Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1086

⸱

18 lutego 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Sciences, University of Georgia (UGA)

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę generowania cDNA z mRNA pochodzącego ze środowiska. W ujęciu ogólnym, najpierw pobiera się całkowity RNA ze środowiska, selektywnie usuwa rRNA, selektywnie amplifikuje mRNA, a następnie sekwencjonuje cDNA zsyntetyzowane z wzbogaconej puli mRNA. Odzyskane sekwencje można poddać adnotacji przy użyciu standardowych technik bioinformatycznych w celu identyfikacji ekspresyjnych genów.

Streszczenie

Analogicznie do metagenomiki, transkryptomika środowiskowa (metatranskryptomika) pozwala na uzyskiwanie i sekwencjonowanie środowiskowych cząsteczek mRNA z asocjacji mikrobiologicznej bez wcześniejszej wiedzy o tym, które geny mogą być ekspresowane przez tę społeczność. Dzięki temu zapewnia najbardziej obiektywne spojrzenie na ekspresję genów w społecznościach mikroorganizmówin situ. Protokoły transkryptomiki środowiskowej są technicznie trudne, ponieważ mRNA prokariotyczne zazwyczaj nie posiadają ogonów poli(A), które ułatwiają izolację wiadomości eukariotycznych.1i z powodu stosunkowo krótkich okresów półtrwania mRNA2. Ponadto, mRNA występują w całkowitych ekstraktach RNA w znacznie mniejszej ilości niż rRNA, przez co sygnał pochodzący od rRNA często przytłacza sygnały mRNA. Jednakże, ostatnio opracowano techniki pozwalające pokonać niektóre z tych trudności. Opisano procedurę analizy transkryptomów środowiskowych polegającą na tworzeniu bibliotek klonowych z wykorzystaniem losowych starterów do odwrotnej transkrypcji i amplifikacji środowiskowych mRNA, która okazała się skuteczna w dwóch różnych środowiskach naturalnych, jednak wyniki były obciążone ze względu na wybór losowych starterów użytych do inicjacji syntezy cDNA3. Postępy w zakresie liniowej amplifikacji mRNA eliminują potrzebę stosowania losowych starterów w kroku amplifikacji i pozwalają na użycie mniejszej ilości materiału wyjściowego, skracając czas pobierania i przetwarzania próbek oraz minimalizując tym samym degradację RNA4.In vitrometody transkrypcji służące amplifikacji mRNA polegają na poliadenylowaniu mRNA oraz wprowadzaniu promotora T7 na koniec 3' transkryptu. Amplifikowany RNA (aRNA) może następnie zostać przekształcony w dwuniciowy kwas cDNA przy użyciu losowych heksamery i bezpośrednio sekwencjonowany metodą pirosekwencjonowania5. Pierwsze zastosowanie tej metody na Stanii ALOHA wykazało jej przydatność w charakteryzowaniu ekspresji genów w społecznościach mikrobiologicznych6.

Protokół

Praca z RNA

Ponieważ RNazy są rozpowszechnione, a mRNA ulega szybkiej degradacji, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności dotyczących pracy w środowisku wolnym od rybonukleaz, a próbki powinny zostać przetworzone lub zakonserwowane tak szybko, jak to możliwe po ich pobraniu.

Część 1: Pobieranie RNA środowiskowego (przeznaczone do zbierania biomasy w frakcji wielkości 0.2- 3.0 µm)

Wymagane materiały:
wężyk Masterflex
pompa perystaltyczna
plisowany filtr kapsułkowy o wysokiej przepustowości 3 µm
filtr Supor lub poliwęglanowy 0.22 µm 142 mm
kolumna filtracyjna 142 mm (Geotech Environmental Equipment)
gąsior 10-20 L (miarkowany)
worki Whirl-Pak
ciekły azot
bufor RLT (Qiagen)
beta-merkaptoetanol

Przygotowanie:
Podczas pracy z filtrami lub dotykania jakichkolwiek wewnętrznych elementów linii filtracyjnej należy nosić czyste rękawiczki. Pincety należy przechowywać w czystych, stożkowych probówkach 50 ml, najlepiej wypełnionych etanolem. Aby zapobiec znacznym zmianom w puli transkryptów, należy maksymalnie skrócić czas filtrowania i obróbki próbek.

Jeden koniec wężyka należy umieścić w wodzie na pożądanej głębokości pobierania próbek. Na drugim końcu należy zamocować filtr 3 µm o wysokiej przepustowości. Filtr 3 µm należy połączyć z kolumną filtracyjną 0.22 µm. Odpływ z filtra 0.22 μm należy skierować do miarkowanego gąsiora.

