Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Podsumowanie

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Streszczenie

Embrio kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach wczesnego rozwoju embrionalnego. Jego przezroczystość, łatwość dostępu i manipulacji czynią go idealnym narzędziem do badania formowania i wstępnego wzorowania układu nerwowego. W niniejszym filmie pokazano, jak przeszczepić tkankę organizatora do gospodarza, metodę, w której węzeł Hensena (organizator w embrionie kurczaka) jest przeszczepiany do kompetentnej egzodermu gospodarza. Przeszczep organizatora nakazuje pokrywającej go tkance naiwnej przyjęcie losu nerwowego za pośrednictwem sygnałów indukujących rozwój układu nerwowego. Mechanizm ten nazywany jest indukcją nerwową i stanowi pierwszy krok w formowaniu mózgu i rdzenia kręgowego u amniontów. Metodę tę stosuje się przede wszystkim do charakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek indukujących rozwój układu nerwowego u kurczaka. Wideo to demonstruje poszczególne etapy testu indukcji nerwowej; najpierw embrion dawcy jest eksplantowany i przypinany do szalki. Następnie przygotowuje się embrion gospodarza do hodowli New. Przeszczep jest wycinany i przeszczepiany do brzegu obszaru pellucida gospodarza. Gospodarz jest hodowany przez 18–22 godziny. Zestaw jest utrwalany i przygotowywany do dalszych zastosowań (np. hybrydyzacji in situ). Metodę tę pierwotnie opracowali Waddington^1,2i Gallera^3,4.

Protokół

I. Przegląd schematyczny:

W niniejszym materiale wideo przedstawiono poszczególne etapy badania indukcji neuronalnej w embrionie kurczaka. Najpierw embrion biorcy zostaje wyeksplantowany do nowego medium hodowlanego [NI1]. Następnie embrion dawcy zostaje wyeksplantowany do soli fizjologicznej, a węzeł Hensen’a (pełniący rolę „organizatora” u kurczaka) zostaje oznakowany fluorescencyjnym barwnikiem DiI [NI2]. Węzeł Hensen’a zostaje wycięty z embrionu dawcy [NI3] i przeszczepiony do embrionu biorcy [NI4, NI5]. Embrion biorcy jest następnie hodowany przez maksymalnie 22 hrs, po czym tkanka dawcy indukuje powstanie osi ektopowej w obszarze area opaca embrionu biorcy [NI6]. Po inkubacji embrion biorcy zostaje utrwalony i poddany fotoutlenianiu w obecności DAB: w wyniku tej reakcji chemicznej komórki pochodzące od dawcy, które przed fotoutlenianiem wykazują czerwoną fluorescencję w kanale FITC [NI7], stają się brązowe po reakcji z DAB [NI8]. Następnie embrion zostaje poddany hybrydyzacji in situ z markerem neuronalnym [NI8]; w obecności przeszczepu od dawcy w tkankach biorcy utworzyła się tkanka neuronalna. Tkanka ta przybiera kolor niebieski.

1: Przygotowanie zarodka biorcy do nowej hodowli

1. Niniejszy protokół testu indukcji neuronalnej rozpoczyna się od jaj inkubowanych do stadium Hamburgera i Hamiltona 3⁺ (lub HH3⁺). Jaja te były inkubowane w pozycji bocznej w inkubatorze wilgotnościowym przez 13 godzin.
2. Przygotować embrion gospodarza do hodowli New (kroki 3.1. do 5.5⁹).
3. Pokryć powierzchnię embrionu gospodarza 200 μl soli fizjologicznej. Ułatwi to późniejszy transfer i pozycjonowanie przeszczepu od dawcy.
4. Na koniec przykryć cały układ odwróconą szalką hodowlaną Falcon 35 mm.

2: Eksplantacja zarodka dawcy w soli fizjologicznej

1. Otwórz jajko, opukując skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty z całego obwodu. Usuń górną część skorupki i ją odrzuć.
2. Usuń gęste białko pęsetą, a następnie przechyl worek żółtkowy grubą pęsetą tak, aby embrion był skierowany ku górze.
3. Za pomocą precyzyjnych nożyczek wytnij kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Wyjmij embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu z PBS.
4. Za pomocą pęsety oddziel embrion dawcy od area pellucida.
5. Przenieś embrion dawcy do naczynia pokrytego Sylgardem, zawierającego PBS.

3: Etykietowanie, wycinanie i przeszczepianie graftu dawcy

1. Za pomocą wyciągacza mikroelektrod przygotować szklane mikropipety kapilarne 50 μl. Pod mikroskopem odciąć końcówkę mikropipety za pomocą precyzyjnej pęsety. Umieścić mikropipetę w szalce Petriego wyłożonej paskiem plasteliny.
2. Przygotować roztwór barwnika, który zostanie użyty do znakowania przeszczepu przed transplantacją: barwnik karbocyjaninowy DiI (perchloran 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine): Najpierw przygotować roztwór stokowy DiI w 1ml absolutnego etanolu w stężeniu 0.5%. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20C w ciemności. W łaźni wodnej ustawionej na 42°C zmieszać uprzednio ogrzane 40 μl roztworu stokowego DiI z 360μl 0.3M sacharozy. Temperatura łaźni wodnej jest niezbędna, aby zapobiec wytrącaniu się DiI i tworzeniu nierozpuszczalnych kryształów. Krótko odwirować roztwór w miniwirówce (przez 5-10 sekund). Roztwór DiI jest teraz gotowy do użycia.
3. Za pomocą szpilek entomologicznych unieruchomić embrion dawcy na dnie naczynia pokrytego Sylgardem.
4. Wypełnić mikropipetę roztworem DiI od tyłu. Wywierając delikatny nacisk za pomocą zestawu rurki aspiracyjnej, nanieść niewielką dawkę DiI na węzeł Hensena. Należy upewnić się, że cały węzeł Hensena został oznakowany.
5. Za pomocą mikropipety kapilarnej lub mikro skalpela wyciąć węzeł Hensena („organizer”, przeszczep dawcy).
6. Oznaczyć stronę brzuszna oraz koniec tylny przeszczepu karminem. Zapewni to właściwą orientację grzbietowo-brzuszną przeszczepu w kroku 4.3.
7. Za pomocą pipety Gilsona 200μl przenieść przeszczep do embrionu biorcy.

4: Mocowanie przeszczepu i hodowla embrionu gospodarza

1. Usunąć sól fizjologiczną z zarodka biorcy, upewniając się, że przeszczep pozostaje w bliskim sąsiedztwie miejsca biorcy.
2. Za pomocą pipety mikrokapilarnej lub noża do mikrodisekcji wykonać małe nacięcie (80-100μm) w obrębie granicy area pellucida/area opaca, na poziomie węzła Hensen’a zarodka biorcy.
3. Za pomocą pipety mikrokapilarnej lub noża do mikrodisekcji ustawić przeszczep tak, aby strona brzuszna była skierowana w stronę operatora, a koniec tylny znajdował się równolegle do odpowiadającego mu regionu w zarodku biorcy.
4. Usunąć pozostałą sól fizjologiczną i poddać zarodek biorcy hodowli New przez 81-22 hr (kroki 6.1 do 6.6⁹).
5. Następnie zarodek biorcy należy utrwalić przez noc w temperaturze 4°C (kroki 7.1 do 7.7⁹).

