej, co oznacza ilość kwasu lub zasady, którą można dodać do roztworu buforowego, zanim pH ulegnie znaczącej zmianie. Na przykład, jeśli dodamy zbyt dużo kwasu do naszego roztworu buforowego kwasu octowego i octanu sodu, sprotonujemy wszystkie jony octanowe i zgromadzimy dużo jonów hydroniowych, obniżając w ten sposób pH.

Podobnie, jeśli dodamy zbyt dużo zasady, zdeprotonujemy cały kwas octowy i zgromadzimy dużo jonów wodorotlenkowych, zwiększając w ten sposób pH. Tak więc na zdolność buforową ma wpływ stężenie słabego kwasu i soli sprzężonej. Tak więc 1-molowy bufor octanowy ma większą pojemność buforową niż 0,1-molowy bufor octanu.

W tym laboratorium przygotujesz i zbadasz o szerokim zakresie pH. Następnie użyjesz swoich, aby określić_{pK a} wskaźnika pH, zwanego neutralną czerwienią, i zbadać zmianę pK_a neutralnej czerwieni po wprowadzeniu białka wiążącego ryboflawinę.

Print Procedure Steps

Źródło: Smaa Koraym z Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa, MD, USA

Przygotowanie 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7

W pierwszej części tego eksperymentu przygotujesz roztwór fosforanu sodu buforowany o pH 7,0. Fosforan monosodowy jest słabym kwasem ze sprzężoną zasadą, fosforanem disodowym. Niedostosowane roztwory fosforanu monosodowego mają zwykle pH około 4 - 6.

są najbardziej skuteczne w pobliżu ich pKa, które wynosi 6,8 do 7,2 dla fosforanu sodu. Tak więc użyjesz NaOH, aby popchnąć równowagę w kierunku sprzężonej zasady bez zmiany ogólnego składu równowagi buforowej.

Zanim rozpoczniesz eksperyment, oblicz masę fosforanu monosodowego, która będzie potrzebna do sporządzenia 200 ml 50 mM roztworu.

Tabela 1: Przygotowanie 50 mM buforu NaH₂PO₄, pH 7,0

Masa molowa NaH₂PO₄ = 119.98 g/mol
Objętość roztworu (ml)	200
Molarność (mM)	50
Mole NaH₂PO₄ (mol)
Potrzebna masa (mg)
Początkowa objętość 1 M NaOH (ml)
Końcowa objętość 1 M NaOH (ml)
Objętość użytego NaOH (ml)
Potrzebna objętość wody DI (ml)

Kliknij tutaj, aby pobrać Tabelę 1

Na początek załóż niezbędne środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, odporne na zachlapanie okulary ochronne i rękawice. nuta: Ta sekcja laboratorium wykorzystuje NaOH, który jest i toksyczny. Zachowaj ostrożność podczas nalewania i transportu NaOH.
Napełnij 250-mililitrową plastikową butelkę do mycia wodą dejonizowaną.
Oznacz dwie zlewki o pojemności 100 ml, jedną dla neutralnych odpadów wodnych i jedną dla podstawowych odpadów wodnych.
Skalibruj swój pH-metr za pomocą dostarczonych. Po zakończeniu przechowuj sondę w roztworze do przechowywania.
Sprowadź papier do ważenia i użyj czystej szpatułki, aby odmierzyć wymaganą ilość fosforanu sodu zgodnie z twoimi obliczeniami. Zapisz dokładną ilość fosforanu sodu w zeszycie laboratoryjnym. nuta: Fosforan sodowy pochłania wilgoć z powietrza, więc pracuj szybko, aby uzyskać dokładny pomiar i szczelnie zamknij pojemnik, gdy skończysz.
Umieść fosforan sodu w zlewce o pojemności 400 ml i wyczyść szpatułkę chusteczką laboratoryjną. Wyrzuć papier wagowy i chusteczkę laboratoryjną przed powrotem do dygestorium.
Użyj cylindra z podziałką, aby odmierzyć 175 ml wody dejonizowanej. Wlej wodę do zlewki z fosforanem sodu i dodaj mieszadło magnetyczne.
Mieszaj roztwór, aż sól całkowicie się rozpuści i roztwór stanie się jednorodny. Trwa to zwykle 2 - 3 minuty.
Odmierz 15 ml wody dejonizowanej i wlej ją do zlewki. Kontynuuj mieszanie roztworu, aż znów stanie się jednorodny (około 1 – 2 min). Wyłącz silnik mieszania.
Przepłucz sondę pH wodą dejonizowaną, a następnie zaciśnij ją w roztworze za pomocą czujnika nad mieszadłem.
Przynieś 10-mililitrowy cylinder z podziałką i szkiełko zegarkowe do okapu dozującego i odmierz 10 ml 1 M NaOH. Zanotuj dokładną objętość w cylindrze z podziałką.
Przykryj swoje NaOH szkiełkiem zegarka i ostrożnie przynieś je do swojego dygestorium.
Wznowienie mieszania roztworu fosforanu monosodowego. Monitorując odczyt pH, użyj jednorazowej pipety, aby powoli dodawać NaOH do roztworu mieszającego w kroplach. Gdy pH buforu osiągnie wartość 7,0, włóż NaOH z powrotem do cylindra miarowego.
Oblicz objętość NaOH, którą dodałeś do bufora. Odejmij tę objętość od 10 ml, aby określić, ile wody dejonizowanej należy dodać do buforu, aby osiągnąć całkowitą objętość roztworu wynoszącą 200 ml.
Zmierz wodę dejonizowaną innym 10-mililitrowym cylindrem z podziałką i dodaj ją do roztworu mieszającego, aby zakończyć tworzenie buforu.
Przepłucz czujnik pH wodą dejonizowaną, przykryj go nakrętką z roztworem do przechowywania i odłącz lub wyłącz sondę.
Oznacz butelkę z polietylenu o pojemności 250 ml jako '50 mM bufor fosforanu monosodu, pH 7,0'. Wyjmij mieszadło magnetyczne z roztworu.
Użyj lejka, aby wlać roztwór buforowy do oznaczonej butelki i szczelnie ją zakorkować.

Spektroskopia absorpcyjna wolnego i związanego neutralnego czerwonego <button class="expand">Rozwiń
mogą być używane do oceny związków przy określonych wartościach pH. W tej sekcji zarejestrujesz widmo absorbancji wskaźnika neutralnego czerwonego w różnych. Protonowana forma neutralnej czerwieni jest czerwona, a forma zdeprotonowana jest żółto-pomarańczowa, co oznacza, że pochłaniają odpowiednio światło zielone i niebiesko-fioletowe. Tak więc formy kwaśne i zasadowe mają różne długości fal absorpcyjnych. Wiązanie białek zmienia właściwości neutralnej czerwieni, zmieniając zarówno jej absorbancję, jak i pKa.

Po zmierzeniu widma absorbancji wolnej neutralnej czerwieni przy kilku wartościach pH, dodasz do roztworów białko wiążące ryboflawinę lub RP i ponownie zmierzysz absorbancję. Intensywność absorbancji jest związana ze stężeniem, więc po laboratorium użyjesz widm do określenia pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni
.
- Narysuj następującą tabelę w swoim notatniku laboratoryjnym. Ponumeruj kuwety od 1 do 10 i wymień dziewięć wartości pH buforu, których będziesz używać. Dziesiąta kuweta będzie ślepym zbiornikiem na wodę dejonizowaną. nuta: Zawsze trzymaj kuwety za teksturowane boki i wytrzyj przezroczyste boki tuż przed włożeniem kuwety do spektrofotometru. Pamiętaj, aby wyrównać przezroczyste boki z wiązką światła w spektrofotometrze.
  Tabela 2: Absorbancja wolnej i związanej czerwieni neutralnej
  
