$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Praca z RNA
Ponieważ RNazy są wszechobecne, a mRNA szybko ulegają degradacji, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności dotyczących pracy w środowisku wolnym od rybonukleazy, a próbki powinny być przetwarzane lub konserwowane jak najszybciej po pobraniu.
Część 1: Środowiskowa kolekcja RNA (przeznaczona do zbierania biomasy we frakcji o wielkości 0,2- 3,0 μm)
Potrzebne materiały:
Rurki Masterflex
Pompa perystaltyczna
3 μm plisowany filtr kapsułkowy o dużej objętości
0.Filtr 22 μm Supor lub poliwęglan 142 mm
Wieża filtracyjna 142 mm (Geotech Environmental Equipment)
10-20 L Carboy (z podziałką)
Whirl Packs
Ciekły azot
Bufor RLT (Qiagen)
Beta-merkaptoetanol
Konfiguracja:
Czyste rękawice należy nosić za każdym razem, gdy dotykasz filtrów lub dotykasz któregokolwiek z wewnętrznych elementów przewodu filtracyjnego. Kleszcze należy przechowywać w czystych, stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, najlepiej wypełnionych etanolem. Aby zapobiec poważnym zmianom w puli transkryptów, czas filtrowania i obsługi próbek powinien być jak najkrótszy.
Umieść jeden koniec rurki w wodzie na żądanej głębokości w celu pobrania próbek. Na przeciwległym końcu zamocuj filtr o dużej pojemności 3 μm. Podłącz filtr 3 μm do wieży filtracyjnej 0,22 μm. Skierować odpływ z 0,22 μm do balonu z podziałką.
Procedura:
- Przepuść kilka litrów wody przez system (bez filtra 0,22 μm) w celu spłukania. Po zakończeniu wyjmij rurkę z wody podczas pracy pompy, aby usunąć pozostałą wodę z linii.
- Za pomocą kleszczy umieść filtr 0,22 μm na wieży filtra i zamknij.
- Umieść koniec żyłki z powrotem w wodzie i włącz pompę. Oczyść powietrze z obu filtrów. Monitoruj objętość przefiltrowanej wody z podziałką na gąsiorze.
- Po przefiltrowaniu żądanej objętości wyjmij przewód z wody i usuń pozostałą wodę z systemu.
- Jak tylko filtr wyschnie, szybko zdejmij górną płytę filtracyjną i złóż filtr. Umieścić filtr w opakowaniu wirowym lub probówce zbiorczej o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu RLT z beta-merkaptoetanolem. Szybkie zamrażanie w ciekłym azocie.
Część 2: Całkowita ekstrakcja RNA z filtra 0,22 μm
Ta część korzysta z mini zestawu QIAGEN RNeasy z modyfikacjami instrukcji producenta
- Przygotować probówki do ubijania kulek, dodając 8 ml buforu RLT (dodano beta-merkaptoetanol) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 1-2 ml kulek RNA z zestawu do ekstrakcji MoBio Powersoil
- Szybko wyjmij zamrożony filtr z zamrażarki i trzymając go w opakowaniu wirowym, rozbij go młotkiem. Alternatywnie, pokrój filtry na małe kawałki w probówce zbiorczej (15 ml) za pomocą sterylnej żyletki i dodaj wszystko do przygotowanej probówki (50 ml).
- Dodaj rozbity filtr do przygotowanej probówki (50 ml) i uszczelnij pokrywkę probówki folią parafilmową lub taśmą laboratoryjną.
- Wiruj przez 10 minut z maksymalną prędkością za pomocą wirownika z nasadką do probówek o pojemności 50 ml.
- Odwirować probówkę o pojemności 50 ml z prędkością 5000 obr./min przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Usunąć jak najwięcej lizatu i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować probówkę o pojemności 15 ml przez 5 minut przy 5000 x g.
- Przenieść supernatant (~7 ml) do nowej probówki o pojemności 50 ml.
- Dodać 1 objętość (~7 ml) 100% EtOH do lizatu.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml, która mieści się w probówce o pojemności 50 ml, wciągnij lizat przez igłę o rozmiarze 18-21 i przepuść go z powrotem ~5 razy. Po zakończeniu pozostaw lizat w strzykawce.
