Wykorzystanie rotarod jako metody jakościowej analizy chodu u szczura

Podsumowanie

Test rotarod jest wykorzystywany do oceny stanu motorycznego w ruchu chodu u szczurów w modelu hemi-Parkinsona.

Streszczenie

Szybka analiza wideo szczegółów ruchu może dostarczyć informacji na temat jakościowych aspektów chodu. Podczas poruszania się na rotorodzie zwierzęta pozostają w przybliżeniu w tym samym miejscu, wykonując powtarzalne ruchy stawiania kroków. W związku z tym zadanie to stanowi bogate źródło informacji o szczegółach ruchów stóp podczas chodzenia. Obiektami badań były szczury w modelu hemi-Parkinsona, otrzymane poprzez wstrzyknięcie 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) do prawego pęczka prążkowia czarnej w celu wyczerpania dopaminy (DA) w układzie prążkowia czarnej. Niniejszy raport przedstawia ilustrację analizy wideo zwierząt, które wcześniej były filmowane z perspektywy przedniej, bocznej i tylnej podczas chodzenia (15). Skale ocen oraz analiza klatka po klatce zapisów wideo zachowań krokowych wykazały, że u szczurów w modelu hemi-Parkinsona występowały przewlekłe zaburzenia postawy oraz funkcji kończyn po stronie przeciwległej do wyczerpania DA. Kończyny przeciwległe w mniejszym stopniu uczestniczyły w inicjowaniu i podtrzymywaniu napędu niż kończyny jednostronne. Deficyty te, będące następstwem jednostronnego wyczerpania DA, wykazują, że rotorod jest użytecznym narzędziem do analizy ruchów krokowych.

Protokół

Aparat do testu rotarod

Rotorod stanowił obrotowy cylinder o średnicy 4 cm, zamocowany 35 cm nad ziemią i osłonięty przezroczystym pleksiglasem. Cylinder rotorodu był pokryty teksturowaną powłoką gumową, która ułatwia przyczepność. Podłoże aparatu wyłożone było warstwą pianki, aby zapobiec obrażeniom zwierząt podczas upadku. Napęd do obrotu rotorodu zapewniał niewielki silnik elektryczny za pomocą gumowego paska. Rotorod ustawiono tak, aby wykonywał jeden pełny obrót co 5 s.

Nagrania wideo i kinematyka

Do filmowania zwierząt wykorzystano szybką cyfrową kamerę wideo z czasem naświetlania wynoszącym 1/1000 sekundy. Nagrano widoki z przodu, z boku oraz z tyłu podczas chodzenia zwierzęcia na rotorodzie. W celu zapewnienia odpowiedniego oświetlenia podczas rejestracji zastosowano dwuramienne źródło zimnego światła Nikon MII oraz jeden zestaw światłowodów. Nagrania analizowano klatka po klatce za pomocą rejestratora Sony DSR 20 DV CAM. Klatki wideo przechwycono przy użyciu grabbera wideo i komputera Macintosh.

Procedura testowa i analiza

W celu oceny różnic w ruchach chodu szczurów z grupy 6-OHDA i grupy kontrolnej, dwa niezależnych obserwatorów, nieznających warunków eksperymentalnych, przeanalizowały nagrania wideo z dni 15–30 po operacji (moment, w którym spodziewano się w dużej mierze pełnego ustąpienia ewentualnej rekonwalescencji po uszkodzeniu). Uszkodzenie nigrostriatalne 6-OHDA wywołano w prawej półkuli, co doprowadziło do trwałych upośledzeń lewej przedniej i tylnej kończyny. Opracowano skalę ocen służącą do oceny postawy szczurów oraz ruchów stawiania kroków kończynami przednimi (Whishaw et al., 2003). Oceniano pięć komponentów kroku:

1. postawa, ocena postawy została dokonana poprzez zbadanie pozycji szczura na bębnie;
2. podniesienie i zwolnienie, część cyklu kroku, w której łapa została uniesiona z bębna;
3. przeniesienie, część cyklu kroku, w której kończyna była utrzymywana nad bębnem podczas ruchu szczura do przodu;
4. wysunięcie, część zasięgu, w której kończyna została wyciągnięta w celu ponownego nawiązania kontaktu z bębnem; oraz
5. postawienie, podczas którego łapa została ponownie postawiona na bębnie.

