15.12: Sekwencjonowanie Sangera

Sekwencjonowanie DNA jest podstawową techniką stosowaną w naukach biologicznych. Metodę tę można zastosować do szeregu zagadnień – od sekwencjonowania sklonowanego fragmentu DNA lub badania mutacji w genie po sekwencjonowanie całego genomu. Jednakże pomimo powszechnego obecnie stosowania sekwencjonowania, dopiero w 1977 roku Fredrick Sanger i jego współpracownicy opracowali metodę terminacji łańcucha w celu dekodowania sekwencji DNA. Polega na rozdzieleniu mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości za pomocą elektroforezy w żelu kapilarnym i odszyfrowaniu sekwencji DNA z powstałego elektroforegramu.

Wyzwania związane z sekwencjonowaniem Sangera

Sekwencjonowanie Sangera można zastosować jedynie do sekwencjonowania około 300–1000 bp DNA w jednej serii. Jakość sekwencji Sangera w miejscu wiązania startera, które tworzy pierwsze 15 do 40 nukleotydów w sekwencji, jest niska.

Współczesne zastosowania sekwencjonowania Sangera

Ze względu na swoją prostotę i niezawodność konwencjonalną technikę sekwencjonowania Sangera szybko zaadaptowano do metody półautomatycznej, aby uczynić ją dokładniejszą, niezawodniejszą i szybszą. Obecnie jest często używany do sekwencjonowania ukierunkowanego na małą skalę.

W przypadku niektórych eksperymentów lub diagnoz może być konieczne uzyskanie sekwencji nukleotydowej całego genomu organizmu, aby lepiej zrozumieć obecne geny lub allele, ich funkcję i związane z nimi choroby. Można to osiągnąć za pomocą sekwencjonowania DNA.

Dwie dobrze znane tradycyjne techniki sekwencjonowania DNA to metoda sekwencjonowania Sangera i metoda Maxama-Gilberta.

W sekwencjonowaniu Sangera - znanym również jako sekwencjonowanie łańcucha lub sekwencjonowanie dideoksynukleotydowe - czysty matrycowy DNA do sekwencjonowania jest amplifikowany PCR w obecności odpowiednich starterów, dNTP i zmodyfikowanych zasad, zwanych dideoksynukleotydami lub ddNTP.

Dideoksynukleotydy nie mają grupy hydroksylowej deoksynukleotydów, co ogranicza ich zdolność do tworzenia wiązań fosfodiestrowych z sąsiednimi nukleotydami.

Każdy dideoksynukleotyd jest również oznaczony inną etykietą fluorescencyjną, aby ułatwić jego wykrycie.

Pierwszym krokiem jest denaturacja matrycowego DNA do jednoniciowego DNA.

Następnie, gdy startery wiążą się z obszarem zainteresowania, polimeraza DNA zaczyna dodawać nowe nukleotydy do nici DNA i czasami zawiera dideoksynukleotyd zamiast deoksynukleotydu - co kończy amplifikację DNA.

Rezultatem są fragmenty DNA o różnej długości, z których każdy kończy się znakowanym dideoksynukleotydem.

Te fragmenty DNA są następnie uruchamiane na żelu kapilarnym w celu oddzielenia ich na podstawie rozmiaru, a widma emisyjne z każdego z tych fragmentów są analizowane za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania w celu rozszyfrowania sekwencji genetycznej pożądanego DNA.