32.6: Frakcjonowanie subkomórkowe

Homogenat otrzymany po lizie komórek zawiera różne organelle związane z błoną, które można dalej rozdzielić na czyste frakcje poprzez frakcjonowanie subkomórkowe. Izolaty te wykorzystuje się do badania specyficznych składników komórkowych, analizy zlokalizowanej aktywności białek, a nawet wykorzystuje się je w diagnostyce. Frakcjonowanie zwykle osiąga się za pomocą metod wirowania, przy czym najpowszechniejszymi jest wirowanie w gradiencie gęstości i wirowanie różnicowe.

Wirowanie różnicowe

Wirowanie różnicowe to stosunkowo prosta metoda oddzielania składników komórkowych na podstawie rozmiaru i gęstości. Wirowanie sekwencyjne ze wzrastającymi prędkościami (w zakresie od 10 000 x g do 150 000 x g) powoduje osadzanie składników o różnej wielkości. Ponieważ jednak wiele organelli może mieć podobną wielkość i gęstość, w wyniku tej metody zwykle powstają surowe frakcje.

Wirowanie w gradiencie gęstości:

Wysoko oczyszczone frakcje składników komórkowych można otrzymać poprzez rozdzielenie homogenatu w roztworze o gradiencie gęstości. Gradient gęstości przygotowuje się w probówce wirówkowej poprzez nakładanie warstw roztworów o rosnącej gęstości, takich jak coraz bardziej stężone roztwory sacharozy, z najgęstszą warstwą na dnie probówki. Takie gradienty stosuje się w wirowaniu strefowym w celu oddzielenia organelli komórkowych na podstawie ich wielkości i kształtu. Po odwirowaniu organelle sedymentują z różną szybkością, w zależności od ich współczynników sedymentacji, podczas przemieszczania się przez warstwy o różnej gęstości.

Alternatywnie, można również przygotować ciągły gradient gęstości poprzez mieszanie roztworów o różnych gęstościach w stopniowych proporcjach wzdłuż długości rurki. Podczas wirowania każdy składnik unieruchamia się w pozycji odpowiadającej jego gęstości – w pozycji równowagi. Dlatego metoda ta jest również nazywana sedymentacją równowagową lub pływającą. Zatem separacja składników komórkowych i cząsteczek opiera się na ich gęstości, a nie wielkości.

Frakcjonowanie subkomórkowe służy do uzyskania czystych frakcji różnych organelli komórkowych z lizatu komórkowego.

Dwie powszechnie stosowane metody frakcjonowania subkomórkowego to wirowanie różnicowe i wirowanie w gradionym przepływie gęstości.

Wirowanie różnicowe wykorzystuje wirowanie sekwencyjne przy stopniowo rosnących prędkościach w celu oddzielenia organelli na podstawie wielkości.

Najpierw próbka jest odwirowywana z niską prędkością około 400 do 600 x g w celu osadzenia dużych struktur, takich jak jądra i szczątki komórkowe.

Następnie supernatant jest wirowany z dużą prędkością w zakresie od 10 000 do 20 000 x g w celu uzyskania organelli osadowych, takich jak mitochondria, lizosomy i peroksysomy.

Kolejne cykle wirowania z prędkościami ponad 80 000 x g mogą oddzielać mikrosomy, frakcje błonowe, a nawet rybosomy.

Jednak wirowanie różnicowe nie może oddzielić organelli o bardzo zbliżonej wielkości lub gęstości, takich jak mitochondria, od peroksysomów.

W takich przypadkach wirowanie w gradiencie gęstości, bardziej czuła metoda, jest cennym narzędziem.

W tej metodzie wykorzystuje się gradienty gęstości wyznaczone za pomocą substancji chemicznych

takich jak sacharoza lub glicerol, aby rozdzielić organelle na odrębne warstwy na podstawie rozmiaru, kształtu lub gęstości w jednej probówce.