Do zdefiniowania prawidłowego ruchu wykorzystano następujące kryteria:

• Postawa: Ciało szczura było zorientowane nad bębnem z uniesioną głową.
• Uniesienie i zwolnienie: Bark, łokieć i nadgarstek są zgięte, co powoduje uniesienie łapy z powierzchni bębna.
• Przenoszenie: Łapa jest utrzymywana nad powierzchnią bębna, palce są lekko zgięte, a ich końcówki znajdują się na linii środkowej ciała. Przesunięcie: Kończyna jest wyciągnięta do przodu, a palce poruszają się z pozycji półzgiętej do pozycji wyprostowanej i otwartej.
• Osadzenie: Kończyna jest wyprostowana w barku, łokciu i nadgarstku, a palce są rozwarte, aby postawić łapę z przodu na powierzchni bębna, przy czym palec 2 (drugi palec od linii środkowej) znajduje się mniej więcej w centrum ciała szczura.

Każdy ruch oceniano w 3-stopniowej skali: 1 = ruch przypominał ruch szczura kontrolnego, 0,5 = ruch wydawał się lekko nieprawidłowy oraz 0 = ruch był wyraźnie nieprawidłowy (Whishaw et al., 2003). Skalę tę wykorzystano następnie do oceny pięciu ruchów stawiania kroków u każdego szczura w 1., 3., 5., 7., 9. i 15. dniu po operacji. Wyniki z pięciu pomiarów uśredniano dla każdego szczura w każdym dniu, a następnie poddano analizie ANOVA z dniem jako pomiarem powtarzanym.

Przegląd chodu na rotarodzie u szczurów z grupy 6-OHDA oraz kontrolnej

Skalę oceny ruchu zastosowano podczas sesji testowych po operacji w celu jakościowej analizy ruchu. W trakcie sesji testowych grupa z uszkodzeniem 6-OHDA otrzymała istotnie niższe wyniki niż grupa kontrolna, F(1,8)=33.2, p<0.001, jednak nie stwierdzono istotnego wpływu dnia testu ani istotnej interakcji między grupą a dniem testu. Następnie wyniki stawiania kroków przeanalizowano oddzielnie, przyjmując kończynę przednią jako zmienną (dla szczurów z uszkodzeniem 6-OHDA: kończyna przednia kontralateralna względem uszkodzenia w porównaniu z kończyną przednią ipsilateralną względem uszkodzenia; dla szczurów kontrolnych: lewa łapa w porównaniu z prawą łapą). Odnotowano istotny wpływ kończyny przedniej, F(1,40)=15.8, p<0.01, oraz istotną interakcję między grupą a kończyną przednią, F(1,40)=15.0, p<0.01. Dalsze testy t wykazały, że kończyna przednia kontralateralna względem uszkodzenia w grupie 6-OHDA otrzymała istotnie niższe wyniki niż kończyna przednia ipsilateralna względem uszkodzenia lub kończyny przednie szczurów kontrolnych, które nie różniły się między sobą. Aby ustalić, które elementy ruchu przyczyniły się do niskich wyników uzyskanych przez grupę 6-OHDA, pomiary postawy oraz poszczególne komponenty cyklu stawiania kroków dla kończyn przednich ipsilateralnych i kontralateralnych grupy 6-OHDA porównano z wartościami uzyskanymi u szczurów kontrolnych. Grupa 6-OHDA różniła się pod względem postawy oraz wszystkich komponentów stawiania kroków wykonywanych przez kończynę kontralateralną, natomiast nie różniła się w żadnym z komponentów kończyny ipsilateralnej (p<0.05).

 

Jakościowe i opisowe różnice w postawie u szczurów kontrolnych oraz szczurów z podaniem 6-OHDA

U szczura kontrolnego głowa znajduje się w pozycji poziomej, a podtrzymujące go kończyny przednie i tylne obejmują bęben, tworząc łuk wspierający. Szczury po podaniu 6-OHDA zazwyczaj poruszają się z głową opuszczoną, przy czym ich uszkodzone kończyny przednie (skierowane w stronę obserwatora) są ustawione bliżej siebie i wyżej na powierzchni bębna niż kończyny przeciwległe lub kończyny szczurów kontrolnych (patrz wideo dla szczura kontrolnego z wynikiem „1” za postawę oraz zwierzęcia z uszkodzeniem 6-OHDA z wynikiem „0”). Zazwyczaj nieprawidłowości w postawie można zauważyć na pierwszy rzut oka po względnym położeniu głowy szczura.

Kroczenie przednimi kończynami

W sekwencji kontrolnej przednia kończyna krocząca jest unoszona poprzez zgięcie stawu ramiennego, łokciowego i nadgarstkowego. Podczas unoszenia kończyny palce są lekko zgięte, a kończyna jest unoszona wysoko ponad powierzchnię bębna. Gdy kończyna jest wysuwana, następuje wyprost w stawach ramiennych, łokciowych i nadgarstkowych, a podczas jej stawiania palce są wyprostowane i rozwarte. W porównaniu z szczurami kontrolnymi, amplituda wszystkich komponentów kończyny przeciwstawnej do zmiany u szczurów z uszczuploną zawartością DA jest osłabiona. Kończyna opuszcza bęben później, jest unoszona w mniejszym stopniu i wysuwana na krótszy dystans niż przednia kończyna kontrolna. Dodatkowo, podczas unoszenia kończyny palce są silniej zgięte, a podczas stawiania kończyny palce są w mniejszym stopniu wyprostowane i rozwarte niż u szczura kontrolnego. Przednia kończyna kontrolna jest unoszona, gdy osiągnie górną krawędź bębna, nadgarstek ulega zgięciu, aby unieść łapę w górę i do przodu, a następnie nadgarstek prostuje się podczas wysuwania kończyny. W przeciwieństwie do tego, przednia kończyna przeciwstawna do zmiany u szczura po podaniu 6-OHDA jest przesuwana dalej w kierunku ogonowym przez ruch bębna i w związku z tym opuszcza go później, przy wciąż wyprostowanym nadgarstku. Zgięcie nadgarstka wydaje się być bierne i następuje w momencie, gdy palce są przesuwane do tyłu przez ruch bębna, a gdy przednia kończyna jest przesuwana do przodu, łapa i przedramię nie są wyraźnie uniesione nad powierzchnię bębna. Przednia kończyna szczura kontrolnego wysuwa się daleko do przodu, a palce rozwierają się podczas wysuwania kończyny. Podczas stawiania kończyny odbywa się to ruchem arpeggio, w którym palec 5 najpierw styka się z powierzchnią bębna, a następnie kolejno palce 4, 3 i 2. W przeciwieństwie do tego, kończyna szczura po podaniu 6-OHDA jest w mniejszym stopniu unoszona i wyprostowana, palce są mniej wyprostowane i stykają się z powierzchnią bębna niemal jednocześnie, powodując „klasnięcie”. Materiał wideo przedstawia ruchy kroczące przedniej kończyny u zwierzęcia kontrolnego, które zostały ocenione jako „1”, oraz ruchy kroczące przedniej kończyny u zwierzęcia z uszkodzeniem wywołanym 6-OHDA, które zostały ocenione głównie jako „0”.

