Ludzki bioanaliza in vivo do tkankowo swoistego pomiaru mediatorów nocyceptywnych i zapalnych

Podsumowanie

Przedstawiono technikę pobierania in-vivo próbek płynu śródmiąższowego z odpowiednich miejsc w tkankach (w tym przypadku z eksperymentalnie wywołanego stanu zapalnego skóry) w celu pomiaru substancji biochemicznych pośredniczących w bólu i zapaleniu.

Streszczenie

Niniejszy bioassay in vivo u ludzi może być wykorzystany do badań z udziałem ochotników oraz pacjentów. Próbki pobiera się z odpowiednich miejsc tkankowych, np. ze skóry, za pomocą aseptycznie wprowadzonych cewników do mikrodializy (Dermal Dialysis, Erlangen, Niemcy). W niniejszym przykładzie przedstawiono pobieranie płynu śródmiąższowego z eksperymentalnie wywołanego stanu zapalnego skóry u ochotników. Pobieranie próbek można łączyć z innymi testami eksperymentalnymi. Przykładowo, jednoczesna ocena lokalnie uwalnianych substancji biochemicznych oraz subiektywnej wrażliwości na bodźce bólowe w skórze z eksperymentalnym stanem zapalnym pozwala na ustalenie kluczowego związku biochemiczno-behawioralnego w celu identyfikacji biomarkerów bólu i stanu zapalnego. Przedstawiony assay w żywym organizmie człowieka umożliwia uzyskanie wglądu w mechanizmy procesów specyficznych dla danej tkanki, które leżą u podstaw bólu i/lub stanu zapalnego. Metoda ta jest również odpowiednia do badania skuteczności istniejących lub nowych interwencji – takich jak nowe kandydaty na leki – ukierunkowanych na leczenie stanów bolesnych i/lub zapalnych. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis zastosowania technik mikrodializy do pobierania płynu śródmiąższowego z eksperymentalnych zmian zapalnych skóry u badanych osób. Próbki płynu śródmiąższowego są zazwyczaj przetwarzane przy użyciu multipleksowych immunoanaliz z użyciem tablic koralików (multiplex bead array immunoassays), co pozwala na oznaczanie do 100 analitów w próbkach o objętości tak małej jak 50 mikrolitrów.

Protokół

Indukcja stanu zapalnego w modelu eksperymentalnym:

1. Oparzenie słoneczne pierwszego stopnia indukuje się na nieopalonej skórze uda przy użyciu skalibrowanego źródła promieniowania ultrafioletowego B (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Niemcy). Oparzenie słoneczne wywołuje się na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu z mikrodializy, stosując dawkę promieniowania UVB trzykrotnie większą niż ta niezbędna do wywołania całkowitego zaczerwienienia odsłoniętej skóry, czyli trzykrotność minimalnej dawki erytemalnej (MED). Wartość MED określa się u każdego badanego przed rozpoczęciem badania. Precyzyjne dostarczenie energii zapewniane jest za pomocą miernika UV (RM 12, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Niemcy).

Umieszczenie cewnika i pobieranie próbek:

1. Przygotować stanowisko pracy z jałowymi rękawiczkami, jednym jałowym uchwytem do igieł, strzykawką 1 cc z końcówką luer i igłą 23G, strzykawką 1 cc z igłą 30G, 1% lidokainą, gazikami nasączonymi alkoholem, jałowymi gazikami 2x2, cewnikami do mikrodializy z przymocowaną na jednym końcu igłą 23G o długości 4 cm (Dermal Dialysis, Erlangen, Niemcy) oraz probówkami do zbierania próbek Microcent 1,5 ml (E&K Scientific, Santa Clara, CA) z 4 µl roztworu inhibitora proteaz na każde 100 µl próbki, przechowywanymi na suchym lodzie. Roztwór inhibitora proteaz przygotowuje się zgodnie z instrukcją producenta, używając tabletek z koktajlem inhibitorów proteaz (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Niemcy).
2. Przygotować 1% roztwór albumin ludzkich w płynie Ringera z mleczanami i naciągnąć go do strzykawki 1 cc z końcówką luer, upewniając się, że w strzawce NIE pozostały pęcherzyki powietrza.
3. Umieścić strzykawkę z 1% roztworem płynu Ringera z mleczanami wzbogaconym albuminami ludzkimi w uchwycie (wielostrzykawkowe statywy do mikrodializy, Harvard Apparatus, South Natick, MA) zamontowanym na precyzyjnej pompie infuzyjnej (Pompa 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Należy upewnić się, że ramię pompy infuzyjnej przesuwające strzykawkę w pełni przylega do tłoka strzykawki. Ustawić prędkość pompy po potwierdzeniu, że średnica strzykawki została prawidłowo wprowadzona do ustawień pompy. Powszechnie stosowane prędkości infuzji mieszczą się w zakresie od 2 do 4 µl/min.
4. Wyznaczyć obszar, z którego planowane jest pobranie próbki. W przypadku pobierania próbek z obszaru sztucznie wywołanego stanu zapalnego, takiego jak opisane powyżej oparzenie słoneczne, zaplanować wprowadzenie cewnika na brzegu oparzenia.
5. Oczyścić alkoholem niewielki obszar na przeciwległych krawędziach zmiany lub w miejscu, z którego planowane jest pobranie próbki. Oczyszczone obszary te będą punktami wprowadzenia i wyjścia cewnika. Wstrzyknąć śródskórnie taką ilość lidokainy (potwierdzoną bladością skóry podczas wstrzykiwania), aby utworzyć bardzo mały pęcherzyk (maksymalnie 2 mm). Wstrzyknięcie tak ograniczonej ilości lidokainy śródskórnie w punktach wejścia i wyjścia cewnika do mikrodializy nie powinno zmienić wyników bioanalizy, a sprawia, że wprowadzenie cewnika jest znacznie mniej bolesne dla badanych.
6. Stosując techniki aseptyczne, wprowadzić cewniki do mikrodializy przy pomocy przymocowanej igły 23G wzdłuż badanej powierzchni skóry. Głębokość wprowadzenia znajduje się na granicy skóry właściwej (cutis) i tkanki podskórnej (subcutis). Wprowadzenie na odpowiednią głębokość można zweryfikować optycznie. Podczas przesuwania igły i przymocowanego cewnika do przodu, igła powinna spowodować lekkie pofałdowanie skóry oraz jej pewne zblednięcie. Nie powinno wystąpić krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, oznacza to, że igła znajduje się głębiej niż zamierzono i należy skorygować głębokość wprowadzenia. Po przebiciu igłą punktu wyjścia ze skóry, przepłukać cewniki 1% roztworem płynu Ringera z mleczanami wzbogaconym albuminami, aż do pojawienia się kropel wzdłuż cewnika. Wykonuje się to poprzez ostrożne wprowadzenie końcówki igły strzykawki (igła 23G) do dystalnego końca cewnika do mikrodializy i powolne wstrzykiwanie roztworu.
7. Po przepłukaniu cewnika delikatnie pociągnąć za igłę, aby przeprowadzić przymocowany cewnik przez skórę. Wymagana jest delikatna obsługa, ponieważ cewniki mają małą średnicę i w konsekwencji są kruche. Wyciągać cewnik, aż zostanie całkowicie przeprowadzony przez skórę, tzn. aż podstawa szerszej rurki plastikowej osłaniającej dystalny koniec cewnika dotknie skóry w punkcie wejścia. Jak wspomniano powyżej, brak lub minimalne krwawienie na koniec procedury potwierdza optymalne rozmieszczenie cewnika.
8. Przymocować dystalny koniec cewnika do końcówki igły 23G strzykawki znajdującej się w statywie pompy infuzyjnej. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić igłą ścianki cewnika, co mogłoby spowodować wyciek.
9. Odciąć igłę z proksymalnego końca cewnika.
10. Używając różowej taśmy o szerokości ¼ cala, przymocować przygotowaną probówkę Microcent 1,5 ml do skóry w pobliżu miejsca wyjścia cewnika. Umieścić końcówkę cewnika w probówce, aby umożliwić zbieranie mikrodializatu. Uruchomić pompę perfuzyjną z ustaloną wcześniej prędkością i okresowo sprawdzać, czy objętość podana i zebrana są zgodne. W przypadku niezgodności objętości należy wykluczyć wyciek z miejsca wejścia do skóry (czasami można to rozwiązać, mocniej dociskając część cewnika osłoniętą rurką plastikową do miejsca wejścia w skórę). Alternatywnie, jeśli objętości podane i zebrane nie są zgodne, może być konieczna wymiana cewnika.
11. Po zakończeniu pobierania, próbki umieszcza się na suchym lodzie do czasu przechowywania w temperaturze -80ºC.

Dyskusja

Połączone zastosowanie technik mikrodializy i technologii wielotorowych testów immunoanalitycznych stanowi wartościową metodę bioanalizy in-vivo u ludzi w czasie rzeczywistym, dostarczającą informacji o zdarzeniach biochemicznych w analizowanej tkance. W połączeniu z testami behawioralnymi, takimi jak testy bólu, metoda ta pozwala na badanie złożonych oddziaływań substancji biochemicznych pośredniczących w bólu i zapaleniu. Metoda ta jest obiecująca w zakresie 1) identyfikacji specyficznych dla tkanki biomarkerów pośredn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kaniula do mikrodializy	Narzędzie	Dermal Dialysis	NA
Pompa 22	Narzędzie	Harvard Apparatus	552219
Multitester Saalmann SBB LT 400	Narzędzie	Saalmann GmbH	NA
Radiometr RM-12 IP-65	Narzędzie	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
Kompletny inhibitor proteaz	Odczynnik	Roche Group	11836145001
Probetka do mikrocentryfugi	Narzędzie	E&K Scientific	380150-X
Albumina 5%	Odczynnik	ZLB Behring	NA
Płyn Ringera z mleczanami	Odczynnik	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	Inne	AstraZeneca	NA
Strzykawka 1mL	Narzędzie	BD Biosciences	309602