RACE – szybka amplifikacja końców cDNA

Pełnej długości cDNA nie zawsze uzyskuje się, gdy po raz pierwszy odkrywane są nowe transkrypty genu mRNA. Nieznane sekwencje na końcach matrycy mRNA mogą prowadzić do częściowej klonacji cDNA.

Sekwencja tych częściowych cDNA może być rozszerzona za pomocą techniki zwanej szybką amplifikacją końców cDNA lub RACE w celu uzyskania pełnego cDNA dla transkryptu.

W tej technice zakotwiczony PCR służy do klonowania brakującej sekwencji ze znanego miejsca wewnętrznego do końca 3' lub 5' mRNA.

W 3' RACE cDNA jest syntetyzowane z matrycy mRNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy i startera hybrydowego składającego się z sekwencji oligo-dT połączonej z unikalną sekwencją nukleotydową, zwaną kotwicą.

Oligo-dT wiąże ogon poli-A znajdujący się na końcu 3' dojrzałych mRNA, podczas gdy kotwiczna część startera dodaje unikalny zestaw nukleotydów przed sekwencją poli-T w nowo zsyntetyzowanej pierwszej nici cDNA.

Starter specyficzny dla genu lub GSP, który może sparować się ze znanym końcem sekwencji cDNA, jest używany do syntezy drugiej nici DNA. Nowe DNA jest denaturowane, a starter adaptacyjny, komplementarny do sekwencji kotwicznej, oraz GSP są używane w wielu rundach PCR w celu wypełnienia i amplifikacji brakującej sekwencji 3'.

W 5' RACE starter specyficzny dla genu wiąże koniec 3' mRNA podczas odwrotnej transkrypcji. Następnie stosuje się końcową deoksynukleotydylotransferazę w celu dodania ogona poli-A do końca 3' powstałego cDNA.

Po odwrotnej transkrypcji do syntezy komplementarnej nici stosuje się starter adapterowy z sekwencjami oligo dT i zakotwiczenia. Następnie starter specyficzny dla genu i starter adapterowy są używane do kopiowania i amplifikacji całej sekwencji cDNA.

W obu typach RACE starter adaptera może nadal wiązać i amplifikować cDNA poza celem.

W związku z tym przeprowadza się drugi cykl amplifikacji z zagnieżdżonymi starterami, które wiążą się za starterami z pierwszej rundy PCR. Zwiększa to wydajność specyficznych cDNA o pełnej długości.