Kroczenie kończynami tylnymi

Odnotowano również zaburzenia w kończynach tylnych po stronie przeciwległej do uszkodzenia u szczurów po podaniu 6-OHDA. Gdy tylna kończyna kontrolna porusza się do tyłu, wydaje się, że opiera się o obracający się bęben, a podczas tego ruchu palce obracają się na zewnątrz. Gdy kończyna przesuwa się do przodu, stopa jest wychylana na zewnątrz. Tylna kończyna szczura 6-OHDA porusza się bezpośrednio do tyłu wraz z obrotem bębna i, jeśli w ogóle, obraca się lekko do wewnątrz. Gdy kończyna przesuwa się do przodu, stopa jest niesiona bezpośrednio przed siebie. Stopa szczura kontrolnego wychyla się na zewnątrz, a podczas jej wysuwania palce są uniesione wyżej niż kostka i ulegają wyprostowi. Podczas stawiania stopy przez szczura kontrolnego palec 5 styka się z powierzchnią bębna jako pierwszy, a ciężar rozkłada się na palcach i podeszwę. W przeciwieństwie do tego, palce szczura 6-OHDA są zgięte podczas przenoszenia kończyny, a stawianie stopy odbywa się bez ruchu sekwencyjnego (typu arpeggio). Palce szczura kontrolnego są odrywane w odwróconym wzorze sekwencyjnym, gdzie palec 5 jest unoszony jako pierwszy, a palec 1 jako ostatni. Ruch ten był nieobecny u szczura z uszkodzeniem 6-OHDA, podczas gdy kostka utrzymywała zgiętą postawę podczas ruchu przenoszenia. Ponownie, ruchy wysuwania kończyny u szczura 6-OHDA są osłabione: kończyna jest w mniejszym stopniu rotowana na zewnątrz, mniej uniesiona i wysunięta w mniejszym zakresie niż u szczura kontrolnego. Podczas stawiania palców przez szczury kontrolne są one wyprostowane i rozwarte w taki sposób, że palec 5 skierowany jest bocznie względem ciała szczura. Palec 5 styka się z bębnem jako pierwszy, a następnie pozostałe palce, tak że szczur opiera swój ciężar na końcówkach palców. U szczura 6-OHDA palce są w pewnym stopniu zgięte podczas przenoszenia stopy do przodu, palce znajdują się niżej w płaszczyźnie poziomej względem kostki, a podczas stawiania stopy na bębnie występuje mniejsze rozwarcie palców. Długość kroku jest również nieco krótsza niż u szczurów kontrolnych. Aby ilościowo określić różnice między ruchami tylnych kończyn kontrolnych a kończynami szczurów 6-OHDA, komponenty uniesienia i oderwania, przenoszenia, wysuwania oraz stawiania oceniano w skali 3-stopniowej, podobnie jak w przypadku kończyn przednich. Pomiary wykonano na podstawie nagrań wideo z 20. dnia po operacji, a dla każdego szczura oceniono trzy cykle kroku. Odnotowano istotne różnice między grupami, F(1,8)=47.6, p<0.001. Następcze testy t dla poszczególnych komponentów wykazały, że wszystkie komponenty u szczurów kontrolnych otrzymały istotnie wyższe oceny niż komponenty u szczurów 6-OHDA. Wideo przedstawia ruchy krokowe tylnej kończyny u zwierzęcia kontrolnego, które zostały ocenione na „1”. Ruchy krokowe tylnej kończyny u szczura 6-OHDA pokazane na wideo zostały ocenione głównie na „0”.

Dyskusja

Celem niniejszego badania było sprawdzenie, czy test rotorodu służący do oceny sprawności lokomocyjnej gryzoni może być wykorzystany do jakościowej oceny postawy, stawiania kroków przednimi oraz tylnymi kończynami u szczurów z uszkodzeniami układu nerwowego. Do analizy wykorzystano nagrania wideo szczurów z jednostronną deplecją DA oraz szczurów kontrolnych, zarejestrowane z widoku przedniego, bocznego i tylnego. Skala oceny postawy i ruchów przednich kończyn wykazała, że ruchy stawiające kroki były chronicznie upośledzo...