Artykuł metodologiczny
Test w labiryncie z krzyżującym się ramieniem (elevated plus maze) jest jednym z najpowszechniej stosowanych testów do pomiaru zachowań lękowych u myszy. W niniejszym materiale prezentujemy film przedstawiający szczegółowe procedury przeprowadzania tego testu.
Protokół
Mimo że genom myszy został zsekwencjonowany, funkcje większości genów pozostają nieznane. Techniki modyfikacji genetycznej umożliwiają delecję lub inną manipulację specyficznym genem u myszy (Austin et al., 2004; Aiba et al., 2007). Wpływ danego genu na konkretne zachowanie można następnie określić, przeprowadzając analizy behawioralne myszy mutantów (Takao and Miyakawa, 2006b; Takao et al., 2007).
Test wzniesionego labiryntu krzyżowego jest jednym z najpopularniejszych testów spośród wszystkich obecnie dostępnych modeli zwierzęcych lęku (Rodgers and Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Ten test zachowań lękowych stosowany jest do przesiewania i fenotypowania myszy transgenicznych oraz nokautowych (Crawley, 1999), a także w procesie odkrywania leków (Hogg et al. 1996; Crawley, 2007). Test wzniesionego labiryntu krzyżowego posiada wysoką trafność prognostyczną w badaniach przesiewowych leków anksjolitycznych (Rodgers and Dalvi, 1997; Mechiel Korte and De Boer, 2003; Crawley, 2007); leki anksjolityczne specyficznie zwiększają, a leki anksjogenne specyficznie zmniejszają liczbę wejść do otwartych ramion oraz czas spędzony w nich. Całkowita liczba wejść oraz całkowity dystans są uznawane za użyteczny wskaźnik ogólnej aktywności. Całkowita liczba wejść jest również wskaźnikiem lęku, natomiast odsetek wejść i czas spędzony w każdym ramieniu stanowią wskaźnik lęku pierwotnego (Rodgers and Dalvi, 1997, Mechiel Korte and De Boer, 2003). Przyjmuje się, że ramiona otwarte i zamknięte wywołują taki sam popęd eksploracyjny, zatem unikanie ramion otwartych uznaje się za wynik indukcji wyższego poziomu strachu (Rodgers and Dalvi, 1997). Uważa się, że niechęć myszy do eksploracji otwartych ramion labiryntu jest spowodowana lękiem przed otwartymi i wyniesionymi przestrzeniami.
W 1984 roku Handley i Mithani opisali wstępne prace z wykorzystaniem wspomnianego wyżej testu w labiryncie w kształcie podwyższonego krzyża (plus maze). Oryginalna aparatura testowa była uniesiona na wysokość 70 cm nad podłogą i składała się z dwóch ramion zamkniętych oraz dwóch otwartych, z których każde miało wymiary 45 cm długości i 10 cm szerokości. W swoich początkowych badaniach autorzy podawali stosunek liczby wejść do ramion otwartych do całkowitej liczby wejść (Handley and Mithani, 1984). Następnie opracowano inne wskaźniki, które obejmowały liczbę wejść do ramion zamkniętych i otwartych oraz czas spędzony w ramionach zamkniętych i otwartych dla szczurów (Pellow et al, 1985; Pellow and File, 1986) oraz myszy (Lister, 1987).
Zmiany w teście podniesionego krzyżowego labiryntu obejmowały wydłużenie zarówno ramion otwartych (50 x 10 cm), jak i ramion zamkniętych (50 x 10 x 40 cm) z wysokimi ściankami bocznymi i otwartym dachem w ramionach zamkniętych, a cały labirynt został podniesiony na wysokość 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow and File, 1986). Obecnie w naszym laboratorium aparat do testu podniesionego krzyżowego labiryntu jest skonfigurowany w kształcie znaku +, z dwoma ramionami otwartymi (25 x 5 cm, z bardzo niską, 0,5-cm ścianką) znajdującymi się naprzeciw siebie i prostopadle do dwóch ramion zamkniętych (25 x 5 x 16 cm), i jest uniesiony 50 cm nad podłogą (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005; Miyamoto et al, 2005; Arrow et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al; 2008). Myszy umieszcza się w centrum znaku + (5 cm x 5 cm) i pozwala jej na swobodną eksplorację labiryntu. Choć powszechnie stosuje się 5-minutowy czas rejestracji, w naszym protokole zachowanie jest rejestrowane przez 10 min, aby zwiększyć szansę na wykrycie fenotypu. Otwarte i zamknięte ramiona labiryntu wywołują konflikt eksploracyjny (Mechiel Korte and De Boer, 2003; Crawley, 2007).
Parametry testu w labiryncie krzyżowym z wyniesionymi ramionami są rejestrowane przez obserwatora podczas eksperymentu. W naszym laboratorium test jest nagrywany kamerą wideo podłączoną do komputera, a dane behawioralne (Image EP) są pozyskiwane i analizowane przy użyciu programu Image EP. Liczba wejść na ramiona otwarte w stosunku do całkowitej liczby wejść na ramiona oraz czas spędzony na ramionach otwartych w stosunku do ramion zamkniętych stanowią miary zachowań lękowych.
