15.10:

15.10: RT-PCR w czasie rzeczywistym

Name: RT-PCR w czasie rzeczywistym
Uploaded: 2021-04-07T12:12:00+00:00
Duration: 2 min 57 s
Description: Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym lub RT-PCR w czasie rzeczywistym jest narzędziem analitycznym służącym do określania poziomu ekspresji docelowych g

JoVE Core
Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Core Molecular Biology

Real Time RT-PCR

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Previous Video

15.9: PCR – Polymerase Chain Reaction

Next Video

15.11: RACE – Rapid Amplification of cDNA Ends

56,620 Views

•

02:57 min

•

April 07, 2021

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym lub RT-PCR w czasie rzeczywistym jest narzędziem analitycznym służącym do określania poziomu ekspresji docelowych genów. Metoda polega na przekształceniu mRNA w komplementarne DNA za pomocą enzymu znanego jako odwrotna transkryptaza, a następnie amplifikacji cDNA metodą PCR. Te dwa procesy mogą być wykonywane jednocześnie w jednej probówce lub osobno jako reakcja dwuetapowa.

Kwantyfikacja liczby amplifikowanych produktów w czasie rzeczywistym odbywa się przy użyciu barwników fluorescencyjnych lub sond specyficznych dla sekwencji połączonych z fluoroforem. Barwniki fluorescencyjne użyte w tym przypadku mogą specyficznie wiązać się z dwuniciowym DNA i wykazywać fluorescencję tylko wtedy, gdy są związane z DNA. Fluorescencję mierzy się na końcu każdego cyklu PCR po syntezie nici komplementarnej. W przypadku sond znakowanych fluoroforem fluorescencja wykazuje, gdy fluorofor jest odcinany od sondy podczas syntezy nici komplementarnej. Fluorescencja wykazywana przez te cząsteczki jest następnie wykrywana przez fotodetektory, które przekształcają sygnały fluorescencyjne do czytelnego formatu. RT-PCR w czasie rzeczywistym wymaga specjalistycznej maszyny do PCR wyposażonej w detektor umożliwiający kwantyfikację w czasie rzeczywistym, ponieważ tradycyjna maszyna do PCR nie jest przystosowana do takiej analizy.

Dane wyjściowe można analizować na wiele sposobów. Jednym ze sposobów jest policzenie liczby cykli wymaganych do osiągnięcia przez fluorescencję wykrywalnych poziomów. Cykl progowy, oznaczony przez C_t, ma miejsce, gdy fluorescencja jest wykrywana poza szumem tła. Im większa ilość tarczy w materiale wyjściowym, tym szybciej pojawi się znaczny wzrost fluorescencji, co skutkuje niższym C_t.Wartość C_t znajduje zastosowanie w dalszej kwantyfikacji lub wykrywaniu obecności lub braku sekwencji docelowej. Dodatkowo, porównanie wartości C_t próbek o nieznanym stężeniu z serią wartości C_t uzyskanych ze standardowego stężenia może określić ilość matrycy w nieznanej reakcji. Jest to znane jako kwantyfikacja bezwzględna i można ją również przeprowadzić, porównując fluorescencję z krzywą wzorcową przygotowaną przy użyciu znanych stężeń DNA.

Transcript

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym lub RT-PCR w czasie rzeczywistym może określić ilościowo RNA w miarę postępu reakcji.

Na początek odwrotna transkryptaza kopiuje RNA do komplementarnego lub cDNA. RNaza H trawi oryginalne RNA, pozostawiając małe startery przyłączone do cDNA.

Nić komplementarna jest następnie syntetyzowana przez polimerazę DNA.

Ukierunkowaną amplifikację można następnie przeprowadzić za pomocą PCR w celu utworzenia wykładniczych kopii określonych segmentów. Dwie nici są rozdzielane na początku każdego cyklu w wysokich temperaturach. Komplementarne startery oligonukleotydowe następnie wyżarzają się do każdej nici cDNA i są przedłużane przez polimerazę DNA.

DNA można określić ilościowo przy użyciu jednej z dwóch różnych metod wykrywania opartych na fluorescencji. Jedna z metod wykorzystuje barwniki, które fluoryzują tylko wtedy, gdy są związane z dwuniciowym DNA.

Barwnik wiąże się z DNA, gdzie pierwotna nić jest sparowana z nowo zsyntetyzowaną nicią komplementarną. Pod koniec każdego cyklu PCR odpowiednia długość fali światła wzbudza związany barwnik.

Druga metoda wykorzystuje komplementarne, specyficzne dla sekwencji sondy oligonukleotydowe połączone z fluoroforem i cząsteczką wygaszającą.

Reakcja jest stale wystawiona na działanie światła o odpowiedniej długości fali, a cząsteczka wygaszająca absorbuje fluorescencję fluoroforu, gdy znajduje się blisko siebie. Polimeraza DNA odrywa fluorofor podczas rozciągania, zapobiegając wygaszaniu.

Metoda oparta na sondzie jest specyficzna, ponieważ dołącza się tylko do sekwencji docelowej. Natomiast metoda oparta na barwniku jest niespecyficzna i wiąże się ze wszystkimi dwuniciowymi DNA.

W obu przypadkach fluorescencja emitowana przez wzbudzony fluorofor jest wykrywana przez fotodetektory, które przekształcają odbierane sygnały na wyjście cyfrowe.

Cykl progowy lub Ct to liczba cykli PCR, w których fluorescencja osiąga określony poziom znacznie powyżej fluorescencji tła.

Cykl progowy jest odwrotnie proporcjonalny do ilości docelowego RNA w próbce początkowej — im niższy cykl progowy, tym większa ilość interesującego RNA.

Kwantyfikacja bezwzględna porównuje cykl progowy lub intensywność fluorescencji z krzywą wzorcową przygotowaną przy użyciu znanych stężeń DNA.

Alternatywnie, względna kwantyfikacja porównuje fluorescencję próbki z fluorescencją odniesienia. Metoda ta może być stosowana do porównywania zmian w ekspresji genów w różnych warunkach.