Spektroskopia UV-VIS barwników

absorbancja

Kiedy światło oddziałuje z substancją, część światła jest pochłaniana, podczas gdy reszta jest odbijana lub przepuszczana przez nią. Substancje, które postrzegamy jako posiadające barwę, odbijają światło w zakresie widzialnym. Kolor substancji, którą jesteśmy w stanie zobaczyć, zależy od tego, jaka długość fali światła jest odbijana. Substancja, którą postrzegamy jako niebieską, odbija światło w zakresie niebieskim (430 – 480 nm) widma widzialnego. Zgodnie z kołem kolorów ta sama substancja pochłania światło, które jest komplementarne do światła odbitego. Tak więc niebieska substancja pochłania światło w pomarańczowym obszarze (590 – 630 nm) widma widzialnego. Nie wszystkie związki wchłaniają się w obszarze widzialnym, w wyniku czego dla ludzkiego oka wydają się bezbarwne.

Światło jest definiowane przez jego energię E i długość fali λ. Tutaj h jest stałą Plancka, a c jest prędkością światła.

Długość fali światła jest odwrotnie proporcjonalna do jego energii. Tak więc światło o wyższej energii ma krótszą długość fali.

Barwniki

Różnokolorowe barwniki różnią się długością fali światła, które pochłaniają. Większość barwników to sprzężone związki z naprzemiennymi wiązaniami podwójnymi i pojedynczymi i zazwyczaj pochłaniają światło w obszarze widzialnym.

Sprzężona część cząsteczki barwnika może być bardzo krótka, co oznacza, że występuje niski stopień koniugacji i niewiele naprzemiennych wiązań podwójnych i pojedynczych, lub długa, co oznacza, że występuje wysoki stopień koniugacji z wieloma naprzemiennymi wiązaniami podwójnymi i pojedynczymi. Te naprzemienne wiązania podwójne niekoniecznie muszą znajdować się tylko między dwoma atomami węgla. Te sprzężone wiązania mogą obejmować grupy karbonylowe i podwójne wiązania między węglem a tlenem. Stopień koniugacji określa długość fali światła, które związek absorbuje. Na przykład związki o wysokim stopniu koniugacji pochłaniają dłuższą długość fali niż związki o niższym stopniu koniugacji.

Opierając się na teorii orbitali molekularnych, zdelokalizowane elektrony zajmują orbitale molekularne. Najwyższy zajęty orbital molekularny lub HOMO to orbital o najwyższej energii z elektronem. Najniższy niezajęty orbital molekularny lub LUMO to orbital o najniższej energii bez elektronu. Cząsteczki z niewielką koniugacją lub bez koniugacji zazwyczaj mają dużą przerwę energetyczną między HOMO i LUMO. Jednak sprzężone cząsteczki mają mniejszą przerwę energetyczną między HOMO i LUMO.

Aby wzbudzić elektron z niższego poziomu energetycznego na wyższy poziom energetyczny lub z HOMO do LUMO, cząsteczka musi pochłonąć światło z energią równą przerwie energetycznej między dwoma orbitalami. Z tego powodu cząsteczki o dużej przerwie energetycznej wymagają światła o wyższej energii, takiego jak światło UV, do wzbudzenia elektronu. Barwniki mają jednak mniejszą przerwę energetyczną i wymagają światła o niższej energii, takiego jak światło widzialne, do wzbudzenia elektronu.

Z tego powodu cząsteczki o dużej przerwie energetycznej wymagają światła o wyższej energii, takiego jak światło UV, do wzbudzenia elektronu. Barwniki mają jednak mniejszą przerwę energetyczną i wymagają światła o niższej energii, takiego jak światło widzialne, do wzbudzenia elektronu.

Przypomnijmy, że energia światła jest odwrotnie proporcjonalna do długości fali. Tak więc światło o wyższej energii ma krótsze długości fal niż światło o niższej energii, które ma dłuższe fale.

Spektrofotometr

Eksperymentalnie absorbancję światła mierzy się za pomocą spektrofotometru UV-Visible (UV-Vis). Ten instrument wykorzystuje źródło światła, które jest przekształcane przez monochromator w określone długości fal światła, które przejdzie przez próbkę i do detektora na drugim końcu. Próbki muszą znajdować się w cieczy, więc jeśli związek organiczny jest ciałem stałym, wymagany jest rozpuszczalnik. Roztwór ten jest przechowywany w uchwycie na próbkę zwanym kuwetą. W zależności od próbki, kuweta może być wykonana z kryształu kwarcu, szkła lub tworzywa sztucznego i ma określoną długość ścieżki. Ta długość drogi to odległość, jaką światło musi przebyć przez próbkę. Ponieważ rozpuszczalnik pochłania również światło, wymagana jest ślepa próba próbki samego rozpuszczalnika. Dlatego, gdy przyrząd przechwytuje widmo absorbancji związku próbki, może odjąć widmo tła rozpuszczalnika, aby wyświetlić absorbancję spowodowaną tylko przez próbkę. Przepuszczalność, T, to ułamek pierwotnego światła, który przechodzi przez próbkę.

Tutaj P₀ to natężenie promieniowania lub energia na sekundę na jednostkę powierzchni wiązki światła przed uderzeniem w próbkę. P to natężenie promieniowania wiązki światła padającej na detektor. P jest zwykle niższe niż P₀, ponieważ część światła jest pochłaniana przez próbkę.

Absorbancja, A, jest definiowana jako ujemny logarytm transmitancji.

Absorbancja ma zakres wartości od 0 (brak absorpcji) do 2 (absorpcja 99%). Gdy światło nie jest pochłaniane, P₀ jest równe P, a przepuszczalność jest równa jeden. Zatem absorbancja wynosi zero. Jeśli 90% światła jest pochłaniane, to 10% jest przepuszczane, a T jest równe 0,1. Daje to absorbancję równą 1. Jeśli 99% światła jest pochłaniane, to przepuszczany jest 1% (T = 0,01), a absorbancja jest równa 2.

Uzyskane widmo jest wykresem absorbancji w funkcji długości fali. W przypadku spektrofotometru UV-Vis zakres ten wynosi od 200 do 800 nm.

Prawo Beera-Lamberta

Przepuszczalność i absorbancja danego związku jest związana ze stężeniem związku w roztworze. Zależność ta jest opisana przez prawo Beera-Lamberta.

Absorbancja próbki jest równa iloczynowi stężenia związku, długości drogi i molowego współczynnika tłumienia. Współczynnik ten jest unikalny dla każdego związku i będzie się różnić w zależności od długości fali. Jeśli jednak długość fali jest utrzymywana na stałym poziomie, molowy współczynnik tłumienia będzie taki sam niezależnie od zmian stężenia. Długość fali, która odpowiada najwyższej absorbancji próbki, znana jako λ_max, będzie również miała największy molowy współczynnik tłumienia.

Odwołania

1. Silberberg, M.S. (2012). Chemia: molekularna natura materii i zmiana. Boston, Massachusetts: McGraw Hill.
2. Harris, D.C. (2015). Ilościowa analiza chemiczna. Nowy Jork, NY: W.H. Freeman and Company.

Kiedy światło dociera do substancji, część jest przez nią pochłaniana, podczas gdy reszta jest odbijana lub przekazywana przez nią. Kolor substancji, tak jak ją postrzegamy, zależy od długości fal, które najprawdopodobniej odbija. Na przykład kawałek tkaniny, który widzimy jako niebieski, zawiera barwnik, który silnie odbija niebieskie światło i silnie pochłania światło pomarańczowe i czerwone.

Barwniki są zazwyczaj związkami sprzężonymi, co oznacza, że mają naprzemienne wiązania podwójne i pojedyncze. Elektrony mogą swobodnie poruszać się w układzie sprzężonym. Różnokolorowe barwniki muszą różnić się długością fal światła, które pochłaniają. Kiedy spojrzymy na kilka przykładów, zobaczymy, że pochłonięta długość fali wzrasta wraz z ilością koniugacji.

W jaki sposób długość fali jest powiązana ze stopniem koniugacji? Zastanówmy się nad poziomami energii molekularnej. Możemy myśleć o zdelokalizowanych elektronach jako o okupujących orbitale molekularne lub MO. Cząsteczka pochłania światło z dokładnie taką energią, jaka jest potrzebna do wzbudzenia elektronu na orbitalu molekularnym o wyższej energii. Najbardziej prawdopodobne jest przejście z najwyższego zajętego orbitalu molekularnego, zwanego HOMO, do najniższego niezajętego orbitalu molekularnego lub LUMO. Spodziewamy się więc, że najbardziej pochłonięta długość fali pasuje do luki energetycznej HOMO - LUMO.

Cząsteczki z niewielką koniugacją lub bez koniugacji mają zazwyczaj dużą przerwę HOMO - LUMO. Pochłaniają światło UV i odbijają całe światło widzialne, dzięki czemu wydają się białe lub bezbarwne. Wiązania sprzężone stabilizują cząsteczki poprzez obniżanie ich poziomu energii, szczególnie przy wysokich energiach. Im wyższy stopień koniugacji, tym mniejsza przerwa HOMO - LUMO i tym większa pochłonięta długość fali. Metale i substytucje również wpływają na lukę.

Spójrzmy na przykład. Retinol ma mały system sprzężony, podczas gdy chlorofil a ma duży system z azotem i magnezem. Retinol wchłania się przy 325 nm, podczas gdy chlorofil a wchłania się zarówno przy 430, jak i 662 nm. Zgodnie z oczekiwaniami luka energetyczna retinolu jest większa.

Absorpcję możemy badać za pomocą spektrofotometru UV i światła widzialnego lub UV-Vis. Spektrofotometr składa się ze źródła światła, sposobu kontrolowania długości fal odbieranych przez próbkę oraz detektora światła. Próbka jest zazwyczaj przezroczystym roztworem. Absorbancję można mierzyć przy określonej długości fali lub mierzyć w zakresie długości fal, ponieważ związki często absorbują przy więcej niż jednej długości fali. Dodatkowo widzimy zakres długości fal dla każdego przejścia, ponieważ cząsteczki są w różnych orientacjach i stanach wibracyjnych.

Podczas pomiaru światło jest albo pochłaniane, przechodzi bez kontaktu z żadnymi cząsteczkami, albo odbija się od cząsteczki rozpuszczalnika lub związku. Ignorujemy niewielką ilość światła, które odbija się do tyłu. Czasami światło, które mogłoby zostać pochłonięte przez cząsteczkę, odbija się od niej. Opisujemy, jak dobrze substancja przepuszcza określoną długość fali z unikalnym molowym współczynnikiem tłumienia. Podczas gdy absorbancja zmienia się wraz ze stężeniem, molowy współczynnik tłumienia nie.

Po pomiarze spektrofotometr porównuje światło odebrane i pierwotne w stosunku zwanym transmitancją. Absorbancja jest ujemnym logarytmem przepuszczalności o podstawie 10. Jeśli spektrofotometr ma absorbancję rozpuszczalnika, odejmuje ją, aby pokazać tylko związek. Wyniki są zwykle wyświetlane jako absorbancja w funkcji długości fali. Długość fali, przy której związek pochłania najwięcej, nazywana jest lambda max. Gdybyśmy obliczyli molowy współczynnik tłumienia dla każdej długości fali, byłby on najwyższy przy maksymalnej lambdzie.

Molowy współczynnik tłumienia, absorbancja, stężenie próbki i długość ścieżki, czyli odległość, jaką światło przebyło przez próbkę, są powiązane prawem Beera-Lamberta. Jeśli znamy dowolne trzy zmienne, możemy obliczyć czwartą.

W tym laboratorium przeanalizujesz charakterystykę absorpcji fluoresceiny, beta karotenu i barwnika indygo za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Następnie użyjesz prawa Beera-Lamberta, aby utworzyć krzywą kalibracyjną β-karotenu, a następnie określić stężenie roztworu β-karotenu.