Method Article

Elevated Plus Labirynt dla myszy

DOI:

10.3791/1088

⸱

December 22nd, 2008

 ,  , 
1Genetic Engineering and Functional Genomics Unit, Frontier Technology Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 2Institute for Comprehensive Medical Science Division of Systems Medicine, Fujita Health University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test podwyższonego labiryntu jest jednym z najczęściej używanych testów do pomiaru zachowań podobnych do lęku u myszy. W tym miejscu prezentujemy film przedstawiający szczegółowe procedury przeprowadzania testu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Chociaż genom myszy jest obecnie całkowicie zsekwencjonowany, funkcje większości genów ulegających ekspresji w mózgu nie są znane. Wpływ danego genu na określone zachowanie można określić za pomocą analizy behawioralnej zmutowanych myszy. Jeśli gen docelowy ulega ekspresji w mózgu, fenotyp behawioralny zmutowanych myszy może wyjaśnić genetyczny mechanizm normalnych zachowań. Test labiryntu elevated plus jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru zachowań podobnych do lęku. Test opiera się na naturalnej awersji myszy do otwartych i podwyższonych obszarów, a także na ich naturalnym spontanicznym zachowaniu eksploracyjnym w nowych środowiskach. Aparat składa się z ramion otwartych i zamkniętych, skrzyżowanych pośrodku prostopadle do siebie oraz obszaru środkowego. Myszy mają dostęp do wszystkich ramion i mogą swobodnie poruszać się między nimi. Liczba wejść do otwartych ramion i czas spędzony w otwartych ramionach są używane jako wskaźniki lęku wywołanego otwartą przestrzenią u myszy. Niestety, różnice proceduralne, które istnieją między laboratoriami, utrudniają powielanie i porównywanie wyników między laboratoriami. Tutaj prezentujemy szczegółowy film demonstrujący nasz protokół dla testu podwyższonego plusa labiryntu. W naszym laboratorium przebadaliśmy ponad 90 szczepów zmutowanych myszy przy użyciu protokołu pokazanego na filmie. Dane te zostaną ujawnione w ramach publicznej bazy danych, którą obecnie budujemy. Wizualizacja protokołu przyczyni się do lepszego zrozumienia szczegółów całej procedury eksperymentalnej, co pozwoli na standaryzację protokołów stosowanych w różnych laboratoriach i porównanie fenotypów behawioralnych różnych szczepów zmutowanych myszy ocenianych za pomocą tego testu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół

  1. Aparatura używana do badania labiryntu na podwyższonym plusie ma konfigurację + i składa się z dwóch otwartych ramion (25 x 5 x 0,5 cm) naprzeciwko siebie i prostopadłych do dwóch zamkniętych ramion (25 x 5 x 16 cm) z platformą środkową (5 x 5 x 0,5 cm). Otwarte ramiona mają bardzo małą (0,5 cm) ściankę, aby zmniejszyć liczbę upadków, podczas gdy zamknięte ramiona mają wysoką (16 cm) ściankę, aby objąć ramię. Cała aparatura znajduje się 50 cm nad podłogą (Ohara & Co., Tokio) i jest umieszczona w pustym okrągłym zbiorniku (100 cm średnicy, 35 cm wysokości; zwykle używany do zadania labiryntu wodnego Morrisa) w celu ochrony myszy, które upadną lub próbują uciec podczas eksperymentu. Aparat wykonany jest z tworzywa sztucznego. Platforma jest biała, a ściany są przezroczyste. Istnieje zróżnicowanie w materiałach i kolorach aparatu podwyższonego plus labiryntu.
  2. Myszy są trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światła włączają się o 7:00 rano), jak opisano wcześniej (Takao i Miyakawa, 2006a). Testy behawioralne wykonywane są w godzinach od 9:00 do 18:00. Wszystkie myszy eksperymentalne są przenoszone do pomieszczenia do testowania zachowania 30 minut przed rozpoczęciem pierwszej próby, aby przyzwyczaić się do stanu pomieszczenia do testowania zachowania. Kolejność prób jest zrównoważona we wszystkich genotypach. Istnieją dwa cele badania klinicznego z wykorzystaniem zwierzęcia ćwiczącego. Jednym z nich jest upewnienie się, że wszystko jest w porządku z systemem nagrywania. Innym jest utrzymanie jak najbardziej jednolitych warunków testowania. Oznacza to, że pierwsza mysz w całej sesji doświadczyłaby nieco innych warunków z innymi (tj. bez wcześniejszych dźwięków wydawanych podczas operacji testowych i bez sygnałów zapachowych z poprzednich prób) bez takiej próby praktycznej. Zwierzęta są utrzymywane zgodnie z wytycznymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu w Kioto.
  3. Sala do badań behawioralnych (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co., Tokio) jest dźwiękoszczelna, a poziom oświetlenia utrzymywany jest na poziomie 100 luksów. Mysz umieszcza się w środkowej części labiryntu z głową skierowaną w stronę zamkniętego ramienia. Test labiryntu na podwyższonym poziomie plus jest rejestrowany za pomocą kamery wideo podłączonej do komputera, która jest sterowana przez zdalne urządzenie. Liczba wejść (wpis definiuje się jako środek masy myszy wchodzący do ramienia) do każdego ramienia i czas spędzony w otwartych ramionach są rejestrowane, a pomiary te służą jako wskaźnik zachowań podobnych do lęku.
  4. Myszy mogą swobodnie poruszać się po labiryncie przez 10 minut. Każda mysz otrzymuje jedną próbę w naszej testowej baterii. Aplikacja służąca do pozyskiwania i analizowania danych behawioralnych (Image EP) jest oparta na domenie publicznej programie Image J (opracowanym przez Wayne'a Rasbanda w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i dostępnym pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/), który został zmodyfikowany przez Tsuyoshi Miyakawę (dostępny za pośrednictwem O'Hara & Co., Tokio, Japonia).
  5. Przebyty dystans, liczba wejść do każdego ramienia, czas spędzony w każdym ramieniu oraz procent wejść do otwartych ramion są obliczane przez program Image EP.
  6. Po każdej próbie wszystkie ramiona i obszar środkowy są czyszczone wodą super podchlorawą, która jest skutecznym środkiem usuwającym zapachy i ma stosunkowo słaby zapach sam w sobie w porównaniu z innymi roztworami czyszczącymi, aby zapobiec odchyleniu opartemu na sygnałach węchowych. Dzięki temu możemy przeprowadzać testy w kontrolowanych warunkach dotyczących sygnałów węchowych.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż genom myszy został zsekwencjonowany, funkcje większości genów nie są znane. Techniki modyfikacji genetycznej pozwalają na delecję lub inną manipulację określonym genem u myszy (Austin i wsp., 2004; Aiba i wsp., 2007). Wpływ danego genu na określone zachowanie można następnie określić, przeprowadzając analizy behawioralne zmutowanych myszy (Takao i Miyakawa, 2006b; Takao i wsp., 2007).

Test podwyższonego labiryntu plus jest jednym z najpopularniejszych testów spośród wszystkich dostępnych obecnie zwierzęcych modeli lęku (Rodgers i Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Ten test na zachowanie podobne do lęku został wykorzystany do badań przesiewowych i fenotypowania myszy transgenicznych i nokautujących (Crawley, 1999) oraz do odkrywania leków (Hogg i in. 1996; Crawley, 2007). Test podwyższonego labiryntu plus ma silną trafność predykcyjną dla badań przesiewowych leków przeciwlękowych (Rodgers i Dalvi, 1997; Mechiel Korte i De Boer, 2003; Crawley, 2007); Leki przeciwlękowe specyficznie zwiększają, a leki przeciwlękowe specyficznie zmniejszają, liczbę wejść do otwartych ramion i czas tam spędzony. Łączna liczba wpisów i całkowity dystans są uważane za użyteczny wskaźnik ogólnej aktywności. Łączny wynik wpisów jest również wskaźnikiem lęku, a procenty wpisów i czas spędzony w każdym ramieniu stanowią wskaźnik lęku pierwotnego (Rodgers i Dalvi, 1997, Mechiel Korte i De Boer, 2003). Uważa się, że otwarte i zamknięte ramiona wywołują ten sam popęd eksploracyjny, dlatego unikanie otwartych ramion uważa się za wynik indukcji wyższych poziomów strachu (Rodgers i Dalvi, 1997). Uważa się, że niechęć myszy do eksploracji otwartych ramion labiryntu jest spowodowana strachem przed otwartymi i podwyższonymi przestrzeniami.