  Kuweta # pH buforu Abs. at λ_max(Free NRH⁺) Abs. at λ_max (Bound NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 puste
  Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 2
- Zdobądź dziesięć 1,5-mililitrowych kuwet i nakrętek i oznacz je od 1 do 10, aby pasowały do tabeli w twoim zeszycie laboratoryjnym.
- Oznacz zlewkę o pojemności 25 ml jako 'DIH2O' i napełnij ją wodą dejonizowaną.
- Spłucz swoje neutralne odpady wodne do kanalizacji i ponownie oznacz zlewkę jako 'wodny odpad buforowy'.
- Oznacz zlewkę o pojemności 400 ml na używane końcówki do mikropipet.
- Podłącz końcówkę do mikropipety o pojemności 1 ml i użyj jej do dozowania 1000 μL wody dejonizowanej do kuwety 10. To jest twój ślepy pistolet rozpuszczalnikowy.
- Umieść 925 μL swojego buforu fosforanu monosodowego pH 7.0 w kuwecie 5.
- Przynieś pozostałe puste kuwety do stołu buforowego. Kierując się tabelą w zeszycie laboratoryjnym, dozuj 925 μl każdego buforu do odpowiedniej kuwety za pomocą oznakowanych mikropipet. Należy uważać, aby nie używać tej samej końcówki pipety do różnych.
- Gdy skończysz, przynieś z powrotem do swojego środowiska pracy. Tam ustaw mikropipetę o pojemności 200 μl na dozowanie 75 μl i przymocuj końcówkę do mikropipety.
- Dozuj 75 μL neutralnej czerwieni do każdej z dziewięciu kuwet buforowych. Odwróć każdą kuwetę kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwory. nuta: Wymień końcówkę pipety, jeśli dotyka bufora.
- Gdy już zmieszasz neutralną czerwień z każdym buforem, zrób zdjęcie lub zapisz kolory roztworów.
- Włącz ręczny spektrofotometr i pozwól źródłu światła się rozgrzać. Gdy będzie gotowy, utwórz nowy eksperyment, aby zmierzyć absorbancję w funkcji długości fali dla wolnej neutralnej czerwieni
  .
- Włóż kuwetę z wodą dejonizowaną i uzyskaj spektrum wody dejonizowanej. Ustaw go jako tło rozpuszczalnika lub puste.
- Następnie usuń puste miejsce i włóż kuwetę neutralnej czerwieni do buforu o najniższym pH, który będzie miał najwyższe stężenie protonowanej neutralnej czerwieni.
- Zdobądź spektrum, które powinno pokazywać jeden silny szczyt. Zidentyfikuj długość fali odpowiadającą najwyższemu punktowi tego piku lub maksimum. Zapisz tę długość fali w notatniku laboratoryjnym jako lambda max dla protonowanej wolnej neutralnej czerwieni.
- Zapisz dane i wyjmij kuwetę. Zapisz absorbancję w notatniku, a następnie zbierz widma dla kuwet 2 - 9, korzystając z tej samej procedury.
- Zapisz długość fali punktu izobestowego w swoim notatniku laboratoryjnym. W tym miejscu wszystkie widma krzyżują się na jednej długości fali. Jeśli widmo nie przecina się w tym punkcie, opróżnij i wyczyść kuwetę, przygotuj nową próbkę i spróbuj ponownie.
- Gdy zakończysz zbieranie widm dla wszystkich dziewięciu kuwet, zapisz i eksportuj dane.
- Utwórz nowy eksperyment do pomiaru absorbancji w stosunku do długości fali dla związanego neutralnego koloru czerwonego.
- Dopasuj nową końcówkę do mikropipety o pojemności 200 μl i dodaj 75 μl roztworu białka wiążącego ryboflawinę do każdej kuwety, łącznie z ślepą próbą. Wysuń końcówkę, zabezpiecz nasadki kuwety i kilkakrotnie odwróć kuwetę, aby wymieszać roztwory.
- Włóż kuwetę 10 do spektrofotometru i ustaw ją jako ślepą próbę rozpuszczalnika.
- Zdobądź widmo próbki o najniższym pH i zidentyfikuj długość fali odpowiadającą maksimum najbardziej intensywnego szczytu. Zapisz to w swoim notatniku laboratoryjnym jako maksimum lambda neutralnej czerwieni związanej z protonem.
- Zdobądź widma dla kuwet 2 - 9 w taki sam sposób, jak to zrobiłeś dla bezpłatnych próbek neutralnej czerwieni. Zapisz w tabeli intensywność przy lambda max dla neutralnej czerwieni związanej z protonem, wraz z długością fali w punkcie izobestycznym.
- Gdy skończysz, zapisz swoje dane, wyeksportuj je do późniejszej analizy i wyłącz spektrofotometr.
- Odłóż cały sprzęt i wyrzuć zużyte końcówki do pipet do zatwierdzonego pojemnika na odpady lub kosza na śmieci.
- Opróżnij kuwety do wodnej zlewki na odpady buforowe i przepłucz kuwety do zlewki wodą dejonizowaną.
- Opróżnij nadmiar NaOH do podstawowego odpływu i przepłucz cylinder z podziałką wodą.
- Spłucz podstawowe odpady wodne do kanalizacji dużą ilością wody z kranu, razem z innymi odpadami wodnymi.
- Umyj swoje szkło, nakrętki do kuwet i mieszadło zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Wyczyść powierzchnie robocze wilgotnym ręcznikiem papierowym, a zużyte ręczniki papierowe i chusteczki laboratoryjne wyrzuć do kosza laboratoryjnego.
Wyniki
Przeanalizujmy teraz nasze dane dotyczące absorbancji, aby określić pKa neutralnej czerwieni.

Tabela 3: Oznaczanie neutralnych czerwonych pKa

Bezpłatny NRH⁺ Związany NRH⁺
λ_maks. (nm)
ΔA (nm)
Punkt środkowy (nm)
pKa

Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 3
- Wykreśl oba zestawy danych intensywności z intensywnością absorbancji na poziomie lambda max na osi y i pH na osi x, z punktami połączonymi gładkimi liniami.
- Oblicz różnicę między początkową i końcową intensywnością absorbancji dla każdej serii danych.
- Określ absorbancję w połowie drogi między absorbancją początkową i końcową dla każdej serii, lub punkty środkowe absorbancji.
- Znajdź miejsce, w którym występuje punkt środkowy na każdej linii i określ wartość pH w tym punkcie. Te wartości pH to pKa wolnej i związanej neutralnej czerwieni
  .
- Tutaj widzimy wzrost pKa o około jeden między wolną a związaną neutralną czerwienią, co wskazuje, że neutralna czerwień związana protonowana jest słabszym kwasem niż wolna protonowana neutralna czerwień o rząd wielkości.