- Kontynuuj ekstrakcję za pomocą zestawu QIAGEN RNeasy Mini. Pomocne jest tutaj użycie kolektora próżniowego, ponieważ objętość lizatu (~ 14 ml) jest znacznie wyższa niż w oryginalnym protokole zestawu (0,7 ml). Alternatywnie, lizat można przeciągnąć, dodając 700 μl do kolumny, odwirowując i powtarzając, aż cały lizat zostanie nałożony na kolumnę.
- Umieścić kolumnę wirową na kolektorze próżniowym i nanieść 700 μl próbki. Zastosuj podciśnienie do kolektora, aby pobrać lizat. Kontynuować dodawanie lizatu ze strzykawki, aż całość zostanie nałożona na kolumnę.
- Dodać 700 μl buforu RW1 do kolumny i pobrać w dół za pomocą podciśnienia.
- Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny i sprowadzić w dół za pomocą podciśnienia.
- Dodać drugą porcję 500 μl buforu RPE do kolumny i pobrać w dół za pomocą podciśnienia.
- Po całkowitym przeciągnięciu prania wyjmij kolumnę i umieść w probówce zbiorczej.
- Odwirować probówkę przez 1 minutę przy 8000 x g. Odrzucić przepływ.
- Odwirować dodatkowe 2 minuty przy 8000 x g, aby pozbyć się EtOH.
- Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Odpipetować 35 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę. Zamknij probówkę i odstaw na 1 minutę.
- Wirować przez 2 minuty przy 8000 x g.
- Określić ilościowo całkowite RNA spektrofotometrycznie.
Część 3. Leczenie DNAzy
Ta część korzysta z zestawu Ambion TURBO bez DNA, zgodnie z instrukcjami producenta
- Dodać 3,4 μl 10x buforu DNazy I i 1 μl rDNazy I do próbki RNA.
- Inkubować w temperaturze 37ºC przez 30 minut.
- Odczynnik do inaktywacji DNazy należy przemieszać wirowo i dodać 3,4 μl odczynnika do inaktywacji do próbki.
- Inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem.
- Wirować w temperaturze 10 000 x g przez 1,5 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki. Unikać wprowadzania odczynnika inaktywującego do świeżej probówki.
Część 4. Pierwsze usunięcie rRNA
Ta część korzysta z zestawu Epicentre-mRNA-ONLY, zgodnie z instrukcjami producenta
- Przed użyciem delikatnie wymieszać i krótko odwirować bufor reakcyjny mRNA-ONLY 10X.
- W sterylnej (wolnej od RNaz) probówce o pojemności 0,5 ml połącz następujące składniki reakcji na lodzie:
| Bufor reakcyjny mRNA-ONLY 10X | 2,0 μl |
| Inhibitor RNazy | 0,5 μl |
| Całkowita próbka RNA (200 ng-10 μg) | 16,5 μl |
| Egzonukleaza terminatora (1 szt.) | 1,0 μl |
| Całkowita objętość | 20,0 μl |
- Inkubować reakcję w temperaturze 30°C przez 60 minut w termocyklerze (z podgrzewaną pokrywką) lub łaźni wodnej.
- Zakończyć reakcję za pomocą wytrącania fenolu/EtOH:
- Dodać H2O wolny od RNaz do całkowitej objętości 200 μl (= 180 μl).
- Ekstrakt: Fenol:Chloroform (1:1), 1 objętość (= 200 μl). Wiruj energicznie, a następnie wiruj 2-5 minut z maksymalną prędkością.
- Usunąć fazę wodną (~200 μl).
- Dodać 0,1 objętości 3 M octanu sodu (20 μl) + 2,5 objętości 100% lodowatego EtOH (500 μl)
- Inkubować w temperaturze -80ºC przez 15-30 min.
- Osad w temperaturze 4ºC, prędkość maksymalna, 30 min; zwrócić uwagę na położenie probówki do późniejszego zasysania próbki (osad może być trudny do zobaczenia).
- Odrzucić supernatant za pomocą aspiratora lub pipety.
- Umyć 500 μl 70% lodowatego EtOH. Ponowne zawieszenie przez wirowanie.
- Wirować przez 10 minut na najwyższych obrotach. Odrzucić supernatant.
