Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Podsumowanie

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Streszczenie

Coraz bardziej oczywiste staje się, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. System elektroporacji Gene Pulser MXcell oraz bufor do elektroporacji Gene Pulser zostały opracowane specjalnie w celu transfekcji kwasów nukleinowych do komórek ssaków oraz komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne i macierzyste. Niniejszy materiał wideo demonstruje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, a następnie ich przygotowanie do elektroporacji w systemie MXcell. Proces rozpoczynamy od izolacji kości udowej i piszczelowej. Następnie pobierany jest szpik kostny z obu tych kości i tworzone są kultury. Wyhodowane komórki szpiku kostnego są następnie poddawane transfekcji i analizie.

Protokół

Pozyskiwanie szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych

1. Pierwszym krokiem procedury jest pobranie szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy w wieku od 6 do 12 tygodni (używamy myszy BALB/c, ale procedurę tę można przeprowadzić na dowolnym szczepie myszy). Na początek należy poddać mysz eutanazji poprzez inhalację CO₂ (nie będzie to pokazane). Następnie należy pobrać kości udowe i piszczelowe z tylnych kończyn każdego zwierzęcia. Potem, za pomocą żyletki, należy odciąć oba końce kości udowych, aby usunąć stawy biodrowe i kolanowe oraz odsłonić szpik.
2. W podobny sposób należy odciąć oba końce kości piszczelowych, aby usunąć obszary sąsiadujące z kolanem i kostką oraz odsłonić szpik.
3. Należy wziąć strzykawkę 3 mL z igłą o rozmiarze 26G i napełnić ją medium RPMI uzupełnionym o 10% FBS, penicylinę, streptomycynę i beta-merkaptoetanol (BME = 100 uM). Trzymając kość pęsetą nad szalką Petriego zawierającą medium RPMI, należy wprowadzić igłę strzykawki do jednego z końców kości i nacisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny. Igłę strzykawki można przesuwać w górę i w dół wewnątrz kości, aby wypłukać pozostałości szpiku.
4. Należy powtórzyć tę procedurę dla wszystkich kości, a następnie przystąpić do zakładania kultur.

Zakładanie kultur

1. Aby przygotować hodowle szpiku kostnego, kilkakrotnie pipetuj wypłukany szpik góra-dół, aby rozbić tkankę do postaci zawiesiny komórkowej.
2. Umieść filtr 70 µm na górze probówki stożkowej o pojemności 50 mL, a następnie przenieś zawiesinę komórkową na filtr.
3. Wypłucz szalkę Petriego raz medium RPMI, a następnie dodaj płuczkę do filtra 70 µm.
4. Używając gumowej końcówki tłoka strzykawki 1 mL, rozetrzyj fragmenty szpiku kostnego pozostałe na filtrze 70 µm.
5. Przemyj filtr raz medium RPMI.
6. Po przemyciu filtra odwiruj zawiesinę komórkową przy 1200 rpm przez 5 minut.
7. Przemyj osad komórkowy, resuspendując go w PBS.
8. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj otrzymujemy ~90 milionów komórek z kości jednej myszy (dwie kości udowe oraz dwie piszczelowe). Po policzeniu komórek odwiruj je ponownie przy 1200 rpm przez 5 minut.
9. Resuspenduj komórki w niewielkiej ilości RPMI i rozdziel je do kolb hodowlanych zawierających odpowiednią ilość RPMI, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 milion komórek per mL.
10. Dodaj cytokiny, aby promować rozwój interesującego Cię typu komórek. W tym przypadku dodaje się cytokinę interleukinę-3 (IL-3 = 10 ng/mL) w celu promowania rozwoju bazofili i mastocytów. Aby uzyskać bazofile, inkubuj przez 10 dni. W przypadku mastocytów inkubuj przez 5 tygodni. Podczas generowania mastocytów pożywkę oraz IL-3 należy wymieniać raz w tygodniu.
11. Oto obraz przedstawiający wygląd mastocytów tuż po wysianiu. Zdjęcie to demonstruje różnicowanie komórek szpiku w bazofile i mastocyty 10 dni po dodaniu interleukiny-3.
12. Po uzyskaniu pożądanego typu komórek przejdź do etapu elektroporacji.

