Synteza luminolu

Źródło: Lara Al Hariri i Ahmed Basabrain z University of Massachusetts Amherst, MA, USA

1. Synteza 3-nitroftahydrazyduRozwiń

   W tym laboratorium zsyntetyzujesz 3-aminoftalhydrazyd, który jest również nazywany luminolem, w 2-etapowym procesie. Pierwszym etapem jest reakcja kondensacji między kwasem 3-nitroftalowym a hydrazyną.

   Na tym etapie grupy kwasu karboksylowego są zastępowane grupami NH w celu wytworzenia 3-nitroftalhydrazydu i dwóch cząsteczek wody. W całym tym laboratorium musisz pracować pod wyciągiem, ponieważ w reakcjach powstają toksyczne opary i gazy.

   • Zanim zaczniesz, załóż fartuch laboratoryjny, odporne na zachlapanie okulary ochronne i rękawice nitrylowe. nuta: Hydrazyna jest wysoce toksyczna i łatwopalna, dlatego należy unikać jej dotykania i przechowywać wszystko, co zawiera hydrazynę, zamknięte lub przykryte podczas transportu między wyciągami.
   • Teraz odmierz 10 ml wody dejonizowanej i wlej ją do 25-mililitrowej kolby Erlenmeyera. Zacisnąć kolbę na płycie grzejnej i umieścić w niej termometr.
   • Następnie zacznij podgrzewać wodę. Chcesz, aby temperatura wody wynosiła 80 °C, więc ustaw ustawienie płyty grzejnej na nieco wyższe.
   • Podczas nagrzewania ustaw palnik Bunsena pod zaciskiem przymocowanym na stojaku laboratoryjnym.
   • Zaopatrz się w probówkę o pojemności 25 ml i ustaw zacisk tak, aby utrzymywał probówkę około 5 – 7 cm nad płomieniem. Następnie wyjmij probówkę i umieść ją w zlewce o pojemności 400 ml.
   • Gdy woda osiągnie 80 °C, dostosuj ustawienie grzania, aby utrzymać stabilną temperaturę.
   • Następnie zważ 0,6 g kwasu 3-nitroftalowego w tarowanej łodzi wagowej. Wlej kwas 3-nitroftalowy do probówki. Następnie przynieś probówkę i korek probówki do kaptura rozpuszczalnika.
   • Użyj dołączonej pipety miarowej, aby dokładnie odmierzyć 0,9 ml roztworu hydrazyny 10% v/v i przenieść go do probówki. Pamiętaj, aby zakręcić butelkę z roztworem hydrazyny i zakorkować probówkę przed powrotem do kaptura.
   • Zaciśnij probówkę nad palnikiem Bunsena i wyjmij korek. Następnie wlej ~ 2 ml glikolu trietylenowego do cylindra z podziałką i umieść go w masce.
   • Teraz dodaj 2 lub 3 wrzące chipsy do probówki. Umieść termometr wysokotemperaturowy w probówce i zapal palnik Bunsena. Podgrzej mieszaninę średnim płomieniem, aż kwas 3-nitroftalowy się rozpuści.
   • Następnie dodaj glikol trietylenowy i zwiększ temperaturę płomienia. nuta: Gdy woda z roztworu hydrazyny się zagotuje, temperatura będzie nadal rosła.
   • Gdy mieszanina reakcyjna osiągnie 210 °C, zmniejsz ogień i utrzymuj mieszaninę między 210 °C a 220 °C przez 3 – 4 minuty.
   • Następnie zgaś płomień i poczekaj, aż mieszanina ostygnie do 100 °C.
   • Wyłącz płytę grzejną, wyjmij termometr i odblokuj kolbę. Za pomocą szczypiec przytrzymać kolbę i odmierzyć 8 ml gorącej wody za pomocą cylindra z podziałką. Wlej gorącą wodę do probówki i wyjmij termometr.
   • Weź kawałek plastikowej folii parafinowej i zakryj otwór probówki. Następnie za pomocą szczypiec przenieś probówkę do zlewki mocującej.
   • Przy zlewie laboratoryjnym trzymaj probówkę pod bieżącą wodą z kranu, aby ją schłodzić, uważając, aby nie wpuścić do niej wody.
   • Następnie osusz zewnętrzną część rurki i przynieś ją z powrotem do swojego kaptura. Clamp rurkę pionowo i usuń folię parafinową. Pozwól, aby żółty 3-nitroftalhydrazyd wytrącił się w probówce przez 15 minut.
   • Podczas oczekiwania dodaj ~10 ml dejonizowanej wody do 25-mililitrowej kolby Erlenmeyera. Przygotuj kąpiel lodową w zlewce o pojemności 250 ml i zacznij schładzać w niej wodę.
   • Następnie przygotuj się na filtrację próżniową za pomocą kolby filtracyjnej o pojemności 250 ml, lejka Büchnera i kawałka okrągłej bibuły filtracyjnej.
   • Gdy produkt wytrąci się przez co najmniej 15 minut, zaopatrz się w pipetę Pasteura i zwilż bibułę filtracyjną kilkoma kroplami zimnej wody.
   • Następnie włącz próżnię i wlej zawartość probówki do lejka Büchnera. Pozostałe ciało stałe spłukać do lejka 1 – 2 ml zimnej wody.
   • Usuń gotujące się wióry pęsetą i spłucz je kilkoma kroplami zimnej wody, aby zakończyć zbieranie produktu.
   • Wyłącz pompę próżniową, gdy płyn nie będzie już kapał do kolby z lejka.
2. Synteza 3-aminopthalhydrazyduRozwiń