- Pozostałą ciecz ponownie odwirować w probówce przez 10 minut z maksymalną prędkością.
- Ostrożnie zassać płyn i całkowicie wysuszyć pellet, pozostawiając go otwartym na ~10 minut pod maską.
- Zawiesić w 15-20 μl H2O wolnym od RNaz (maksymalna objętość wejściowa MICROBExpress wynosi 15 μl); odstawić na 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Na tym etapie użyj Bioanalyzer lub Experion, aby sprawdzić zanieczyszczenie rRNA i jakość mRNA.
- Jest to potencjalny punkt zatrzymania. RNA może być przechowywane w temperaturze -80ºC.
Część 5. Drugie usunięcie rRNA
Ta część korzysta z zestawów Ambion MICROBEnrich i MICROBExpress zgodnie z instrukcjami producenta. Oba zestawy mogą być używane wielokrotnie w celu zwiększenia skuteczności usuwania eukariotycznego (MICROBEnrich) i prokariotycznego (MICROBExpress) rRNA. Wejście całkowitego RNA powinno wynosić od 2 do 10 μg. Objętość RNA powinna być mniejsza niż 15 μl. Zatem idealny wkład wynosi >150 ng/μl. -
MIKROBEnrich
- Pipeta 300 μl Bufor wiążący do probówki o pojemności 1,5 ml
- Dodaj 5–100 μg całkowitego RNA w maksymalnej objętości 30 μl i delikatnie wiruj
- Dodaj 2 μl Capture Oligo Mix dla 5 μg RNA w buforze wiążącym. Delikatnie postukaj w rurkę i krótko odkręć mieszankę.
- Mieszanina denaturacji w temperaturze 70°C przez 10 min
- Wyżarzać mieszaninę w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Przygotować koraliki podczas tej inkubacji.
- Przygotuj Oligo MagBeads (zwykle 25 μl), myjąc raz w wodzie wolnej od nukleaz, a raz w buforze wiążącym, chwytając kulki na stojaku magnetycznym między praniami. Przechowuj koraliki na lodzie. Podgrzej je do temperatury pokojowej 5 minut przed użyciem.
- Podgrzej roztwór myjący do 37°C w bloku grzewczym.
- Dodaj RNA/capture Oligo Mix do umytych Oligo MagBeads. Bardzo delikatnie wymieszaj rurkę i krótko odwiruj.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze 37°C przez 15 minut.
- Umieść rurkę w podstawce magnetycznej i odczekaj ~3 min.
- Odessać supernatant (zawiera mRNA) i przenieść go do probówki zbiorczej na lodzie.
- Dodaj 100 μl wstępnie podgrzanego roztworu do płukania do pobranych kulek. Delikatnie krótko wymieszaj koraliki.
- Uchwyć koraliki i odzyskaj supernatant. Połącz ten supernatant z mRNA w probówce zbiorczej na lodzie (~ 450 μl objętości końcowej).
- Umieść probówkę zbiorczą na lodzie. Jeśli ma być wykonana druga runda, wróć do sekcji 5.3) i powtórz procedurę. Alternatywnie natychmiast przełącz się na zestaw MICROBExpress (5.18, patrz poniżej).
- Zużyte OlioBeads można użyć po raz drugi. Zregeneruj oligobeady poprzez inkubację z 2 objętościami (zwykle 50 μl) roztworu regeneracyjnego 1 przez 1 godzinę. Uchwyć koraliki w magnetycznej podstawce. Przemyć je dwukrotnie 2 objętościami roztworu regeneracyjnego 2 (zwykle 50 μl) i ponownie zawiesić w pierwotnej objętości roztworu do sporządzania zawiesiny (zwykle 25 μl).
MICROBExpress
- Odpipetować 200 μl Bufor wiążący do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodaj 2-10 μg całkowitego RNA w maksymalnej objętości 15 μl i delikatnie odwiruj.
- Dodać 4 μl Capture Oligo Mix do RNA w buforze wiążącym. Delikatnie postukaj w rurkę i krótko odkręć mieszankę.
- Mieszanina denaturacji w temperaturze 70°C przez 10 min.
- Mieszanina do wyżarzania w temperaturze 37°C przez 15 minut Przygotuj koraliki podczas tej inkubacji.
- Przygotuj Oligo MagBeads, myjąc raz w wodzie wolnej od nukleaz, a następnie dwukrotnie przemywając w 50 μl buforu wiążącego, wychwytując kulki na stojaku magnetycznym między praniami. Zawiesić kulki w 50 μl bufora wiążącego i inkubować w temperaturze 37°C aż do użycia.
- Podgrzej roztwór myjący do 37°C w bloku grzewczym
- Vortex delikatnie umył Oligo MagBeads. Dodaj 50 μl Oligo MagBeads do RNA/capture Oligo Mix. Bardzo delikatnie wymieszaj rurkę i krótko odwiruj.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze 37°C przez 15 minut.
- Umieść rurkę w podstawce magnetycznej i odczekaj ~3 min.
- Odessać supernatant (zawiera mRNA) i przenieść go do probówki zbiorczej na lodzie.
- Dodaj 100 μl wstępnie podgrzanego roztworu do płukania do pobranych kulek. Delikatnie krótko wymieszaj koraliki.
- Uchwyć koraliki i odzyskaj supernatant. Połącz ten supernatant z mRNA w probówce zbiorczej na lodzie (~ 350 μl objętości końcowej).
- Jeśli ma być wykonana druga runda, wróć do punktu 5.18) i powtórz procedurę. Alternatywnie należy od razu przystąpić do wytrącania mRNA.
- Wytrącić i ponownie zawiesić mRNA:
- Do połączonego mRNA dodaj 35 μl octanu sodu i dodaj 7 μl glikogenu.
- Dodaj 1175 μl lodowatego 100% EtOH i dokładnie odwiruj.
- Osad należy utrzymywać w temperaturze -20°C przez co najmniej 1 godzinę.
- Wirować przez 30 minut przy 10.000 x g.
- Ostrożnie zdekantować i wyrzucić supernatant.
- Dodaj 750 μl lodowatego 70% EtOH i krótko zwiruj.
- Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g i odrzucić supernatant.
- Wykonaj drugie pranie 70% EtOH.
- Na krótko ponownie obrócić probówkę po wyrzuceniu drugiego prania 70% EtOH.
- Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
- Suszyć pelety na powietrzu przez 5 minut.
- Zawiesić osad RNA w 25 μl buforu TE lub wodzie wolnej od RNaz
- Nawadniaj RNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- W razie potrzeby energicznie wymieszać próbkę.
- Jeśli jest to konieczne, usuń pozostałe kulki, umieść probówkę na stojaku magnetycznym na ~ 3min i przenieś wzbogacone mRNA do nowej probówki wolnej od RNaz.
- Na tym etapie użyj Bioanalyzer lub Experion, aby sprawdzić zanieczyszczenie rRNA i jakość mRNA.
- Jest to potencjalny punkt zatrzymania. RNA może być przechowywane w temperaturze -80ºC.
Część 6: Amplifikacja mRNA
Ta część używa zestawu Ambion MessageAmp II- Bacteria zgodnie z instrukcjami producenta. Obliczanie miksów wzorcowych online pod adresem www.ambion.com/tools/ma2bact.
- Poliadenylacja matrycowego RNA:
- Umieść do 1000 ng całkowitego RNA (zwykle 100–500 ng) lub do 500 ng mRNA (zwykle 10–200 ng) w sterylnej probówce do mikrofugi bez RNaz. W pierwszym buforze należy użyć 6,5 μl próbki i nie ma wody wolnej od RNaz.
- Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70°C, najlepiej w termocyklerze.
- Wyjąć próbki RNA z inkubatora o temperaturze 70°C i krótko odwirować (~5 s), aby pobrać próbkę na dnie probówki. Umieść mieszaninę na lodzie na 3 minuty.
- Przygotować główną mieszankę poliadenylacji w probówce bez nukleaz w temperaturze pokojowej w kolejności pokazanej na karcie obliczeniowej. Zbierz wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla wszystkich próbek w eksperymencie, w tym ≤5% nadwyżki, aby pokryć błąd pipetowania. Delikatnie zwirować, aby uzyskać jednorodną mieszaninę bez inaktywacji enzymu, a następnie odwirować przez ~5 s, aby zebrać mieszankę wzorcową na dnie probówki.
- Przenieś 3,5 μl Polyadenylation Master Mix do każdej próbki RNA, dokładnie wymieszaj przez delikatne wirowanie, a następnie szybko odwiruj, aby zebrać reakcję.
- Umieścić próbki w inkubatorze o temperaturze 37°C. Inkubować reakcje przez 15 minut w temperaturze 37°C, a następnie krótko odwirować, aby zebrać reakcję na dnie probówki.
- Po inkubacji w temperaturze 37°C umieścić reakcje na lodzie i natychmiast przejść do odwrotnej transkrypcji.
- Odwrotna transkrypcja w celu syntezy pierwszej nici cDNA:
- Przygotuj główną mieszankę odwrotnej transkrypcji w probówce bez nukleaz w temperaturze pokojowej w kolejności pokazanej na arkuszu obliczeniowym. Zbierz wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla wszystkich próbek w eksperymencie, w tym ≤5% nadwyżki, aby pokryć błąd pipetowania. Delikatnie zwirować, aby uzyskać jednorodną mieszaninę bez inaktywacji enzymu, a następnie odwirować przez ~5 s, aby zebrać mieszankę wzorcową na dnie probówki.
- Przenieś 10 μl głównej mieszanki z odwrotną transkrypcją do każdej próbki, dokładnie wymieszaj przez delikatne wirowanie, a następnie szybko odwiruj, aby zebrać reakcję.
- Umieścić próbki w inkubatorze o temperaturze 42°C. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 42°C, a następnie krótko odwirować (~5 s), aby zebrać reakcję na dnie probówki.
- Umieść probówki na lodzie i natychmiast przystąp do syntezy drugiej nici cDNA.
- Synteza drugiej nici cDNA:
- Na lodzie przygotować drugą nić Master Mix, mieszając następujące odczynniki w kolejności podanej w arkuszu obliczeniowym. Zbierz wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla wszystkich próbek w eksperymencie, w tym ≤5% nadwyżki, aby pokryć błąd pipetowania. Delikatnie wirować, aby uzyskać jednorodną mieszaninę bez dezaktywacji enzymów, a następnie wirować przez ~5 s, aby zebrać mieszankę główną na dnie probówki.
- Przenieś 80 μl Second Strand Master Mix do każdej próbki, dokładnie wymieszaj przez delikatne wirowanie, a następnie szybko odwiruj, aby zebrać reakcję.
- Umieścić próbki w termocyklerze o temperaturze 16°C. Ważne jest, aby schłodzić blok termocyklera do 16°C przed dodaniem probówek reakcyjnych, ponieważ poddanie reakcji temperaturom >16°C zagrozi wydajności aRNA.
- Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 16°C Inkubować przez 2 godziny w termocyklerze o temperaturze 16°C. Jeśli nie można dostosować temperatury pokrywki do temperatury bloku 16°C, przykryj reakcje przy wyłączonej podgrzewanej pokrywie lub jeśli nie można wyłączyć pokrywy - nie przykrywaj nią rurek.
- Umieść reakcje na krótko na lodzie. Nie pozostawiaj reakcji na lodzie przez dłuższy czas.
- 5.4) Oczyszczanie cDNA:
- Wszystkie wirowania w tej procedurze oczyszczania powinny być wykonywane przy 10 000 x g (zwykle ~10 000 obr./min) w temperaturze pokojowej. Sprawdź bufor wiążący cDNA pod kątem wytrącania się przed użyciem. Jeśli osad jest widoczny, należy go ponownie rozpuścić, podgrzewając roztwór do 37°C przez maksymalnie 10 minut i energicznie wirując. Schłodzić do temperatury pokojowej przed użyciem.
- Przed rozpoczęciem oczyszczania cDNA podgrzej 10 ml butelkę wody wolnej od nukleaz do 50°C przez co najmniej 10 minut.
- Dodać 250 μl buforu wiążącego cDNA do każdej próbki i dokładnie wymieszać, delikatnie wirując.
- Wirować przez ~1 minutę przy 10 000 g lub do momentu, gdy mieszanina przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i wymień wkład filtra cDNA w rurze myjącej.
- Nałożyć 500 μl buforu płuczącego na każdy wkład filtra cDNA. Wirować przez ~1 minutę przy 10 000 g lub do momentu, gdy cały bufor płuczący przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i obracaj wkład filtra cDNA przez dodatkową minutę, aby usunąć śladowe ilości EtOH.
- Przenieś wkład filtra cDNA do probówki elucyjnej cDNA. Eluować cDNA za pomocą 20 μl wody wolnej od nukleaz o temperaturze 50°C. Ważne jest, aby do elucji cDNA używać wody wolnej od nukleaz o temperaturze 50 °C. Zimniejsza woda będzie mniej wydajna w elucji cDNA, a cieplejsza woda (>55°C) może spowodować zmniejszenie wydajności aRNA.
- Na środek filtra we wkładzie filtra cDNA nałóż 20 μl podgrzanej (50°C) wody wolnej od nukleaz. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 2 minuty, a następnie wiruj przez ~ 1,5 minuty przy 10 000 x g lub do momentu, gdy cała woda wolna od nukleaz przejdzie przez filtr. Dwuniciowy cDNA będzie teraz w elucie (~16 μl).
- W tym momencie oczyszczone cDNA można w tym momencie przechowywać przez noc w temperaturze –80°C, jeśli jest to pożądane.
- Transkrypcja in vitro w celu syntezy aRNA
- Zaleca się stosowanie pieca do hybrydyzacji ze względu na ich jednolitą temperaturę oraz niezwykle ważne jest, aby wewnątrz rur nie tworzyła się kondensacja. Zdecydowanie zalecamy 14-godzinną inkubację reakcji IVT, aby zmaksymalizować wydajność aRNA. Aby uzyskać najwyższą wydajność aRNA, należy przeprowadzić IVT w końcowej objętości reakcji 40 μl.
- W temperaturze pokojowej zmontuj IVT Master Mix, dodając odczynniki w kolejności podanej w arkuszu obliczeniowym. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując. Odwirować na krótko (~5 s), aby zebrać IVT Master Mix na dnie probówki i umieścić na lodzie.
- Przenieść IVT Master Mix do każdej próbki zgodnie z wytycznymi karty obliczeniowej, dokładnie wymieszać przez delikatne wirowanie, krótko odwirować w celu zebrania reakcji i umieścić probówki w inkubatorze o temperaturze 37°C.
- Inkubować przez 14 godzin w temperaturze 37°C.
- Po inkubacji dodaj wodę wolną od nukleaz do każdej próbki aRNA, aby doprowadzić końcową objętość do 100 μl. Dokładnie wymieszaj, delikatnie wirując. Umieść rozcieńczone aRNA na lodzie, jeśli etap oczyszczania aRNA zostanie wykonany natychmiast. Alternatywnie aRNA może być przechowywane w temperaturze –20°C.
- Oczyszczanie aRNA
- Wszystkie wirowania w tej sekcji powinny być wykonywane przy 10 000 x g (zwykle ~10 000 obr./min).
- Przed rozpoczęciem oczyszczania aRNA podgrzej 10 ml butelkę wody wolnej od nukleaz do 55°C przez > 10 minut.
- Dodaj 350 μl buforu wiążącego aRNA do każdej próbki aRNA. Dokładnie wymieszaj, delikatnie wirując i natychmiast przejdź do następnego kroku.
- Dodaj 250 μl 100% EtOH klasy ACS do każdej próbki aRNA i wymieszaj, pipetując mieszaninę w górę iw dół 3 razy. Nie mieszaj wirów, aby wymieszać. Przejdź natychmiast do następnego kroku, gdy tylko wymieszasz EtOH z każdą próbką.
- Umieść wkład filtra aRNA w probówce do zbierania aRNA i odpipetuj każdą mieszaninę próbek na środku filtra we wkładzie filtra aRNA.
- Wirować przez ~1 min przy 10 000 x g. Kontynuuj, aż mieszanina przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i wymień wkład filtra aRNA w probówce do zbierania aRNA.
- Nałożyć 650 μl buforu do przemywania na każdy wkład filtra aRNA. Wirować przez ~1 minutę przy 10 000 x g lub do momentu, gdy cały roztwór płuczący przejdzie przez filtr. Wyrzuć przepływ i obracaj wkład filtra aRNA przez dodatkowe ~1 minutę, aby usunąć śladowe ilości EtOH.
- Przenieś wkład (wkłady) filtra do świeżej probówki do pobierania aRNA. Do środka filtra dodaj 75 μl wody wolnej od nukleaz, która jest wstępnie podgrzana do 50–60°C. Wymień pojemnik z wodą wolną od nukleaz w inkubatorze o temperaturze 50–60°C.
- Pozostaw w temperaturze pokojowej na 2 minuty, a następnie wiruj przez ~1,5 minuty przy 10 000 x g lub do momentu, gdy roztwór przejdzie przez filtr.
- Powtórzyć elucję z drugim 75 μl wody wolnej od nukleaz. aRNA będzie teraz znajdować się w probówce do pobierania aRNA w ~150 μl wody wolnej od nukleaz. Wyrzuć wkład filtra aRNA.
- Przechowuj aRNA w temperaturze –80°C i zminimalizuj wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie.
Część 7: synteza cDNA
Ta część korzysta z zestawu Promega Universal RiboClone cDNA Synthesis System z niewielką modyfikacją w stosunku do instrukcji producenta. Wejście standardowe 2 μg; W przypadku sekwencjonowania 454 zaleca się rozpoczęcie od 10 μg. Jeśli stężenie jest zbyt niskie, aRNA można zagęścić za pomocą wytrącania EtOH lub stężenia próżniowego. Jeśli jako wejście RNA stosuje się 10 μg, należy zwiększyć liczbę wszystkich odczynników o współczynnik 5Enzymy występują w różnych jednostkach w każdej partii, dlatego za każdym razem należy obliczać objętości.
- Synteza pierwszej nici:
- Weź probówkę PCR o pojemności 0,5 ml i dodaj:
Próbka mRNA
2 μg (lub 10 μg, jeśli jest używane do sekwencjonowania 454)
Losowy podkład sześciokątny (0,5 mg / ml)
2 μl
Woda wolna od nukleaz do objętości
0 (lub non to próbka została rozcieńczona)
Całkowita objętość
15 μl
- Podgrzej reakcję do 70°C przez 10 minut. Schłodź probówkę na lodzie przez 5 minut i krótko wiruj, aby zebrać roztwór na dnie probówki.
- Dodaj następujące składniki w podanej kolejności:
próbka
15 μl
Bufor pierwszej żyły 5X
5 μl
RNasin Inhibitor rybonukleazy 40 u
1 μl ... 40 μl
Całkowita objętość
21 μl
- Wymieszaj reakcję i krótko odwiruj. Podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 37°C przez 5 min.
- Dodaj następujące składniki:
| Próbka z kroku 1 | 21,0 μl |
| Pirofosforan sodu, 40 mM | 2,5 μl |
| AMV Odwrócona trankryptaza 30 u | 1,5 μl ... 22 μl/μl |
| Woda wolna od nukleaz | 0,0 μl |
| Całkowita objętość | 25,0 μl |
- Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w piecu do hybrydyzacji.
- Po inkubacji umieścić reakcję na lodzie.
- Synteza drugiej nici:
- Dodaj następujące składniki:
Reakcja pierwszej nici
25,0 μl
Druga nić Bufor 2,5X
40,0 μl
BSA, 1 mg/ml
5,0 μl
Polimeraza DNA I 23 u
3,0 μl
RNaza H 0,8 u
0,5 μl ... 1,5 μl
Woda wolna od nukleaz
26,5 μl
Całkowita objętość
100,0 μl
- Delikatnie wymieszaj, przesuwając tubkę. Inkubować reakcje w temperaturze 14°C przez 2 godziny w termocyklerze. Ważne jest, aby schłodzić termocykler do 14°C przed dodaniem probówek reakcyjnych. Nie pozwól, aby reakcja przekroczyła 14°C przed lub w trakcie reakcji.
- Aby zakończyć reakcję, dodaj 2 jednostki polimerazy DNA T4 na μg wejściowego mRNA do reakcji. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 14°C.
- Zatrzymać reakcję, dodając 10 μl EDTA poddanego działaniu 500 mM DEPC i umieścić na lodzie.
- Oczyść cDNA za pomocą wytrącania EtOH lub systemu Promega Wizard DNA-Cleanup System zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowuj próbki w temperaturze -80°C. Dwuniciowe cDNA można w tym momencie bezpośrednio pirosekwencjonować.