W 1984 roku Handley i Mithani poinformowali o wstępnych pracach nad testem labiryntu z podwyższonym X (plus) opisanym powyżej. Oryginalna aparatura badawcza była podniesiona na wysokość 70 cm nad podłogą i składała się z dwóch zamkniętych i dwóch otwartych ramion, z których każde miało 45 cm długości i 10 cm szerokości. W swoich początkowych badaniach podali stosunek otwartych do całkowitych wejść w ramię (Handley i Mithani, 1984). Następnie opracowano inne wskaźniki, które obejmowały liczbę wejść do zamkniętych i otwartych ramion oraz czas spędzony w zamkniętych i otwartych ramionach dla szczurów (Pellow i in., 1985; Pellow i File, 1986) i myszy (Lister, 1987).

Zmiany w teście labiryntu z podniesionym plusem obejmowały wydłużenie zarówno ramion otwartych (50 x 10 cm), jak i ramion zamkniętych (50 x 10 x 40 cm) z wysokimi ścianami otaczającymi i otwartym dachem na zamkniętych ramionach, a cały labirynt został podniesiony na wysokość 50 cm (Pellow i in., 1985; Pellow i File, 1986). Obecnie w naszym laboratorium aparatura testowa z podwyższonym labiryntem jest skonfigurowana w kształcie +, z dwoma otwartymi ramionami (25 x 5 cm, z bardzo cienką, 0,5-centymetrową ścianką) naprzeciwko siebie i prostopadłą do dwóch zamkniętych ramion (25 x 5 x 16 cm) i jest podniesiona 50 cm nad podłogą (Miyakawa i wsp., 1996; Manabe i inni, 2000; Miyakawa i inni, 2001; Seeger i wsp., 2004; Morishima i wsp., 2005; Miyamoto i wsp., 2005; Arrow i wsp., 2006; Hattori i wsp., 2007; Niemann i wsp., 2007; Sano i wsp., 2008; Horii i wsp., 2008; Fukuda i wsp., 2008; Ikeda i wsp.; 2008). Mysz jest umieszczona w środku + (5 cm x 5 cm) i może swobodnie eksplorować labirynt. Chociaż nagrywanie w 5 minut jest powszechne, zachowanie jest rejestrowane przez 10 minut w naszym protokole, aby zwiększyć możliwość wykrycia fenotypu. Otwarte i zamknięte podniesione ramiona wywołują konflikt eksploracyjny (Mechiel Korte i De Boer, 2003; Crawley, 2007).

Pomiary testu podwyższonego plusa labiryntu są rejestrowane przez obserwatora podczas eksperymentu. W naszym laboratorium test jest rejestrowany za pomocą kamery wideo podłączonej do komputera, a dane behawioralne (Image EP) są pozyskiwane i analizowane za pomocą programu Image EP. Liczba wejść na otwarte ramiona w porównaniu z całkowitą liczbą wejść z otwartymi ramionami oraz czas spędzony na otwartych ramionach w porównaniu z zamkniętymi ramionami, dostarczają miar zachowań podobnych do lęku.

Oceniliśmy ponad 90 szczepów genetycznie zmodyfikowanych zmutowanych myszy przy użyciu protokołu pokazanego w filmie i mamy duży zestaw surowych danych dla ponad 5000 myszy (w tym myszy typu dzikiego i zmutowanego). W naszej baterii testowej rodzeństwo z miotu typu dzikiego jest zwykle używane jako kontrola. Jako szczep tła myszy C57BL/6J są szeroko stosowane. Zebraliśmy dane myszy C57BL / 6J w testach behawioralnych. Wartości uzyskane od myszy C57BL / 6J w naszym teście podwyższonego plusa labiryntu są następujące (n = 914; średnia SEM); całkowity przebyty dystans: 1547,55 14,27 cm; Czas spędzenia: 56,49 2,42 s (otwarte ramiona), 384,02 3,13 s (zamknięte ramiona), 161,90 2,17 s (środek labiryntu); stosunek czasu spędzonego w otwartych ramionach: 9,19 0,36%, stosunek czasu spędzonego w zamkniętych ramionach: 63,82 0,52%; Liczba zgłoszeń: 7,64 0,21 (otwarte ramiona), 24,32 0,28 (zamknięte ramiona); % wejść z otwartymi ramionami: 21,9 0,05, % wejść z zamkniętymi ramionami: 78,1 0,05. Myszy C57BL/6J spędzają mniej czasu w otwartych ramionach niż w zamkniętych ramionach (p<0,0001, n=914, test parzystego t). Oznacza to, że myszy C57BL/6J mają tendencję do unikania otwartych ramion, a czas spędzony w otwartych ramionach jest ważnym wskaźnikiem zachowań podobnych do lęku. Dodatkowo, kolejność prób jest zrównoważona we wszystkich genotypach, ponieważ liczba próby wpływa na czas spędzony w otwartych ramionach i na platformie środkowej. Oznacza to, że wszystkie wskaźniki rosną podczas 3. i 4. myszy w porównaniu z 1. myszami (p = 0,0089, n = 476) (dane niepublikowane). Dzięki naszemu protokołowi analiza ponad 1661 myszy wykazała, że sekwencyjna kolejność myszy testowanych w klatce nie wpływa znacząco na czas przebywania w otwartym ramieniu (dane niepublikowane). Oznacza to, że wyniki pierwszych myszy pobranych z klatki nie różnią się znacząco od wyników drugich, trzecich lub ostatnich myszy.

Chociaż zarówno test podwyższonego plusa labiryntu, jak i test przejścia światło/ciemność są używane do oceny zachowań podobnych do lęku, wyniki nie zawsze są między nimi spójne (Holmes i in., 2000; Tujimura i wsp., 2008; Na przykład myszy z nokautem kalcyneuryny specyficzne dla przodomózgowia spędzały mniej czasu w komorze światła w teście przejścia światło/ciemność, ale zwiększoną ilość czasu w otwartych ramionach w teście podwyższonego labiryntu plus (Miyakawa i wsp., 2003). Analiza czynnikowa naszej baterii testów behawioralnych wskazuje, że test podwyższonego labiryntu plus i test przejścia światło/ciemność oceniają różne aspekty zachowań podobnych do lęku, takich jak lęk przed jasną przestrzenią w teście przejścia światło/ciemność i zachowanie podobne do lęku w otwartej przestrzeni w teście otwartego pola (Takao i Miyakawa, 2006b; Yamasaki i inni, 2006). W związku z tym zarówno test przejścia światło/ciemność, jak i test labiryntu elevated plus są zawarte w naszej baterii testów behawioralnych.

Crabbe i współpracownicy stwierdzili, że niekontrolowane zmienne i eksperymenty charakteryzujące mutanty mogą dawać wyniki specyficzne dla konkretnego laboratorium (Crabbe i in., 1999). Różnice proceduralne istniejące między laboratoriami utrudniają powielanie lub porównywanie wyników między nimi. Stworzenie wizualnej dokumentacji protokołu przyczyni się do lepszego zrozumienia procedur eksperymentalnych, co pozwoli na standaryzację protokołów stosowanych w różnych laboratoriach oraz na porównania fenotypów behawioralnych różnych szczepów zmutowanych myszy ocenianych za pomocą tych testów. Wcześniej opublikowaliśmy protokół filmowy testu przejścia światło/ciemność (Takao i Miyakawa, 2006a). Podobnie, filmy z innymi protokołami, takimi jak test na otwartym polu, test wymuszonego pływania porsolt i testy warunkowania strachu, których używamy w naszej baterii testów behawioralnych, są obecnie przygotowywane do publikacji jako przyszłe artykuły w czasopismach wideo.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Kioto.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Grants-in-Aid for Scientific Research Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS), Grant-in-Aid od Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii w Japonii, Grants-in-Aid od BIRD i CREST of Japan Science and Technology Agency, Grant-in-Aid od Neuroinformatics Japan Center (NIJC), RIKEN oraz przez Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas-Integrative Brain Research (Shien)- z MEXT w Japonii. Dziękujemy O'hara & Co. oraz Mariko Hayashi za pomoc w tworzeniu tego filmu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Podwyższony plus labiryntToolO' hara Co.(brak)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. J Vis Exp. , (2006).
  2. Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
  3. The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
  4. Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
  5. Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotyping of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
  6. Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd edition, John Wiley and Sons. New York. 240 (2007).
  7. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defense and the elevated plus-maze. Neurosci Behav Rev. 21, 801-810 (1997).
  8. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 324, 1-5 (1984).
  9. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Meth. 14, 149-167 (1985).
  10. File, S. E., Pellow, S. The effects of triazolobenzodiazepines in two animal tests of anxiety and in the holeboard. Br J Pharmac. 86, 729-7235 (1985).
  11. Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology. 92, 180-185 (1987).
  12. Miyakawa, T., Yagi, T., Kagiyama, A., Niki, H. Radial maze performance, open-field and elevated plus-maze behaviors in Fyn-kinase deficient mice: further evidence for increased fearfulness. Brain Res Mol Brain Res. 37, 145-150 (1996).
  13. Manabe, T. Loss of cadherin-11 adhesion receptor enhances plastic changes in hippocampal synapses and modifies behavioral responses. Mol Cell Neurosci. 15, 534-546 (2000).
  14. Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
  15. Seeger, T. M2 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
  16. Morishima, Y. Enhanced cocaine responsiveness and impaired motor coordination in metabotropic glutamate receptor subtype 2 knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 4170(2005).
  17. Miyamoto, T. Tight junctions in Schwann cells of peripheral myelinated axons: a lesson from claudin-19-deficient mice. J Cell Biol. 169, 527-538 (2005).
  18. NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21. Nature. 441, 595-600 (2006).
  19. Hattori, S. Enriched environments influence depression-related behavior in adult mice and the survival of newborn cells in their hippocampi. Behav Brain Res. 180, 69-76 (2007).
  20. Niemann, S. Genetic ablation of NMDA receptor subunit NR3B in mouse reveals motoneuronal and non-motoneuronal phenotypes. Europ J Neurosci. 26, 1407-1420 (2007).
  21. Sano, H., Nagai, Y., Miyakawa, T., Shigemoto, R., Yokoi, M. Increased social interaction in mice deficient of the striatal medium spiny neuron-specific phosphodiesterase 10A2. J Neurochem. 105, 546-556 (2008).
  22. Horii, Y., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Shiosaki, S. Increased anxiety-like behavior in neuropsin (kallikrein-related peptidase 8) gene-deficient mice. Behav Neurosci. 122, 498-504 (2008).
  23. Fukuda, E. Down-regulation of protocadherin-α, A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur J Neurosci. , In Press Forthcoming.
  24. Ikeda, M. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Behav Neurosci. , In Press Forthcoming.
  25. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. Eur J Phamacol. 463, 163-175 (2003).
  26. Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54, 21-30 (1996).
  27. Holmes, A., Parmigiani, S., Ferrari, P. F., Palanza, P., Rodgers, R. J. Behavioral profile of wild mice in the elevated plus-maze test for anxiety. Physiol Behav. 71, 509-516 (2000).
  28. Tsujimura, A., Matsuki, M., Takao, K., Yamanishi, K., Miyakawa, T., Hashimoto-Gotoh, T. Mice lacking the kf-1 gene exhibit increased anxiety- but not despair-like behavior. Front. Behav. Neurosci. 10, In Press (2008).
  29. Nakajima, R., Takao, K., SM, H. uang, Takano, J., Iwata, N., Miyakawa, T., Saido, T. C. Comprehensive Behavioral Phenotyping of Calpastatin-Knockout Mice. Molecular Brain. , In Press Forthcoming.
  30. Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
  31. Factor analyses of large-scale data justify the behavioral test battery strategy to reveal the functional significances of the genes expressed in the brain. Yamasaki, N. The 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, 2006 October 14–18, Atlanta, Georgia, , Program number 100.15, Poster Number PP32 (1985).
  32. Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Scienc. 284, 1670-1672 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elevated Plus MazeAnxiety like BehaviorMouse Behavioral TestOpen Arm EntriesTime Spent Open ArmsMutant Mice AnalysisBehavioral PhenotypingGenetic Mechanism StudyAnxiety Research ProtocolLaboratory Standardization

Related Articles