   W drugim etapie syntezy luminolu zredukujesz grupę nitrową 3-nitroftalhydrazydu za pomocą ditionianu sodu w zasadowym roztworze NaOH. W ten sposób powstanie 3-aminoftalhydrazyd dianion.

   Po redukcji dodasz kwas octowy, aby sprotonować dianion, tworząc luminol. Ditionyn sodu jest wysoce reaktywny i szybko ulega degradacji, więc użyjesz go w niewielkim nadmiarze. Po redukcji należy protonować dianion luminolu, aby zmniejszyć jego rozpuszczalność w wodzie. Na koniec wytrącisz i zbierzesz luminol w postaci żółtego ciała stałego.

   • Umieść czystą probówkę o pojemności 25 ml w zlewce i użyj czystej szpatułki, aby przenieść swój 3-nitroftalhydrazyd do probówki.
   • Odłóż lejek Büchnera na bok i zaciśnij probówkę nad palnikiem Bunsena. Pozostaw kolbę filtracyjną na miejscu na później.
   • Teraz użyj 10-mililitrowej butli z podziałką, aby uzyskać 3 ml około 3 M NaOH. Wlej roztwór wodorotlenku sodu do probówki i mieszaj mieszaninę szklaną pałeczką, aż 3-nitroftalhydrazyd się rozpuści.
   • Teraz zważ 2 g ditionitu sodu w tarowanej łodzi wagowej i dodaj go do probówki. Weź 3 ml wody dejonizowanej i wlej ją do probówki.
   • Dobrze wymieszaj mieszaninę, aby rozpuścić jak najwięcej ciała stałego. Następnie dodaj kilka czystych wrzących frytek do probówki i zapal palnik Bunsena.
   • Podgrzej mieszaninę do wrzenia na średnim ogniu, a następnie gotuj przez 5 minut.
   • Podczas oczekiwania odmierz 1,5 ml lodowatego kwasu octowego i przynieś go do swojego okapu.
   • Gdy mieszanina reakcyjna gotuje się przez 5 minut, wyłącz palnik Bunsena i dodaj kwas octowy do probówki. Pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej, co zwykle zajmuje 10-15 minut. W międzyczasie przygotuj kąpiel lodową w zlewce o pojemności 600 ml.
   • Gdy mieszanina ostygnie, umieść ją w łaźni lodowej i poczekaj 15 minut, aż luminol się wytrąci.
   • Złóż ponownie zestaw filtracji próżniowej, używając czystego lejka Büchnera i nowego kawałka bibuły filtracyjnej, i zacznij schładzać kolejne 10 ml wody dejonizowanej w łaźni lodowej.
   • Gdy luminol znajduje się w kąpieli lodowej przez co najmniej 15 minut, zwilż bibułę filtracyjną zimną wodą. Następnie zbierz stały luminol przez filtrację próżniową.
   • Odzyskaj wrzące frytki i spłucz luminol większą ilością zimnej wody. Gdy płyn przestanie kapać z lejka, wyłącz próżnię i przenieś luminol do zlewki o pojemności 50 ml.
   • Teraz przygotuj połączony filtrat do utylizacji. Najpierw oznacz zlewkę o pojemności 250 ml jako "odpady hydrazyny i ditionitu". Przenieść filtrat do zlewki i przepłukać kolbę wodą dejonizowaną w celu usunięcia pozostałości hydrazyny i ditionititu.
   • Następnie rozcieńczyć filtrat 10 ml wody dejonizowanej. Następnie odmierzyć 10 ml 1 M węglanu sodu i dodać go do połączonych filtratów.
   • Przynieś 50-mililitrową butlę z podziałką do okapu na odpady. Odmierzyć 40 ml 10% podchlorynu sodu i wlać go do mieszaniny filtratu. Umieść zlewkę na płycie grzejnej, dodaj mieszadło i umieść termometr w zlewce.
   • Podgrzej mieszaninę do 50 °C, mieszając. Mieszanina musi pozostać w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę, aby utlenić resztki hydrazyny i ditionititu, więc upewnij się, że temperatura jest stabilna i ustaw timer na 1 godzinę przed rozpoczęciem ostatniej części laboratorium.
3. Chemiluminescencja i fluorescencjaRozwiń

   W ostatniej części laboratorium zmieszasz część wytworzonego luminolu z dimetylosulfotlenkiem na stałym wodorotlenku potasu. Jony hydroksylowe deprotonują dwie grupy aminowe. Następnie tlen z otoczenia utlenia dianion luminolu do 3-aminoftalanu lub 3-APA w stanie wzbudzonym. Ten niestabilny kompleks szybko zrelaksuje się do stanu podstawowego, uwalniając energię w postaci światła widzialnego. Ponieważ wzbudzony 3-APA był produktem reakcji chemicznej, emitowane światło nazywa się chemiluminescencją.

   Gdy zobaczysz chemiluminescencję z reakcji utleniania, dodasz do mieszaniny fluoresceinę, cząsteczkę fluorescencyjną. Niektóre wzbudzone 3-APA przenoszą energię bezpośrednio do fluoresceiny, zamiast emitować światło, dając roztwór z dwoma różnymi związkami emitującymi światło.

   • Teraz zmierz około 0,2 g luminolu, który wyprodukowałeś i umieść go w 15-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. W porządku, jeśli ciało stałe jest nadal wilgotne.
   • Zdobądź 5 – 7 granulek wodorotlenku potasu i wlej je do kolby. Następnie umieścić kolbę, korek i cylinder z podziałką o pojemności 10 ml do pokrywy z rozpuszczalnikiem.
   • Odmierz 2 ml DMSO, dodaj do kolby i zakorkuj. Umieść cylinder z podziałką w dygestoriach i przenieś kolbę do ciemnego pomieszczenia.
   • Potrząsaj energicznie kolbą z korkiem, aż zobaczysz chemiluminescencję, a następnie odłóż kolbę. Światło szybko gaśnie, ponieważ zarówno utlenianie, jak i relaksacja są szybkimi procesami.
   • Potrząśnij kolbą i pozwól, aby światło zgasło jeszcze 6 – 10 razy bez otwierania kolby. Światło będzie stopniowo ciemniejsze w miarę zużywania tlenu w kolbie. nuta: Aby było jaśniej, pozostaw kolbę otwartą w dygestorium na minutę, aby uzupełnić tlen.
   • Zamknij kolbę, wróć do ciemnego pokoju i ponownie potrząśnij kolbą, aby zobaczyć efekt.
   • Teraz odmierz 0,2 g barwnika fluoresceinowego i dodaj go do swojej kolby. Zakorkować kolbę i wrócić do ciemnego pokoju. Potrząsać energicznie kolbą, aż mieszanina zacznie jasno świecić, a następnie odłożyć ją, aby zaobserwować różnicę w kolorze od samego luminolu.
   • Gdy skończysz, sprawdź filtrat. Po osiągnięciu temperatury 50 °C przez co najmniej 1 godzinę wyłączyć płytę grzejną i poczekać, aż zlewka ostygnie do temperatury pokojowej.
   • Następnie dodaj około 10 ml wody z kranu do filtratu i spłucz ją do odpływu.
   • Pozostałe odpady chemiczne i szklane wyrzuć do odpowiednich pojemników, wyczyść szkło i narzędzia, a sprzęt laboratoryjny odłóż na miejsce.
4. WynikiRozwiń

   W warunkach reakcji utleniania wzbudzony 3-APA emituje niebiesko-zielone światło w szerokim zakresie około 500 nm, gdy się rozluźnia, a fluoresceina jest wzbudzana przez pochłanianie światła przy 480 – 490 nm i 515 – 525 nm.

   Po dodaniu fluoresceiny do mieszaniny reakcji utleniania luminolu, wzbudzony 3-APA może przenosić energię, którą fluoresceina pochłonęłaby jako światło, bezpośrednio do pobliskiej cząsteczki fluoresceiny w specjalnej interakcji zwanej nieradiacyjnym transferem energii. Powstała w ten sposób wzbudzona fluoresceina emituje żółto-zielone światło, gdy się rozluźnia.

   Wzbudzony 3-APA jest wysoce niestabilny, więc jeśli żadna fluoresceina nie jest wystarczająco blisko do transferu energii nieradiacyjnej, rozluźni się, emitując światło jak zwykle. W ten sposób widmo twojej końcowej świecącej mieszaniny wykazywałoby wkład zarówno światła niebiesko-zielonego, jak i żółto-zielonego.