5: Fotoutlenianie przeszczepu pod wpływem fluorescencji

1. W dygestorium przygotować roboczy roztwór DAB w buforze Tris: rozpuścić substrat DAB (3,3’-diaminobenzydynę tetrahydrochlorek) w buforze Tris (100mM Tris-HCl, pH 7.4) do stężenia 500μg/ml; roztwór przechowywać w ciemności, w lodzie.
2. Przepłukać embrion dwukrotnie w PBS przez 5 mn każdorazowo oraz raz w buforze Tris przez 5 mn.
3. Przenieść embrion na szkiełko z wgłębieniem zawierające 1 ml buforu Tris.
4. Zastąpić bufor Tris 1.5 ml roztworu DAB. Zużytą końcówkę do pipety Eppendorf wyrzucić do pojemnika z 10% roztworem wybielacza w celu dekontaminacji DAB. Nałożyć szkiełko nakrywkowe na szkiełko z wgłębieniem.
5. W fluorescencji FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) ustawić ostrość obiektywu mikroskopu na przeszczep (komórki donora będą widoczne jako czerwone fluorescencyjne) i naświetlać fluorescencją FITC do momentu, aż wszystkie czerwone fluorescencyjne komórki staną się brązowe (następuje to w wyniku fotokonwersji fluorochromu DiI w nierozpuszczalne brązowe kryształy pod wpływem długości fali wzbudzenia FITC (488nm) w obecności DAB). Proces ten trwa od 20 mn do 2 godzin.
6. Po zakończeniu reakcji fotoutleniania usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety precyzyjnej. Przenieść embrion do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej PBTw (lub PBS z 0.1% Tween-20).
7. Zneutralizować DAB ze szkiełka nakrywkowego i szkiełka z wgłębieniem poprzez inkubację w 10% roztworze wybielacza.

6: Przygotowanie zarodka do hybrydyzacji in situ, fotografowania i sekcjonowania

1. Przeprowadzić hybrydyzację in situ (kroki 3.7 do 6.5⁹), inkubując zarodek wyłącznie z sondą znakowaną DIG.
2. Przejść do fotografowania (krok 8.2 ⁹) oraz sekcjonowania (kroki 8.3 i 8.4⁹).

Reprezentatywne wyniki

W poniższym przykładzie testu indukcji neuronalnej pokazano, że przeszczep dawcy indukuje ekspresję markera neuronalnego Tailless w tkance pochodzącej od biorcy. W tym konkretnym przykładzie oceniano nabycie zdolności indukcji neuronalnej przez regiony embrionalne, które normalnie nie posiadają właściwości „organizatora”: przeszczep dawcy pochodzi z embrionu, w którym region „organizatora” został chirurgicznie usunięty w stadium 3⁺. Po ablacji embrion dawcy rozwija się w kulturze New, aż do momentu zagojenia się ubytku i uformowania struktury przypominającej węzeł Hensen’a. Struktura ta zostaje następnie oznakowana barwnikiem DiI, wycięta z embrionu dawcy i przeszczepiona na granicę area pellucida/area opaca embrionu biorcy. Po inkubacji w kulturze New, obok embrionu biorcy tworzy się miniaturowa oś: oś ta składa się z pręta czerwonych komórek (pochodzących od dawcy) i struktury przypominającej głowę (pochodzącej od biorcy). Na obrazie (A) pokazano komórki pochodzące od dawcy, oznakowane DiI, przed utrwaleniem, obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym FITC. Komórki te proliferowały, tworząc miniaturową strunę grzbietową, która widoczna jest jako pręt czerwonych komórek. (B) Po fotokonwersji DiI komórki pochodzące od dawcy przybierają brązowy kolor. Przeszczep dawcy zindukował powstanie tkanki neuronalnej z organizmu biorcy: tkanka ta składa się z prekursorów mózgu, co zostało wykazane poprzez ekspresję markera Tailless w badaniu hybrydyzacji in situ [reprodukcja z 6].

Uwaga: W niniejszej procedurze zastosowano komórki znakowane DiI, aby odróżnić tkankę dawcy indukującą neurulację (czerwona/brązowa) od „neuralnej” tkanki pochodzącej od biorcy (niebieska). Zamiast stosowania przeszczepu dawcy pochodzącego od kurczaka i znakowanego DiI, niektórzy autorzy wykorzystują tkankę dawcy pochodzącą z embrionów przepiórki zamiast kurczaka [np. 6]. Ta alternatywna metoda również pozwala na odróżnienie tkanki dawcy od tkanki biorcy. W tym przypadku przeszczep (tkanka dawcy) pochodzi z jaj przepiórki zamiast z jaj kurzych. Po kroku 4.5 tkanka biorcy jest poddawana immunohistochemii całego preparatu z użyciem przeciwciała specyficznego dla tkanki przepiórki (QCP1), a kroki od 3.1 do 3.4 oraz od 5.1 do 5.7 są pomijane w protokole. Przykład tej alternatywnej procedury przedstawiono poniżej: W tym przypadku zastosowano tę samą procedurę eksperymentalną co w A,B, ale użyto tkanki dawcy pochodzącej od przepiórki (co wykazano poprzez ekspresję przeciwciała QCPN [brązowa]): Zregenerowany węzeł pochodzący z embrionu przepiórki zindukował ekspresję pan-neuralnego markera Sox2 u biorcy [przedrukowano z 6]:

