33.4: Mikroskopia immunofluorescencyjna

Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje fluorescencyjne chromofory zwane fluorochromami, które mogą pochłaniać energię ze źródła światła, a następnie emitować tę energię w postaci światła widzialnego. Fluorochromy obejmują substancje naturalnie fluorescencyjne (takie jak chlorofile) i barwniki fluorescencyjne, które są dodawane do próbki w celu uzyskania kontrastu. Barwniki takie jak czerwień teksańska i FITC są przykładami fluorochromów. Inne przykłady obejmują barwniki kwasu nukleinowego 4′,6′-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i oranż akrydynowy.

Mikroskop naświetla próbkę wzbudzeniem o krótkiej długości fali, takim jak światło ultrafioletowe lub niebieskie. Chromofory pochłaniają światło wzbudzające i emitują światło widzialne o dłuższych falach. Światło wzbudzające jest następnie odfiltrowywane (częściowo dlatego, że światło ultrafioletowe jest szkodliwe dla oczu), tak że tylko światło widzialne przechodzi przez soczewkę oka, tworząc obraz próbki w jasnych kolorach na ciemnym tle.

Mikroskopy fluorescencyjne mogą identyfikować patogeny, znajdować określone gatunki w środowisku lub znajdować lokalizacje określonych cząsteczek i struktur w komórce. Opracowano również metody pozwalające na odróżnienie komórek żywych od martwych na podstawie tego, czy pobierają one określone fluorochromy. Czasami na tej samej próbce stosuje się wiele fluorochromów, aby pokazać różne struktury lub cechy.

Jednym z najważniejszych zastosowań mikroskopii fluorescencyjnej jest immunofluorescencja, która służy do identyfikacji niektórych drobnoustrojów poprzez obserwację, czy wiążą się z nimi przeciwciała. (Przeciwciała to cząsteczki białek wytwarzane przez układ odpornościowy, które przyłączają się do określonych patogenów, aby je zabić lub zahamować). Technika ta ma dwa podejścia: bezpośredni test immunofluorescencyjny (DFA) i pośredni test immunofluorescencyjny (IFA). W DFA specyficzne przeciwciała (np. te, które są skierowane przeciwko wirusowi wścieklizny) są barwione fluorochromem. Jeśli próbka zawiera docelowy patogen, pod mikroskopem fluorescencyjnym można zaobserwować przeciwciała wiążące się z patogenem. Jest to pierwotne barwienie przeciwciałami, ponieważ wybarwione przeciwciała przyczepiają się bezpośrednio do patogenu.

W IFA przeciwciała drugorzędowe są barwione fluorochromem, a nie przeciwciałami pierwszorzędowymi. Przeciwciała drugorzędowe nie przyczepiają się bezpośrednio do organizmu, ale wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Gdy niebarwione przeciwciała pierwszorzędowe wiążą się z patogenem, można zaobserwować wiązanie fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych z przeciwciałami pierwszorzędowymi. W ten sposób przeciwciała drugorzędowe są przyłączone pośrednio do patogenu. Ponieważ wiele przeciwciał drugorzędowych może często przyłączać się do przeciwciała pierwszorzędowego, IFA zwiększa liczbę przeciwciał fluorescencyjnych przyłączonych do próbki, co ułatwia wizualizację jej cech.