Zastosowanie Rotorodu jako metody analizy jakościowej chodzenia u szczurów

Podsumowanie

Test wirnika służy do oceny stanu motorycznego w ruchu chodu szczurów analogicznych do półprzewodnika Parkinsona.

Streszczenie

Szybka wideoanaliza szczegółów ruchu może stanowić źródło informacji o jakościowych aspektach ruchów chodu. Podczas chodzenia po rotorodze zwierzęta pozostają mniej więcej w tym samym miejscu, wykonując powtarzające się ruchy stąpania. Tym samym zadanie stanowi bogate źródło informacji o szczegółach ruchów krokowych stóp. Badanymi były szczury analogiczne do hemi-Parkinsona, wytwarzane przez wstrzyknięcie 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) do prawego pęczka nigrostriatal w celu wyczerpania dopaminy nigrostriatal (DA). Niniejszy raport zawiera ilustrację analizy wideo zwierząt, które wcześniej były filmowane z przodu, z boku i z tyłu podczas chodzenia (15). Skale ocen i odtwarzanie klatka po klatce zapisów wideo zachowań krokowych wykazały, że szczury z półlekiem Parkinsona były chronicznie upośledzone pod względem postawy i używania kończyn w przeciwieństwie do zubożenia DA. Kończyny przeciwległe w mniejszym stopniu uczestniczyły w inicjowaniu i podtrzymywaniu napędu niż kończyny ipsilateralne. Te deficyty wtórne do jednostronnego zubożenia DA pokazują, że wirnik stanowi zadanie użytkowe do analizy ruchów krokowych.

Protokół

Aparat do chodzenia z wirnikiem

Wirnik był obracającym się cylindrem o średnicy 4 cm, umocowanym 35 cm nad ziemią i otoczonym przezroczystą pleksiglasem. Cylinder wirnika został pokryty teksturowaną powłoką gumową, która ułatwia przyczepność. Podłoga aparatu została pokryta warstwą pianki, aby zapobiec urazom podczas upadku zwierząt. Mały silnik elektryczny zapewniał moc do obracania wirnika za pomocą gumowego paska. Wirnik był ustawiony tak, aby obracał się raz na 5 s.

Nagrania wideo i kinematyka

Do filmowania zwierząt użyto szybkiej cyfrowej kamery wideo, której czas otwarcia migawki wynosił 1000 sekund. Widoki z przodu, z boku i z tyłu zostały sfilmowane, gdy zwierzę chodziło po wirniku. Zastosowano dwuramienne źródło zimnego światła firmy Nikon, MII oraz jeden zestaw lamp światłowodowych, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie podczas nagrywania. Taśmy były analizowane klatka po klatce za pomocą decka Sony DSR 20 DV CAM. Klatki wideo zostały przechwycone za pomocą frame grabbera i komputera Macintosh.

Procedura testowa i analiza

W celu oceny różnic między ruchami chodu szczurów 6-OHDA i kontrolnych, zapisy wideo z dni pooperacyjnych 15 - 30 (po tym, jak można oczekiwać, że powrót do zdrowia po zmianie będzie w dużej mierze całkowity) zostały zbadane przez dwóch niezależnych obserwatorów ślepych na warunki eksperymentalne. Zmiana nigrostriatalna 6-OHDA została wywołana w prawej półkuli, co spowodowało trwałe upośledzenie lewej kończyny przedniej i tylnej. Opracowano skalę ocen do oceny postawy szczurów i ruchów krokowych kończyn przednich (Whishaw i in., 2003). Oceniono pięć elementów stepowania

1. : postawa, ocena postawy została dokonana poprzez zbadanie pozycji szczura na bębnie;
2. podnoszenie i puszczanie, część cyklu krokowego, w której łapa została podniesiona z bębna;
3. przenoszenie, część cyklu krokowego, w której kończyna była trzymana nad bębnem, gdy szczur poruszał się do przodu;
4. postęp, część zasięgu, w której kończyna została wysunięta w celu odzyskania kontaktu z bębnem; i
5. umieszczenie, w którym łapa została umieszczona z powrotem na bębnie.

Następujące kryteria zostały użyte do zdefiniowania normalnego ruchu:

• Postawa: Ciało szczura było zorientowane nad bębnem z głową podniesioną do góry.
• Podnieś i puść: Ramię, łokieć i nadgarstek są zgięte, podnosząc łapę od powierzchni bębna.
• Unieść: Łapa jest trzymana nad powierzchnią bębna, palce są luźno zgięte, a końcówki palców są wyśrodkowane na linii środkowej ciała. Postęp: Kończyna jest wysunięta do przodu, a palce przesuwają się z pozycji półzgiętej do pozycji wyprostowanej i otwartej.
• Umieszczenie: Kończyna jest wyprostowana na ramieniu, łokciu i nadgarstku, a palce są otwierane, aby ustawić łapę do przodu i na powierzchni bębna, przy czym cyfra 2 (druga cyfra od linii środkowej) znajduje się mniej więcej pośrodku ciała szczura.

Każdy ruch był oceniany w 3-punktowej skali: 1=/ruch przypominał ruch szczura kontrolnego, 0.5=/ruch wydawał się nieco nienormalny, a 0=/ruch był wyraźnie nienormalny (Whishaw et al., 2003). Ta skala oceny została następnie wykorzystana do oceny pięciu ruchów krokowych każdego szczura w dniach pooperacyjnych 1, 3, 5, 7, 9 i 15. Wyniki z pięciu pomiarów zostały uśrednione dla każdego szczura każdego dnia, a wyniki poddano ANOVA z dniami jako powtarzającym się pomiarem.

Przegląd chodzenia wirnika u szczurów 6-OHDA i kontrolnych

Skala oceny ruchu została zastosowana do sesji testów pooperacyjnych w celu jakościowej analizy ruchu. Podczas sesji testowych grupa ze zmianą 6-OHDA otrzymała znacznie niższe wyniki niż grupa kontrolna, F(1,8)=33,2, p<0,001, ale nie było znaczącego wpływu dnia testowego, ani nie było znaczącej interakcji grupa po dniu testu. Wyniki kroków były następnie oddzielnie analizowane z kończyną przednią jako zmienną (dla szczurów 6-OHDA kończyna przednia przeciwległa do zmiany, a kończyna przednia ipsilateralna do zmiany; dla szczurów kontrolnych, lewa łapa kontra prawa łapa). Stwierdzono istotny wpływ kończyny przedniej, F(1,40)=15,8, p<0,01, oraz stwierdzono istotną interakcję grupy według kończyny przedniej, F(1,40)=15,0, p<0,01. Kontrolne testy t wykazały, że kończyna przednia przeciwległa do uszkodzenia w grupie 6-OHDA otrzymała znacznie niższe wyniki niż kończyna przednia ipsilateralno-szlazyjna lub kończyny przednie szczurów kontrolnych, które nie różniły się. W celu określenia, które składniki ruchu przyczyniły się do słabych wyników uzyskanych przez grupę 6-OHDA, pomiary postawy i poszczególne składniki cyklu krokowego z ipsilateralnych i przeciwległych kończyn przednich grupy 6-OHDA porównano z wartościami uzyskanymi od szczurów kontrolnych. Grupa 6-OHDA różniła się postawą i wszystkimi elementami krokowymi wykonanymi przez kończynę przeciwległą, ale nie zawierała żadnego z elementów kończyny ipsilateralnej (p<0,05).

 

Jakościowe i opisowe różnice w postawie u szczurów kontrolnych i 6-OHDA

U szczura kontrolnego głowa jest utrzymywana w pozycji poziomej, a podtrzymujące kończyny przednie i tylne stoją okrakiem na bębnie, tworząc łuk podtrzymujący. Szczury 6-OHDA zazwyczaj chodziły z głową w dół, z upośledzonymi kończynami przednimi (skierowanymi w stronę widza) ustawionymi bliżej siebie i wyżej na powierzchni bębna, niż miało to miejsce w przypadku kończyn ipsilateralnych lub kończyn szczurów kontrolnych (zobacz wideo dla szczura kontrolnego z wynikiem "1" za postawę i zwierzęcia ze zmianą 6-OHDA z wynikiem "0"). Zazwyczaj nieprawidłowość postawy można dostrzec na pierwszy rzut oka z względnej pozycji głowy szczura.

Krok kończyny przedniej

W sekwencji kontrolnej, kończyna przednia jest podnoszona poprzez zginanie ramienia, łokcia i nadgarstka. Gdy kończyna jest podnoszona, palce są luźno zgięte, a kończyna jest unoszona znacznie ponad powierzchnię bębna. Kiedy kończyna jest wysunięta, jest prostowana w ramionach, łokciu i nadgarstku, a po jej umieszczeniu palce są wydłużone i otwarte. W porównaniu ze szczurami kontrolnymi, amplituda wszystkich składników szczurów zubożonych w DA przeciwlegle do kończyny uszkodzonej jest osłabiona. Kończyna później zwalnia bęben, jest mniej unoszona i jest wysunięta na krótszą odległość niż kontrolna kończyna przednia. Ponadto, gdy kończyna jest podniesiona, palce są bardziej zgięte, a kiedy kończyna jest umieszczona, palce są wysuwane i otwierane mniej niż u szczura kontrolnego. Kontrolna kończyna przednia jest podnoszona, gdy dotrze do górnej części bębna, nadgarstek jest zgięty, aby podnieść łapę w górę i do przodu, a nadgarstek jest prostowany w miarę posuwania się kończyny. W przeciwieństwie do tego, kończyna przednia szczura 6-OHDA przeciwległa do uszkodzenia jest przenoszona dalej doogonowo przez ruch bębna, a zatem uwalnia się później, gdy nadgarstek jest nadal wyprostowany. Zgięcie nadgarstka wydaje się być bierne i występuje, gdy palce są przenoszone do tyłu przez ruch bębna, a gdy kończyna przednia jest wysunięta do przodu, łapa i przedramię nie są wyraźnie uniesione nad powierzchnią bębna. Przednia kończyna szczura kontrolnego wysuwa się daleko do przodu, a palce otwierają się wraz z postępem kończyny. Gdy kończyna jest umieszczona, jest ona umieszczana ruchem arpeggio, przy czym cyfra 5 najpierw styka się z powierzchnią bębna, a następnie kolejno cyfry 4, 3 i 2. W przeciwieństwie do tego, kończyna szczura 6-OHDA jest mniej uniesiona i wyprostowana, palce są mniej wysunięte i stykają się z powierzchnią bębna prawie jednocześnie z "uderzeniem". Film pokazuje ruchy kroków kończyn przednich u zwierzęcia kontrolnego, które zostały ocenione jako "1", oraz ruchy kroków kończyn przednich u zwierzęcia ze zmianą 6-OHDA, które zostały ocenione głównie jako "0".