 

Elektroporacja komórek

1. Aby rozpocząć etap elektroporacji, należy określić liczbę komórek w kolbie hodowlanej.
2. Komórki są zazwyczaj elektroporowane przy gęstości 10 milionów na mL, dlatego należy przenieść wymaganą liczbę komórek do probówek stożkowych i wirować je przy 1200 rpm przez 5 minut.
3. Po wirowaniu należy odpisać podłoże, przemyć komórki 1X PBS, a następnie ponownie wirować przy 1200 rpm przez 5 minut.
4. Należy odpisać PBS i dodać bufor do elektroporacji Bio-Rad Gene Pulser, aby przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 10 milionów komórek na mL.
5. Po resuspensji komórek należy dodać wybrany plazmidowy DNA do końcowego stężenia od 10 do 20 mikrogramów na mL.
6. Należy nalać alikwoty po 150 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do wybranych studzienek na 96-dołkowej płytce do elektroporacji.
7. Płytkę do elektroporacji należy umieścić w komorze płyty MXcell i zamknąć pokrywę.
8. Przed transfekcją komórek tuczawnych należy zaprogramować protokół elektroporacji w urządzeniu MXcell, chyba że stosowany jest protokół presetowany lub zapisany. W ramach eksperymentów optymalizacyjnych odkryliśmy, że najwyższa wydajność transfekcji komórek tuczawnych jest osiągana przy zastosowaniu protokołów impulsów prostokątnych. Zmienimy warunki elektroporacji na płytce, aby dostarczyć impulsy prostokątne o parametrach 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms oraz 350V/10ms przy 2000uF i 1000 omów. Po ustawieniu i wgraniu protokołu do urządzenia należy nacisnąć „Pulse”, aby przeprowadzić elektroporację komórek.
9. Po zakończeniu elektroporacji należy przenieść komórki na płytkę do hodowli tkankowych. Zazwyczaj każdą próbkę do elektroporacji o objętości 150 mikrolitrów przenosimy do studzienki w 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowych zawierającej 300 mikrolitrów RPMI (uzupełnionego o 10% FCS, penicylinę, streptomycynę i beta-merkaptoetanol) z dodatkiem 10 nanogramów na mL interleukiny-3. Komórki inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C, a następnie 24 godziny później wykonuje się analizę ekspresji i supresji.

Wyniki transfekcji

W filmie przedstawiono obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek po udanej elektroporacji z wykorzystaniem 20 µg/mL plazmidu GFP. Przy użyciu systemu do elektroporacji MXcell można uzyskać wydajność transfekcji na poziomie około 30%. System ten pozwala na modyfikację parametrów w celu maksymalizacji wydajności transfekcji przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek.

Dyskusja

Wraz z pojawianiem się coraz większej ilości informacji genomicznych i rozwojem nowych narzędzi, takich jak siRNA, wykorzystanie komórek istotnych fizjologicznie stało się coraz ważniejsze dla pogłębienia naszej wiedzy na temat szlaków chorobowych, oddziaływań białko-białko oraz transdukcji sygnału. Komórki pierwotne pozyskuje się bezpośrednio z tkanek lub płynów ustrojowych i hoduje in vitro. Komórki te można modyfikować na wiele sposobów, w tym poprzez wprowadzenie egzogennego materiału genetycznego. Coraz bardziej oczywiste staje się, że najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych jest elektroporacja.

Elektroporacja polega na poddawaniu komórek impulsom elektrycznym w celu przejściowego zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej, co umożliwia wprowadzenie egzogennych kwasów nukleinowych do wnętrza komórki. Ta metoda transfekcji może być optymalizowana w zależności od różnic między poszczególnymi typami lub liniami komórkowymi, dzięki czemu może być stosowana do transfekcji komórek tuczawnych, jak i każdej innej komórki pochodzącej z szpiku kostnego. Ponadto, w przeciwieństwie do transfekcji za pośrednictwem wirusów, elektroporacja nie nakłada ograniczeń na wielkość transfekowanego DNA ani nie wymaga rozbudowanych przygotowań. W porównaniu z transfekcją za pomocą lipidów, elektroporacja może być mniej toksyczna i nie prowadzi do uwięzienia transfekowanego kwasu nukleinowego w endosomach.

Firma Bio-Rad opracowała system elektroporacji MXcell specjalnie dla tych komórek. System MXcell pozwala na zmianę warunków w celu maksymalizacji wydajności transfekcji oraz przeżywalności komórek. Aby zoptymalizować wydajność transfekcji i zminimalizować śmierć komórek, można regulować i oceniać szereg parametrów elektroporacji, w tym napięcie, pojemność, oporność oraz długość impulsu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System do elektroporacji Gene Pulser MXcell	Bio-Rad	165-2670
Bufor do elektroporacji Gene Pulser	Bio-Rad	165-2677