Procedura:

  1. Przepuść kilka litrów wody przez system (bez filtra 0,22 µm), aby go wypłukać. Po zakończeniu, przy włączonej pompie, wyjmij rurkę z wody, aby usunąć pozostałą wodę z przewodu.
  2. Za pomocą pęsety umieść filtr 0,22 µm w wieży filtracyjnej i zamknij ją.
  3. Ponownie umieść koniec przewodu w wodzie i włącz pompę. Odpowietrz oba filtry. Monitoruj objętość przefiltrowanej wody, korzystając ze skali na kanistrze.
  4. Po przefiltrowaniu pożądanej objętości wyjmij przewód z wody i usuń pozostałą wodę z systemu.
  5. Gdy tylko filtr wyschnie, szybko zdejmij górną płytkę filtra i złóż filtr. Umieść filtr w whirl packu lub probówce do zbierania o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu RLT z beta-merkaptoetanolem. Zamroź gwałtownie w ciekłym azocie.

Część 2: Ekstrakcja całkowitego RNA z filtra 0,22 μm

W tej części wykorzystano zestaw QIAGEN RNeasy mini z modyfikacjami instrukcji producenta

  1. Przygotować probówki do homogenizacji mechanicznej, dodając 8 ml buforu RLT (z dodatkiem beta-merkaptoetanolu) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 1-2 ml kulek do izolacji RNA z zestawu MoBio Powersoil
  2. Szybko wyjąć zamrożony filtr z zamrażarki i, trzymając go w woreczku typu whirl pack, rozbić go młotkiem. Alternatywnie, pociąć filtry na małe kawałki w probówce zbiorczej (15 ml) za pomocą sterylnego ostrza żyletki i przenieść wszystko do przygotowanej probówki (50 ml).
  3. Przenieść rozbity filtr do przygotowanej probówki (50 ml) i uszczelnić nakrętkę probówki parafimem lub taśmą laboratoryjną.
  4. Mieszać na wibratorze (vortex) przez 10 minut z maksymalną prędkością, używając wibratora z adapterem do probówek 50 ml.
  5. Wirować probówkę 50 ml przy 5000 rpm przez 1 min w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać jak najwięcej lizatu i przenieść go do probówki 15 ml.
  7. Wirować probówkę 15 ml przez 5 min przy 5000 x g.
  8. Przenieść nadsącz (~7 ml) do nowej probówki 50 ml.
  9. Dodać do lizatu 1 objętość (~7 ml) 100% EtOH.
  10. Używając strzykawki 30 ml pasującej do probówki 50 ml, zaciągnąć lizat przez igłę o rozmiarze 18-21 G i wypuścić go z powrotem około 5 razy. Po zakończeniu pozostawić lizat w strzykawce.
  11. Kontynuować ekstrakcję przy użyciu zestawu QIAGEN RNeasy Mini. W tym kroku pomocne jest zastosowanie manifoldu próżniowego, ponieważ objętość lizatu (~14 ml) jest znacznie większa niż w oryginalnym protokole zestawu (0,7 ml). Alternatywnie lizat można nanosić na kolumnę, dodając po 700 µl, wirować i powtarzać czynność, aż cały lizat zostanie naniesiony na kolumnę.
  12. Umieścić kolumnę wirówkową na manifoldzie próżniowym i nanieść 700 µl próbki. Zastosować podciśnienie w manifoldzie, aby odessać lizat. Kontynuować dodawanie lizatu ze strzykawki, aż cała objętość zostanie naniesiona na kolumnę.
  13. Dodać do kolumny 700 µl buforu RW1 i odessać za pomocą podciśnienia.
  14. Dodać do kolumny 500 µl buforu RPE i odessać za pomocą podciśnienia.
  15. Dodać do kolumny drugą porcję 500 µl buforu RPE i odessać za pomocą podciśnienia.
  16. Po całkowitym odessaniu buforu płuczącego wyjąć kolumnę i umieścić ją w probówce zbiorczej.
  17. Wirować probówkę przez 1 min przy 8000 x g. Odrzucić filtrat.
  18. Wirować przez dodatkowe 2 min przy 8000 x g, aby usunąć EtOH.
  19. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej 2 ml. Nanieść pipetą 35 µl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę. Zamknąć probówkę i pozostawić na 1 min.
  20. Wirować przez 2 min przy 8000 x g.
  21. Oznaczyć ilość całkowitego RNA spektrofotometrycznie.

Część 3. Traktowanie DNazą

W tej części wykorzystano zestaw Ambion TURBO DNA-free zgodnie z instrukcjami producenta

  1. Do próbki RNA dodać 3,4 µl 10x buforu do DNazy I oraz 1 µl rDNazy I.
  2. Inkubować w temperaturze 37ºC przez 30 min.
  3. Wymieszać odczynniki do inaktywacji DNazy za pomocą wortexa, a następnie dodać 3,4 µl odczynnika do inaktywacji do próbki.
  4. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.
  5. Wirować z prędkością 10 000 x g przez 1,5 min w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść nadsącz do nowej probówki. Należy unikać przeniesienia odczynnika do inaktywacji do nowej probówki.