Krok kończyn tylnych

Wystąpiły również upośledzenia w kończynach tylnych przeciwległych do uszkodzenia u szczurów 6-OHDA. Gdy tylna kończyna kontrolna porusza się do tyłu, wydaje się, że naciska na obracający się bęben, a gdy to robi, palce obracają się na zewnątrz. Gdy kończyna porusza się do przodu, stopa jest odchylana na zewnątrz. Tylna kończyna szczura 6-OHDA porusza się bezpośrednio do tyłu z obrotem bębna, a jeśli już, obraca się lekko do wewnątrz. Gdy kończyna porusza się do przodu, stopa jest przenoszona bezpośrednio do przodu. Stopa szczura kontrolnego wychyla się na zewnątrz, a gdy jest posuwana naprzód, palce u nóg są trzymane wyżej niż kostka, a palce u nóg wysuwają się. Podczas umieszczania szczura kontrolnego, palec 5 najpierw styka się z powierzchnią bębna, a ciężar jest rozkładany na palce u nóg i dłoń. W przeciwieństwie do tego, palce szczura 6-OHDA są zgięte podczas noszenia, a umieszczanie odbywa się bez ruchu arpeggio. Palce u nóg szczura kontrolnego są uwalniane w odwróconym wzorze arpeggio, gdy palec 5 jest unoszony jako pierwszy, a palec 1 jako ostatni. Ruch ten był nieobecny u szczura ze zmianą 6-OHDA, podczas gdy kostka utrzymywała swoją zgiętą postawę podczas ruchu noszenia. Ponownie ruchy naprzód szczura 6-OHDA są osłabione, a kończyna jest mniej egzorotowana, mniej uniesiona i mniej wysunięta niż u szczura kontrolnego. Gdy szczury kontrolne umieszczają palce u stóp, są one rozciągane i otwierane, tak że palec u nogi jest 5 punktów bocznych w stosunku do ciała szczura. Palec 5 najpierw styka się z bębnem, a następnie z pozostałymi palcami, tak że szczur utrzymywał swój ciężar na końcach palców. W przypadku szczura 6-OHDA palce u nóg są nieco zgięte, gdy stopa jest przenoszona do przodu, palce są niższe do poziomych w stosunku do kostki, palce u nóg są mniej otwarte, gdy stopa jest umieszczona na bębnie. Długość kroku jest również nieco krótsza niż u szczurów kontrolnych. W celu ilościowego określenia różnic między kontrolnymi a ruchami kończyn tylnych 6-OHDA, składowe podnoszenia i zwalniania, przenoszenia, przesuwania i umieszczenia oceniano w 3-punktowej skali, podobnie jak kończyny przednie. Pomiary wykonano na podstawie nagrań wideo wykonanych w 20 dniu po operacji, a dla każdego szczura oceniano trzy cykle etapowe. Stwierdzono istotne różnice w grupach, F(1,8)=47,6, p<0,001. Dalsze testy t na składnikach wykazały, że wszystkie składniki szczurów kontrolnych otrzymały znacznie wyższe wyniki niż składniki szczurów 6-OHDA. Film pokazuje ruchy kroków kończyn tylnych u zwierzęcia kontrolnego, które zostały ocenione na "1". Ruchy kroków kończyn tylnych w 6-OHDA pokazane na filmie były głównie oceniane z wynikiem "0".

Dyskusja

Celem niniejszego badania było sprawdzenie, czy test rotorodowy na umiejętności lokomocji gryzoni może być wykorzystany do jakościowego badania postawy, stąpania kończyn przednich i kończyn tylnych u szczurów z uszkodzeniem układu nerwowego. Do analizy szczury z jednostronnym wyczerpaniem DA i szczury kontrolne zostały nagrane na wideo z przodu, z boku i z tyłu. Skala oceny postawy i ruchów kończyn przednich wykazała, że ruchy krokowe były przewlekle upośledzone po operacji. Badanie ruchów kończyn wykazało, że podczas gd...