Dyskusja

Niniejszy film prezentuje poszczególne etapy przeprowadzania testu indukcji neuronalnej. Test ten jest zasadniczo wykorzystywany do charakteryzacji potencjalnych cząsteczek indukujących neurony u kurczaka i w związku z tym może być stosowany w szerokim zakresie aplikacji, od embriologicznych mikromanipulacji ^{1-4; 6} po wyjaśnianie nowych kaskad sygnałowych ^7,8, a wszystko to w celu zrozumienia początkowego etapu formowania się mózgu i pozostałej części układu nerwowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jaja	Zwierzę	Charles River Laboratories	Premium Fertile	Zapłodnione, stadium HH3+ (14 h)
Stereomikroskop	Mikroskop	Leica Microsystems	MZ9.5 lub podobne
Inkubator do hybrydyzacji	Sprzęt	Robbins Scientific, SciGene	M1000	Stosować z odwróconą szalką Pyrex i 500 ml ddH2O2Zlewka
Automatyczny inkubator Marsh	Sprzęt	Lyon	RX
naczynie Pyrex
Zegarmistrz’szkło 50 mm	Narzędzie	VWR International	66112-060
Pierścienie szklane	Narzędzie	Zaplecze techniczne budynku		odciąć fragmenty rurki szklanej o grubości 4 mm (średnica zewnętrzna 27 mm, średnica wewnętrzna 25 mm). Nie polerować wykończeniowo.
Pinceta zakrzywiona (1)	Narzędzie	Nauki o mikroskopii elektronowej	72991-4C
Pinceta (2)	Narzędzie	Fine Science Tools	11002-13	zaobtuszowane za pomocą kamienia ostrzącego i 100 $\mu$l oleju mineralnego
Nożyczki precyzyjne	Narzędzie	Fine Science Tools	14161-10
Naczynia plastikowe	Narzędzie	Falcon BD	353001
Gruszka gumowa	Narzędzie	Nauki o mikroskopii elektronowej	70980
DiI	Odczynnik	Invitrogen	D-282
Zestaw rurki aspiracyjnej	Narzędzie	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Mikro–wyciągacz elektrod	Sprzęt	Sutter Instrument Co.	Mikropipeta do wypalania/brązowienia P-97 firmy Sutter Instruments
Kapilarna pipeta Pasteura	Narzędzie	Nauki o mikroskopii elektronowej	70950-12	zaokrąglenie krawędzi nad płomieniem
Komora hodowlana	Narzędzie	Pioneer Plastics	030C
Kapilara mikrokapilarna	Narzędzie	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK
Nóż do mikrosekcji	Narzędzie	Fine Science Tools	10056-12	Służy do nakłuwania jam przed hybrydyzacją in situ
piny minutowe o średnicy 0,2 mm	Narzędzie	Fine Science Tools	26002-20	Wymieszać utwardzacz w proporcji 1:9 z bazą; pozostawić przez noc w temperaturze 37°C
Węglan dwuetylowopirokarbonianu (depc)	Odczynnik	Nauki o mikroskopii elektronowej	15710
Utwardzacz i baza elastomeru silikonowego Sylgard 184		Dow Corning	0001986475	Wymieszać 1 część utwardzacza z 9 częściami bazy; pozostawić na noc w temperaturze 37°C
Węglan dwuetylowopirokarbonianu (depc)		Acros Organics	10025025	Dodać 1 ml DEPC do 1 l PBS; wstrząsnąć; autoklawować
16% PFA		Nauki o mikroskopii elektronowej	15710