Część 4. Pierwsze usuwanie rRNA

W tej części wykorzystano zestaw Epicentre mRNA-ONLY zgodnie z instrukcjami producenta

  1. Przed użyciem należy delikatnie wymieszać i krótko odwirować 10X bufor do reakcji mRNA-ONLY (mRNA-ONLY 10X Reaction Buffer).
  2. W sterylnym (wolnym od RNaz) probówce o pojemności 0,5 ml połączyć w lodzie następujące składniki reakcji:
    10X bufor reakcyjny mRNA-ONLY2,0 µl
    inhibitor RNazy0,5 µl
    Próbka całkowitego RNA (200 ng–10 µg)16,5 µl
    Egzonukleaza Terminator (1 jednostka)1,0 µl
    Objętość całkowita20,0 µl
  3. Inkubować reakcję w temperaturze 30°C przez 60 min w termocyklerze (z podgrzewaną pokrywą) lub w łaźni wodnej.
  4. Zatrzymaj reakcję poprzez precypitację fenolem/EtOH:
    1. Dodać wodę H2O wolną od RNaz do uzyskania objętości całkowitej 200 µl (= 180 µl).
    2. Ekstrakcja: Fenol:Chloroform (1:1), 1 objętość (= 200 µl). Intensywnie wymieszać w wstrząsarzu Vortex, a następnie wirować przez 2-5 min z maksymalną prędkością.
    3. Usunąć fazę wodną (~200 µl).
    4. Dodać 0,1 objętości 3 M octanu sodu (20 µl) + 2,5 objętości 100% lodowatego EtOH (500 µl)
    5. Inkubować w temperaturze -80°C przez 15–30 min.
    6. Wirować w temperaturze 4ºC z maksymalną prędkością przez 30 min; zaznaczyć położenie probówki, aby ułatwić późniejszą aspirację próbki (osad może być trudny do zauważenia).
    7. Usunąć nadsącz za pomocą aspiratora lub pipety.
    8. Przemyć 500 µl lodowatego 70% EtOH. Resuspender za pomocą vortexa.
    9. Wiruj przez 10 min z maksymalną prędkością. Odlej nadsącz.
    10. Ponownie odwiruj pozostałą w probówce ciecz przez 10 min z maksymalną prędkością.
    11. Ostrożnie odessać ciecz i całkowicie osuszyć osad, pozostawiając go przez około 10 min w dygestorium.
    12. Resuspender w 15–20 µl wody H2O wolnej od RNaz (maksymalna objętość wejściowa dla MICROBExpress wynosi 15 µl); pozostawić na 5 min w temperaturze pokojowej.
    13. Na tym etapie należy użyć systemu Bioanalyzer lub Experion w celu sprawdzenia zanieczyszczenia rRNA oraz jakości mRNA.
    14. Jest to potencjalny punkt przerwania pracy. RNA można przechowywać w temperaturze -80ºC.

Część 5. Drugie usuwanie rRNA

W tej części wykorzystuje się zestawy Ambion MICROBEnrich i MICROBExpress zgodnie z instrukcjami producenta. Oba zestawy można stosować wielokrotnie, aby zwiększyć efektywność usuwania rRNA eukariotycznego (MICROBEnrich) i prokariotycznego (MICROBExpress). Ilość wprowadzanego całkowitego RNA powinna wynosić od 2-10 µg. Objętość RNA powinna być mniejsza niż 15 µl. Zatem idealne stężenie materiału wyjściowego to >150 ng/µl. -

MICROBEnrich

  1. Do probówki 1,5 ml pipetuj 300 µl buforu wiążącego (Binding buffer)
  2. Dodaj 5–100 µg całkowitego RNA w maksymalnej objętości 30 µl i delikatnie wymieszaj na wortexie
  3. Do buforu wiążącego z 5 µg RNA dodaj 2 µl mieszaniny oligonu wychwytującego (Capture Oligo Mix). Delikatnie opukaj probówkę i krótko odwiruj mieszaninę.
  4. Denaturuj mieszaninę w temperaturze 70°C przez 10 min
  5. Przeprowadź hybrydyzację mieszaniny w temperaturze 37°C przez 1 h. W czasie inkubacji przygotuj kuleczki.
  6. Przygotuj kuleczki Oligo MagBeads (zwykle 25 µl), płucząc je raz w wodzie wolnej od nukleaz i raz w buforze wiążącym, wychwytując kuleczki na statywie magnetycznym pomiędzy płukaniem. Przechowuj kuleczki na lodzie. Ogrzej je do temperatury pokojowej na 5 min przed użyciem.
  7. Podgrzej roztwór płuczący (Wash solution) do 37°C w bloku grzewczym.
  8. Dodaj mieszaninę RNA/oligonu wychwytującego do wypłukanych kuleczek Oligo MagBeads. Bardzo delikatnie wymieszaj zawartość probówki i krótko odwiruj.
  9. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37°C przez 15 min.
  10. Umieść probówkę na statywie magnetycznym i odczekaj ok. 3 min.
  11. Odsącz nadsącz (zawierający mRNA) i przenieś go do probówki zbiorczej na lodzie.
  12. Do wychwyconych kuleczek dodaj 100 µl uprzednio ogrzanego roztworu płuczącego. Krótko i delikatnie wymieszaj kuleczki na wortexie.
  13. Wychwyć kuleczki i odzyskaj nadsącz. Połącz ten nadsącz z mRNA w probówce zbiorczej na lodzie (objętość końcowa ok. 450 µl).
  14. Umieść probówkę zbiorczą na lodzie. Jeśli planowane jest przeprowadzenie drugiej rundy, wróć do sekcji 5.3) i powtórz procedurę. Alternatywnie, przejdź niezwłocznie do zestawu MICROBExpress (5.18, patrz poniżej).
  15. Użyte kuleczki OlioBeads można wykorzystać ponownie. Zregeneruj kuleczki Oligobeads, inkubując je przez 1 h w 2 objętościach (zwykle 50 µl) roztworu regenerującego 1 (Regeneration Solution 1). Wychwyć kuleczki na statywie magnetycznym. Przepłucz je dwukrotnie 2 objętościami roztworu regenerującego 2 (Regeneration Solution 2, zwykle 50 µl) i resuspenduj w oryginalnej objętości roztworu resuspensyjnego (Resuspension solution, zwykle 25 µl).
    MICROBExpress
  16. Do probówki 1,5 ml pipetuj 200 µl buforu wiążącego (Binding buffer).
  17. Dodaj 2–10 µg całkowitego RNA w maksymalnej objętości 15 µl i delikatnie wymieszaj na wortexie.
  18. Do RNA w buforze wiążącym dodaj 4 µl mieszaniny oligonu wychwytującego (Capture Oligo Mix). Delikatnie opukaj probówkę i krótko odwiruj mieszaninę.
  19. Denaturuj mieszaninę w temperaturze 70°C przez 10 min.
  20. Przeprowadź hybrydyzację mieszaniny w temperaturze 37°C przez 15 min. W czasie inkubacji przygotuj kuleczki.
  21. Przygotuj kuleczki Oligo MagBeads, płucząc je raz w wodzie wolnej od nukleaz, a następnie dwukrotnie w 50 μl buforu wiążącego, wychwytując kuleczki na statywie magnetycznym pomiędzy płukaniami. Resuspenduj kuleczki w 50 μl buforu wiążącego i inkubuj w temperaturze 37°C do momentu użycia.
  22. Podgrzej roztwór płuczący (Wash solution) do 37°C w bloku grzewczym.
  23. Delikatnie wymieszaj wypłukane kuleczki Oligo MagBeads na wortexie. Dodaj 50 µl kuleczek Oligo MagBeads do mieszaniny RNA/oligonu wychwytującego. Bardzo delikatnie wymieszaj zawartość probówki i krótko odwiruj.
  24. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37°C przez 15 min.
  25. Umieść probówkę na statywie magnetycznym i odczekaj ok. 3 min.
  26. Odsącz nadsącz (zawierający mRNA) i przenieś go do probówki zbiorczej na lodzie.
  27. Do wychwyconych kuleczek dodaj 100 µl uprzednio ogrzanego roztworu płuczącego. Krótko i delikatnie wymieszaj kuleczki na wortexie.
  28. Wychwyć kuleczki i odzyskaj nadsącz. Połącz ten nadsącz z mRNA w probówce zbiorczej na lodzie (objętość końcowa ok. 350 µl).
  29. Jeśli planowane jest przeprowadzenie drugiej rundy, wróć do sekcji 5.18) i powtórz procedurę. Alternatywnie, przejdź niezwłocznie do precypitacji mRNA.
  30. Precypituj i resuspenduj mRNA:
    1. Do połączonego mRNA dodaj 35 µl octanu sodu oraz 7 µl glikogenu.
    2. Dodaj 1175 µl lodowatego 100% EtOH i dokładnie wymieszaj na wortexie.
    3. Precypituj w temperaturze -20°C przez co najmniej 1 h.
    4. Wirowaj przez 30 min przy 10.000 x g.
    5. Ostrożnie zlej i odrzuć nadsącz.
    6. Dodaj 750 µl lodowatego 70% EtOH i krótko wymieszaj na wortexie.
    7. Wirowaj przez 5 min przy 10.000 x g i odrzuć nadsącz.
    8. Przeprowadź drugie płukanie 70% EtOH.
    9. Po odrzuceniu drugiego płukania 70% EtOH krótko odwiruj probówkę.
    10. Ostrożnie usuń resztki nadsączu za pomocą pipety.
    11. Susz osad na powietrzu przez 5 min.
    12. Resuspenduj osad RNA w 25 µl buforu TE lub wody wolnej od RNaz.
    13. Rehydratuj RNA przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    14. W razie potrzeby energicznie wymieszaj próbkę na wortexie.
  31. Jeśli jest to konieczne, usuń pozostałe kuleczki: umieść probówkę na statywie magnetycznym przez ok. 3 min i przenieś wzbogacone mRNA do nowej probówki wolnej od RNaz.
  32. Na tym etapie użyj analizatora Bioanalyzer lub Experion, aby sprawdzić obecność kontaminacji rRNA oraz jakość mRNA.
  33. Jest to potencjalny punkt przerwania procedury. RNA można przechowywać w temperaturze -80ºC.

Część 6: Amplifikacja mRNA

W tej części wykorzystano zestaw Ambion MessageAmp II- Bacteria zgodnie z instrukcjami producenta. Obliczenia dla mieszanin głównych (master mixes) można wykonać online pod adresem www.ambion.com/tools/ma2bact.

  1. Poliadenylacja matrycowego RNA:
    1. Do sterylnej probówki do mikrowirówki wolnej od RNaz należy przenieść do 1000 ng całkowitego RNA (zazwyczaj 100–500 ng) lub do 500 ng mRNA (zazwyczaj 10 ng–200 ng). W przypadku pierwszego buforu należy użyć 6,5 µl próbki i nie dodawać wody wolnej od RNaz.
    2. Inkubować przez 10 min w temperaturze 70°C, najlepiej w termocyklerze.
    3. Wyjmij próbki RNA z inkubatora ustawionego na 70°C i krótko odwiruj (~5 s), aby zebrać próbkę na dnie probówki. Umieść mieszaninę w lodzie na 3 min.
    4. Przygotować mieszaninę Master Mix do poliadenylacji w probówce wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej, zachowując kolejność podaną w arkuszu obliczeń. Przygotować ilość mieszaniny wystarczającą dla wszystkich próbek w eksperymencie, uwzględniając nadmiar ≤5% w celu zniwelowania błędów pipetowania. Delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex, aby uzyskać jednorodną mieszaninę bez inaktywacji enzymu, a następnie wirować przez ok. 5 s, aby osadzić mieszaninę na dnie probówki.
    5. Przenieś 3,5 µl mieszaniny Polyadenylation Master Mix do każdej próbki RNA, wymieszaj dokładnie za pomocą delikatnego wstrząsania w wirówce typu vortex, a następnie krótko odwiruj, aby zebrać mieszaninę reakcyjną.
    6. Umieść próbki w inkubatorze w temperaturze 37°C. Inkubuj reakcje przez 15 min w temperaturze 37°C, a następnie krótko odwiruj, aby zebrać produkt reakcji na dnie probówki.
    7. Po inkubacji w temperaturze 37°C należy umieścić reakcje w lodzie i niezwłocznie przystąpić do odwrotnej transkrypcji.
  2. Transkrypcja odwrotna w celu syntezy pierwszej nici cDNA:
    1. Przygotować Master Mix do odwrotnej transkrypcji w probówce wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej, zgodnie z kolejnością podaną w arkuszu obliczeń. Przygotować ilość Master Mixu wystarczającą dla wszystkich próbek w eksperymencie, uwzględniając nadmiar w ilości ≤5% w celu zrekompensowania błędów pipetowania. Delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex, aby uzyskać jednorodną mieszaninę bez inaktywacji enzymu, a następnie wirować przez ok. 5 s, aby zebrać Master Mix na dnie probówki.
    2. Przenieś 10 µl mieszaniny Master Mix do odwrotnej transkrypcji do każdej próbki, wymieszaj dokładnie za pomocą delikatnego wstrząsania w wirówce typu vortex, a następnie krótko odwiruj, aby zebrać ciecz na dnie probówki.
    3. Umieść próbki w inkubatorze w temperaturze 42°C. Inkubuj przez 2 h w 42°C, a następnie krótko odwiruj (~5 s), aby zebrać produkt reakcji na dnie probówki.
    4. Umieścić probówki w lodzie i niezwłocznie przystąpić do syntezy drugiej nici cDNA.
  3. Synteza drugiej nici cDNA:
    1. W warunkach chłodzenia na lodzie przygotować mieszaninę Master Mix dla drugiej nici, mieszając następujące odczynniki w kolejności wskazanej w arkuszu obliczeniowym. Przygotować ilość mieszaniny wystarczającą dla wszystkich próbek w eksperymencie, uwzględniając nadmiar ≤5% w celu zniwelowania błędów pipetowania. Delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex, aby uzyskać jednorodną mieszaninę bez inaktywacji enzymów, a następnie wirować przez ok. 5 s, aby zebrać Master Mix na dnie probówki.
    2. Przenieś 80 µl mieszaniny Second Strand Master Mix do każdej próbki, wymieszaj dokładnie za pomocą delikatnego wirowania w vortexie, a następnie krótko odwiruj próbki, aby zebrać odczynnik na dnie probówki.
    3. Umieść próbki w termocyklerze ustawionym na 16°C. Ważne jest, aby schłodzić blok termocyklera do 16°C przed dodaniem probówek z reakcją, ponieważ poddanie reakcji wpływowi temperatur >Temperatura 16°C obniży wydajność aRNA.
    4. Inkubować przez 2 h w temperaturze 16°C. Inkubować przez 2 h w termocyklerze w temperaturze 16°C. Jeśli temperatura pokrywy nie może zostać dostosowana do temperatury bloku (16°C), należy przeprowadzić reakcje z wyłączonym podgrzewaniem pokrywy lub, w przypadku braku możliwości wyłączenia podgrzewania, nie przykrywać probówek pokrywą.
    5. Przenieś odczynniki z reakcjami na krótko na lód. Nie pozostawiaj reakcji na lodzie przez dłuższy czas.
  4. 5.4) Oczyszczanie cDNA:
    1. Wszystkie wirowania w tej procedurze oczyszczania należy przeprowadzać przy przyspieszeniu 10 000 x g (zwykle ok. 10 000 obr./min) w temperaturze pokojowej. Przed użyciem należy sprawdzić, czy w buforze wiążącym cDNA nie wystąpiło wytrącanie. Jeśli widoczny jest osad, należy go rozpuścić, ogrzewając roztwór w temperaturze 37°C przez maksymalnie 10 min i intensywnie mieszając w wirówce typu vortex. Przed użyciem schłodzić do temperatury pokojowej.
    2. Przed rozpoczęciem oczyszczania cDNA podgrzej butelkę z 10 ml wody wolnej od nukleaz do temperatury 50°C na co najmniej 10 min.
    3. Do każdej próbki należy dodać 250 µl buforu wiążącego cDNA (cDNA Binding Buffer) i dokładnie wymieszać, delikatnie mieszając na wirówce typu vortex.
    4. Wiruj przez ok. 1 min przy 10 000 g lub do momentu, aż mieszanina przejdzie przez filtr. Odrzuć filtrat i umieść wkład cDNA Filter Cartridge z powrotem w probówce do płukania.
    5. Nanieść 500 µl buforu do przemywania (Wash Buffer) do każdego wkładu filtra cDNA (cDNA Filter Cartridge). Wirować przez ok. 1 min przy 10 000 g lub do momentu, aż cały bufor do przemywania przejdzie przez filtr. Odrzucić filtrat i wirować wkład filtra cDNA przez dodatkową minutę, aby usunąć śladowe ilości EtOH.
    6. Przenieś wkład filtracyjny z cDNA do probówki do elucji cDNA. Eluuj cDNA za pomocą 20 µl wody wolnej od nukleaz o temperaturze 50°C. W przypadku elucji cDNA ważne jest zastosowanie wody wolnej od nukleaz podgrzanej do 50°C. Chłodniejsza woda będzie mniej efektywna w elucji cDNA, natomiast cieplejsza woda (>(55°C) może skutkować zmniejszoną wydajnością aRNA.
    7. Do środkowej części filtra w kartridżu do filtracji cDNA (cDNA Filter Cartridge) nanieś 20 µl podgrzanej (50°C) wody wolnej od nukleaz (Nuclease-free Water). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 2 min, a następnie wiruj przez ok. 1,5 min przy 10 000 x g lub do momentu, aż cała woda wolna od nukleaz przejdzie przez filtr. Dwuniciowe cDNA znajdzie się teraz w elucie (ok. 16 µl).
    8. Oczyszczone cDNA można w tym momencie, w razie potrzeby, przechowywać przez noc w temperaturze –80°C.
  5. Transkrypcja in vitro w celu syntezy aRNA
    1. Zaleca się stosowanie pieca do hybrydyzacji ze względu na zapewnienie jednorodnej temperatury oraz fakt, że niezwykle ważne jest, aby wewnątrz probówek nie tworzyła się kondensacja. W celu maksymalizacji wydajności aRNA silnie zalecamy 14-godzinną inkubację reakcji IVT. Aby uzyskać najwyższą wydajność aRNA, należy przeprowadzić reakcję IVT w końcowej objętości reakcyjnej 40 µl.
    2. W temperaturze pokojowej przygotować Master Mix do IVT, dodając odczynniki w kolejności wymienionej w arkuszu obliczeń. Dobrze wymieszać, delikatnie wiertłując na vortexie. Krótko odwirować (~5 s), aby zgromadzić Master Mix do IVT na dnie probówki, a następnie umieścić na lodzie.
    3. Przenieś IVT Master Mix do każdej próbki zgodnie z wytycznymi z arkusza obliczeń, wymieszaj dokładnie za pomocą delikatnego wstrząsania w vortexie, odwiruj krótko, aby zebrać odczynnik na dnie, a następnie umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37°C.
    4. Inkubować przez 14 h w temperaturze 37°C.
    5. Po inkubacji do każdej próbki aRNA należy dodać wodę wolną od nukleaz, aby uzyskać objętość końcową 100 µl. Wymieszać dokładnie, delikatnie wstrząsając na wirówce typu vortex. Rozcieńczone aRNA należy umieścić na lodzie, jeśli etap oczyszczania aRNA zostanie przeprowadzony niezwłocznie. Alternatywnie aRNA można przechowywać w temperaturze –20°C.
  6. Oczyszczanie aRNA
  7. Wszystkie wirowania w tej sekcji należy przeprowadzać przy przyspieszeniu 10 000 x g (zazwyczaj ~10 000 obr./min).
  8. Przed rozpoczęciem oczyszczania aRNA podgrzać butelkę z 10 ml wody wolnej od nukleaz do temperatury 55°C przez > 10 min.
  9. Do każdej próbki aRNA należy dodać 350 µl buforu wiążącego aRNA (aRNA Binding Buffer). Próbki dokładnie wymieszać za pomocą delikatnego wstrząsania na wirówce typu vortex, a następnie niezwłocznie przejść do następnego kroku.
  10. Do każdej próbki aRNA należy dodać 250 µl 100% EtOH klasy ACS i wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół 3 razy. Nie mieszać za pomocą vortexa. Bezzwłocznie po wymieszaniu EtOH w każdej próbce przejść do następnego etapu.
  11. Umieść wkład filtracyjny aRNA w probówce do zbierania aRNA, a następnie pipetuj każdą mieszaninę próbki na środek filtra we wkładzie filtracyjnym aRNA.
  12. Wiruj przez ok. 1 min przy 10 000 x g. Kontynuuj proces, aż mieszanina przejdzie przez filtr. Odrzuć filtrat i umieść wkład filtracyjny aRNA z powrotem w probówce do zbierania aRNA.
  13. Nanieś 650 µl buforu do płukania (Wash Buffer) do każdego wkładu filtra aRNA (aRNA Filter Cartridge). Wirowarkuj przez ok. 1 min przy 10 000 x g lub do momentu, aż cały roztwór płuczący przejdzie przez filtr. Odrzuć filtrat i wiruj wkład filtra aRNA przez dodatkową ok. 1 min, aby usunąć śladowe ilości EtOH.
  14. Przenieś wkład filteracyjny (lub wkładydy) do nowej probówki do zbierania aRNA. Na środek filtra nanieś 75 µl wody wolnej od nukleaz, uprzednio podgrzanej do 50–60°C. Umieść pojemnik z wodą wolną od nukleaz z powrotem w inkubatorze ustawionym na 50–60°C.
  15. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 min, a następnie wirować przez ok. 1,5 min przy 10 000 x g lub do momentu, aż roztwór przejdzie przez filtr.
  16. Powtórz elucję, używając kolejnych 75 µl wody wolnej od nukleaz. aRNA znajduje się obecnie w probówce do zbierania aRNA w objętości ok. 150 µl wody wolnej od nukleaz. Usuń wkład filtracyjny do aRNA.
  17. Przechowywać aRNA w temperaturze –80°C i ograniczyć liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.

Część 7: Synteza cDNA

W tej części wykorzystano zestaw Promega Universal RiboClone cDNA Synthesis System z niewielką modyfikacją instrukcji producenta. Standardowa ilość materiału wejściowego to 2 µg; w przypadku sekwencjonowania 454 zaleca się rozpoczęcie od 10 µg. Jeśli stężenie jest zbyt niskie, aRNA można zagęścić poprzez wytrącanie EtOH lub koncentrację próżniową. W przypadku użycia 10 µg RNA jako materiału wejściowego, należy zwiększyć ilość wszystkich odczynników pięciokrotnie. Enzymy w każdej partii mają różną aktywność (jednostki), dlatego objętości należy obliczać za każdym razem osobno.

  1. Synteza pierwszej nici:
    1. Do probówki PCR o pojemności 0,5 ml dodać:
      próbka mRNA2 μg (lub 10 μg w przypadku sekwencjonowania 454)
      losowe primery heksamerowe (Random Hex Primer) (0,5 mg/ml)2 μl
      woda wolna od nukleaz do uzyskania objętości0 (lub pomijamy, jeśli próbka była rozcieńczona)
      Objętość całkowita15 μl
    2. Ogrzać mieszaninę reakcyjną do 70°C przez 10 min. Schłodzić probówkę na lodzie przez 5 min i krótko odwirować, aby zebrać roztwór na dnie probówki.
    3. Dodać następujące składniki w podanej kolejności:
      Próbka15 μl
      Bufor 5X do syntezy pierwszej nici5 μl
      Inhibitor rybonukleazy RNasin 40 u1 μl ... 40 u/μl
      Objętość całkowita21 μl
    4. Wymieszać mieszaninę reakcyjną i krótko odwirować. Ogrzewać mieszaninę w temperaturze 37°C przez 5 min.
    5. Dodać następujące składniki:
      Próbka z kroku 121,0 μl
      pirofosforan sodu, 40 mM2,5 μl
      odwrotna transkryptaza AMV 30 u1,5 μl ... 22 u/μl
      woda wolna od nukleaz0,0 μl
      Objętość całkowita25,0 μl
    6. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 1 h w 37°C w piecu do hybrydyzacji.
    7. Po inkubacji umieścić mieszaninę reakcyjną na lodzie.
  2. Synteza drugiej nici:
    1. Dodać następujące składniki:
      mieszanina reakcyjna pierwszej nici25,0 μl
      Bufor 2,5X do syntezy drugiej nici40,0 μl
      BSA, 1 mg/ml5,0 μl
      Polimeraza DNA I 23 u3,0 μl
      RNaza H 0,8 u0,5 μl ... 1,5 u/μl
      woda wolna od nukleaz26,5 μl
      Objętość całkowita100,0 μl
    2. Wymieszać delikatnie poprzez opukiwanie probówki. Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze 14°C przez 2 h w termocyklerze. Ważne jest, aby schłodzić termocykler do 14°C przed dodaniem probówek z reakcją. Nie dopuścić do wzrostu temperatury reakcji powyżej 14°C przed rozpoczęciem ani w trakcie reakcji.
    3. Aby zatrzymać reakcję, dodać do niej 2 jednostki polimerazy DNA T4 na każdy μg mRNA wyjściowego. Inkubować przez 10 min w 14°C.
    4. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 10 μl 500 mM EDTA traktowanego DEPC i umieścić na lodzie.
    5. Oczyścić cDNA za pomocą wytrącania w EtOH lub systemu Promega Wizard DNA-Cleanup zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki przechowywać w temperaturze -80°C. Dwuniciowe cDNA można w tym momencie poddać bezpośrednio pirosekwencjonowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie ekspresji genów w naturalnych społecznościach mikroorganizmów stało się w ostatnich latach powszechne jako sposób na poznanie ról ekologicznych i funkcji mikroorganizmów. Analizy ekspresji genów, stosowane w połączeniu z detekcją, kwantyfikacją i charakterystyką mikroorganizmów morskich, mogą służyć do powiązania filogenezy z funkcją w naturalnych społecznościach mikrobowych. Wiele technik ukierunkowanych na ekspresję genów funkcjonalnych opiera się na specyficznych sondach lub zestawach starterów zaprojektowanyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Finansowanie zostało zapewnione z grantów fundacji The Gordon and Betty Moore Foundation oraz grantu National Science Foundation MCB-0702125.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki z kuleczkami PowerSoil Bead TubeszestawMoBio12866-25-PBT
RNeasy Mini KitzestawQiagen74104
TURBO DNA-freezestawAmbionAM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation KitzestawEpicentre BiotechnologiesMOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment KitzestawAmbionAM1905
MICROBEnrich kitzestawAmbionAM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification KitzestawAmbionAM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis SystemzestawPromega Corp.C4360
Wizard DNA Clean-Up SystemzestawPromega Corp.A7280

Bibliografia

  1. Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
  2. Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
  3. Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
  4. Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
  5. Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
  6. Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
  7. Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja RNAusuwanie rRNAamplifikacja mRNAsynteza cDNApirosekwencjonowaniefiltrowanierozbijanie kuleczkamipoliadenylacja
Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.