Oceniliśmy ponad 90 szczepów genetycznie zmodyfikowanych myszy mutantów, stosując protokół przedstawiony w filmie, i dysponujemy dużym zestawem surowych danych dla ponad 5000 myszy (w tym myszy typu dzikiego oraz mutantów). W naszej baterii testów w charakterze kontroli zazwyczaj wykorzystuje się rodzeństwo typu dzikiego. Jako szczep tła powszechnie stosuje się myszy C57BL/6J. Zebraliśmy dane dotyczące myszy C57BL/6J w testach behawioralnych. Wartości uzyskane od myszy C57BL/6J w naszym teście w labiryncie krzyżowym z wyniesionymi ramionami są następujące (n=914; średnia ± SEM); całkowity przebyty dystans: 1547,55 ± 14,27 cm; czas przebywania: 56,49 ± 2,42 s (ramiona otwarte), 384,02 ± 3,13 s (ramiona zamknięte), 161,90 ± 2,17 s (centrum labiryntu); stosunek czasu spędzonego w ramionach otwartych: 9,19 ± 0,36%, stosunek czasu spędzonego w ramionach zamkniętych: 63,82 ± 0,52%; liczba wejść: 7,64 ± 0,21 (ramiona otwarte), 24,32 ± 0,28 (ramiona zamknięte); % wejść do ramion otwartych: 21,9 ± 0,05, % wejść do ramion zamkniętych: 78,1 ± 0,05. Myszy C57BL/6J spędzają mniej czasu w ramionach otwartych niż w zamkniętych (p<0.0001, n=914, test t-studenta dla prób zależnych). Wskazuje to, że myszy C57BL/6J mają tendencję do unikania ramion otwartych, a czas spędzony w ramionach otwartych jest wiarygodnym wskaźnikiem zachowań lękowych. Dodatkowo, kolejność prób jest zrównoważona pomiędzy genotypami, ponieważ numer próby wpływa na czas spędzony w ramionach otwartych i na platformie centralnej. Oznacza to, że wszystkie wskaźniki wzrastają w przypadku 3. i 4. myszy w porównaniu z 1. myszą (p=0.0089, n=476) (dane nieopublikowane). Zgodnie z naszym protokołem, analiza ponad 1661 myszy wykazała, że sekwencyjna kolejność testowania myszy z klatki nie wpływa znacząco na czas przebywania w ramionach otwartych (dane nieopublikowane). Innymi słowy, wyniki pierwszej myszy wyjętej z klatki nie różnią się istotnie od wyników drugiej, trzeciej lub ostatniej myszy.
Choć zarówno test podniesionego krzyża, jak i test przejścia jasny/ciemny są wykorzystywane do oceny zachowań lękowych, wyniki uzyskane w tych testach nie zawsze są spójne (Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, w druku). Na przykład myszy z knockoutem kalcyneuryny specyficznym dla przedmózgu spędzają mniej czasu w jasnej komorze w teście przejścia jasny/ciemny, ale więcej czasu w otwartych ramionach w teście podniesionego krzyża (Miyakawa et al., 2003). Analiza czynnikowa naszego zestawu testów behawioralnych wskazuje, że test podniesionego krzyża i test przejścia jasny/ciemny oceniają różne aspekty zachowań lękowych, takie jak lęk przed jasną przestrzenią w teście przejścia jasny/ciemny oraz zachowania lękowe związane z otwartą przestrzenią w teście otwartego pola (Takao and Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). W związku z tym zarówno test przejścia jasny/ciemny, jak i test podniesionego krzyża zostały włączone do naszego zestawu testów behawioralnych.
Crabbe i współpracownicy zgłosili, że niekontrolowane zmienne oraz eksperymenty charakteryzujące mutanty mogą prowadzić do wyników specyficznych dla konkretnego laboratorium (Crabbe et al., 1999). Różnice proceduralne występujące między laboratoriami utrudniają replikację lub porównywanie uzyskanych wyników. Stworzenie dokumentacji wizualnej protokołu przyczyni się do lepszego zrozumienia procedur eksperymentalnych, umożliwiając standaryzację protokołów stosowanych w różnych laboratoriach oraz porównywanie fenotypów behawioralnych różnych szczepów myszy mutantów ocenianych za pomocą tych testów. Wcześniej opublikowaliśmy protokół wideo testu przejścia światło/ciemność (Takao and Miyakawa, 2006a). Podobnie, filmy z innych protokołów, takich jak test otwartego pola, test wymuszonego pływania Porsolta oraz testy warunkowania lękowego, które wykorzystujemy w naszej baterii testów behawioralnych, są obecnie przygotowywane do publikacji w formie przyszłych artykułów w czasopiśmie wideo.
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Kioto.
Badania te były wspierane przez Granty na Badania Naukowe Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS), Grant z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii, Granty z BIRD oraz CREST Japońskiej Agencji Nauki i Technologii, Grant z Japońskiego Centrum Neuroinformatyki (NIJC), RIKEN oraz Grant na Badania Naukowe w Obszarach Priorytetowych – Zintegrowane Badania nad Mózgiem (Shien) z MEXT w Japonii. Dziękujemy firmie O'hara & Co. oraz Mariko Hayashi za pomoc w przygotowaniu tego filmu.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Labirynt w krzyżyku (Elevated plus maze) | Narzędzie | O’hara Co. | (brak) |
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie