Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Podsumowanie

Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.

Streszczenie

Suspensje jednokomórkowe są niezbędne w eksperymentach z zakresu separacji, analizy i hodowli komórek. Aby uniknąć żmudnej i często uciążliwej manualnej dysocjacji, dysocjator gentleMACS umożliwia bardzo efektywne rozdzielanie tkanek w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. Dysocjator gentleMACS pozwala na optymalną dysocjację śledziony myszy, łącząc oszczędność czasu i standaryzację z bezpieczeństwem użytkownika. Niniejszy film opisuje sposób dysocjacji śledzion myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS – zautomatyzowanego urządzenia laboratoryjnego, które mechanicznie rozdrabnia tkanki przy użyciu specjalnych probówek w celu uzyskania żywotnych suspensji komórkowych. Po dysocjacji śledziony są filtrowane, wirowane i resuspendowane do dalszych zastosowań.

Protokół

Wprowadzenie do aparatury

1. Tkankę delikatnie dysocjuje się za pomocą probówek C Tubes (violet), aby uzyskać żywe zawiesiny pojedynczych komórek.
2. Do dysocjacji komórek stosuje się bufor PBS/BSA EDTA. Bufor przygotowuje się poprzez dodanie 1 części roztworu zapasowego BSA do 20 części roztworu płuczącego autoMACS zawierającego EDTA.
3. Stosuje się filtry MACS Pre-Separation Filters, aby próbki dysocjowanej tkanki były wolne od wszystkich skupisk komórek, co sprzyja skutecznej separacji MACS i późniejszej analizie.

Dysocjacja komórek śledziony

1. Całe śledziony są dysocjowane do zawiesin pojedynczych komórek splenocytów przy użyciu dysocjatora gentleMACS Dissociator.
2. Aby rozpocząć procedurę, należy napełnić probówkę C Tube objętością buforu odpowiednią do masy śledzion. Zdrowa śledziona młodej dorosłej samicy myszy BALB/c waży około 80-120 mg. Każde 1 do 2 śledzion o takiej masie wymaga 3 mL buforu. Śledziony starszych zwierząt lub zwierząt z infekcjami są często większe i muszą być ważone w buforze. Objętości buforu należy odpowiednio przeskalować. Nie należy przekraczać całkowitej objętości buforu 10 mL.
3. Do probówki C Tube zawierającej 3 mL buforu należy dodać wypreparowaną śledzionę.
4. Należy upewnić się, że nakrętka probówki C Tube jest szczelnie zamknięta, a następnie przymocować probówkę C Tube do dysocjatora nakrętką skierowaną w dół.
5. Włączyć dysocjator. Dla 1-2 śledzion należy wybrać program m_spleen_01. Program potrwa 56 sekund. Jeśli liczba śledzion jest większa, należy użyć programu m_spleen_04; program ten można stosować dla masy tkanki śledziony do 720 mg.
6. Po zakończeniu programu natywna tkanka śledziony zostaje zdysocjowana do zawiesiny splenocytów.
7. Całą zawiesinę komórkową należy odwirować przy 300×g w temperaturze pokojowej przez około 30 s. Zapewni to oczyszczenie rotora i stojana ze wszystkich komórek, które zostaną zebrane na dnie probówki C Tube.
8. Próbkę należy pobrać przez otwór z septem w nakrętce probówki C Tube za pomocą pipety o objętości 1000 µL.

Krok filtracji

1. Aby rozpocząć etap filtracji, nanieś dysocjowaną tkankę na filtr do wstępnej separacji lub sitko komórkowe o rozmiarze porów 30 µm. Sitko powinno być dopasowane do probówki 15 mL w przypadku 1-2 śledzion, lub do probówki 50 mL w przypadku więcej niż 2 śledzion.
2. Pozostaw zawiesinę komórkową do przelania. Następnie wypłucz filtr, dodając 5 mL buforu.
3. Następnie odwiruj probówkę z zawiesiną komórkową przy 300xg w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zebrać wszystkie splenocyty w postaci osadu komórek śledziony.
4. Po uzyskaniu osadu dysocjowanych splenocytów należy odessać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości buforu.

Dysocjacja śledziony z wykorzystaniem systemu gentleMACS Dissociator pozwala na uzyskanie wysokiego odsetka żywych splenocytów, co zostało wykazane za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem analizatora MACSQuant. Martwe komórki są barwione jodeczkiem propidyny. W przedstawionym przykładzie wykres kropkowy rozpraszania światła w przód i pod kątem (forward side scatter) przedstawia przygotowane splenocyty.

Dyskusja

Aby uniknąć żmudnej i często bolesnej manualnej dysocjacji, dysocjator gentleMACS umożliwia bardzo efektywne rozdzielanie tkanek w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. Procedura dysocjacji tkanek jest łagodna dla komórek i pozwala na uzyskanie zawiesin komórkowych o wysokim stopniu żywotności. Dysocjator gentleMACS w połączeniu z probówkami C Tubes został zaprojektowany do przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek z różnych tkanek. Instrument jest wyposażony w szereg predefiniowanych programów do dysocjacji śledziony, wątroby, płuc lub tkanki nerwowej myszy. Gama programów i protokołów będzie stale rozszerzana o kolejne rodzaje tkanek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw startowy gentleMACS™	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
Probówki C (C Tubes)	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
Probówki 13 mL	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
Roztwór płuczący autoMACS™	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
Roztwór zapasowy BSA MACS®	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Filtry do wstępnej separacji	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Analizator MACSQuant	Miltenyi Biotec	130-092-197
Roztwór jodku propidyny	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx