Homing komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje protokół stosowany do badania homingu komórek krwiotwórczych do ich nisz w szpiku kostnym.

Streszczenie

Homing jest zjawiskiem, dzięki któremu przeszczepione komórki krwiotwórcze są w stanie dotrzeć do szpiku kostnego, a następnie ulec engraftingowi lub tam osiąść. W procesie homingu hematopoetycznych komórek macierzystych uczestniczą różne chemokiny i receptory. [1, 2]

Niniejszy artykuł przedstawia klasyczny protokół homingu stosowany w badaniach nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi. Generalnie proces ten polega na wyizolowaniu populacji komórek, której zdolność do homingu ma zostać zbadana, zabarwieniu tej populacji odpowiednim barwnikiem i wstrzyknięciu komórek do krwiobiegu zwierzęcia biorcy. Następnie zwierzę biorca jest uśmiercane w określonym czasie po wstrzyknięciu, a w szpiku kostnym ocenia się procent lub bezwzględną liczbę komórek wykazujących pozytywny wynik dla zastosowanego barwnika. W jednym z najczęstszych schematów doświadczalnych porównuje się wydajność homingu komórek hematopoetycznych pochodzących od dwóch genetycznie różnych zwierząt (zwierzęcia typu dzikiego oraz odpowiadającego mu knockoutu). Niniejszy artykuł opisuje protokół homingu komórek hematopoetycznych w ramach takiego eksperymentu.

Protokół

1. Eksperyment homingu rozpoczynamy od wyizolowania komórek, które zostaną w nim wykorzystane. W niniejszym badaniu chcemy sprawdzić, czy homing całego szpiku kostnego do nisz w kościach długich zwierząt biorców różni się w przypadku komórek szpiku pobranych od zwierząt WT, takich jak C57BL/6J (WT), oraz od tych, które są transgenicznymi knockoutami receptora lizofosfatydowego 1 (LPAR1) (KO).
2. Przed rozpoczęciem eksperymentu zgromadzimy niezbędne materiały. W naszym laboratorium wszystkie sekcje myszy są przeprowadzane w laminarnym dygestorze do hodowli tkankowej, zwłaszcza gdy komórki mają zostać przeszczepione do zwierzęcia biorcy, a nie wykorzystane do analiz ex-vivo. Zaczynamy od umieszczenia w dygestorze niebieskiej podkładki. Pozostałe niezbędne przedmioty to autoklawowana pęseta i ostre nożyczki, sterylny skalpel jednorazowy oraz waciki nasączone alkoholem. Będziemy potrzebować zmodyfikowanego PBS, sterylnej płytki 6-dołkowej, moździerza z tłuczkiem, probówki stożkowej 50 cm³ z niebieskim zamknięciem oraz jednorazowego filtra 70 µM.
3. Zaczynamy od pobrania jednej myszy WT i jednej myszy KO.
4. Myszy te są uśpione poprzez inhalację CO₂, a następnie zanurzone w 70% izopropanolu na 5 sekund. Ten etap zapobiega zanieczyszczeniu badanych komórek sierścią myszy i w naszej praktyce nie wpłynął negatywnie na wydajność uzyskania komórek ani na wyniki eksperymentu.
5. Następnie myszy są sekcyjnie rozdzielane przy użyciu pęsety i ostrych nożyczek. Zwyczajowo zaczynamy od myszy WT. Wykonuje się niewielkie nacięcie skóry brzusznej myszy nad jamą brzuszną, a następnie rozciąga się skórę dłońmi. Skóra z kończyn tylnych schodzi łatwo. Następnie wyjmuje się kość udową i piszczelową, dbając o to, aby nie wysunąć głowy kości udowej, gdyż zawiera ona dużą ilość szpiku kostnego. Kończyny górne oddziela się od tułowia zwierzęcia, po prostu pociągając za nie, utrzymując tułów w bezruchu. Pozwala to usunąć kończyny górne w całości. Następnie z kończyn górnych wyjmuje się kości ramienne.
6. Usunięte kości umieszcza się w zmodyfikowanym PBS, który wlano do płytek 6-dołkowych. Zmodyfikowany PBS przygotowuje się poprzez dodanie 2 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (Fetal Bovine Serum) oraz 2 cm³ EDTA 0,5 M pH 8. Roztwór ten jest następnie filtrowany przez filtr Nalgene 0,45 µM i może być przechowywany w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc.
7. Niezbędne jest prawidłowe opisanie dołków w płytce, aby móc poprawnie zidentyfikować kości WT i KO.
8. Tuszki myszy są usuwane i utylizowane.
9. W dygestorze kładzie się nową podkładkę, a kości oczyszcza za pomocą jednorazowego skalpela.
10. Oczyszczone kości umieszcza się w moździerzu, przetwarzając po jednej myszy na raz. Do moździerza dodaje się 2 ml zmodyfikowanego PBS i rozdrabnia kości za pomocą tłuczka. Ważne jest, aby najpierw pofragmentować kości, wykonując 10 ruchów tłuczkiem w przód i w tył, a następnie sproszkować je ruchami obrotowymi. Zazwyczaj wykonuję 50 ruchów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, następnie 50 ruchów przeciwnie do wskazówek zegara i tak dalej, aż materiał w moździerzu stanie się biały, a dodany zmodyfikowany PBS pozostanie biały lub przezroczysty.
11. Po każdym zestawie 50 kolistych ruchów rozdrabniających przenosimy ciecz z moździerza przez filtr 70 µM umieszczony na probówce stożkowej 50 ml. Po każdym transferze do filtra nie zapomnij dodać do moździerza 2 ml PBS. Nie należy próbować rozdrabniać suchych kości ani pozostawiać ich bez cieczy przez dłuższy czas, ponieważ doprowadzi to do apoptozy komórek.
12. Gdy materiał w moździerzu stanie się biały, zawartość filtra przenosi się z powrotem do moździerza i ponownie przeprowadza rozdrabnianie. Zapewnia to pełne wykorzystanie komórek z filtra. Zazwyczaj potrzeba jednego lub dwóch zestawów ruchów obrotowych, aby materiał w moździerzu ponownie stał się biały, co oznacza zakończenie izolacji komórek.
13. Roztwór w probówce stożkowej jest teraz wirowany (pamiętaj o oddzieleniu komórek od myszy WT i KO; w związku z tym będziesz mieć dwie różne probówki: jedną z komórkami WT, drugą z komórkami KO). Wirować przy 1200 obr./min przez 10 minut.
14. Odsysamy nadpływ za pomocą oddzielnych pipet aspiracyjnych dla każdej probówki. Do każdego osadu dodajemy 2 cm³ sterylnego buforu lizującego ACK. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
15. Do każdej probówki dodajemy 8 cm³ zmodyfikowanego PBS. Z każdej probówki pobieramy 10 µl i przenosimy do dwóch oddzielnych dołków w płytce 96-dołkowej. Probówki umieszczamy w wirówce i wirujemy przy 1200 obr./min przez 10 minut.
16. Podczas wirowania do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającego badane komórki dodajemy 30 µl barwnika błękitu trypanu i 60 µl zmodyfikowanego PBS.
17. 10 µl tej mieszaniny (po dokładnym wymieszaniu poprzez pipetowanie w górę i w dół) przenosimy do komory licznikowej (hemocytometru) i przeliczamy komórki w czterech zewnętrznych kwadratach.
18. Liczba komórek w każdej próbce na 1 ml to liczba przeliczonych komórek podzielona przez 4 i pomnożona przez 100 000.
19. Po zakończeniu wirowania wyjmujemy probówki z wirówki i resuspendujemy komórki w PBS bez wapnia, magnezu i L-glutaminy do stężenia 20 milionów komórek na ml. Prawdopodobnie otrzymasz objętość około 5 ml dla zwierzęcia WT i 5 ml dla zwierzęcia KO. Od tego momentu w protokole będziemy używać zwykłego PBS, a nie zmodyfikowanego PBS.
20. Do każdej probówki dodajemy barwnik do barwienia komórek DiI, aby uzyskać stężenie końcowe 5 µM. Natychmiast mieszać w wortexie przez 10 sekund. Inkubować w 37°C przez 10 minut, unikając ekspozycji na światło.
21. Uzupełnić probówki PBS i wirować przez 10 minut przy 1200 obr./min.
22. Po wirowaniu odessać nadpływ i resuspender komórki w PBS do stężenia 40 milionów komórek na ml.
23. Nabrać 500 µl do strzykawek 1 cm³ z igłą 27G (5 strzykawek dla myszy WT i 5 strzykawek dla myszy KO). Warto przygotować po 6 strzykawek dla każdej kohorty. Dodatkowa strzykawka może być pomocna, ponieważ iniekcje dożylne do ogona, które wykonamy w następnym kroku, mogą być trudne.
24. Osłonić strzykawki folią, aby zapobiec degradacji DiI.
25. Wstrzyknąć 500 µl mieszaniny komórek do każdego zwierzęcia biorcy (5 dla każdej kohorty).
26. Zwierzęta te muszą zostać napromieniowane dawką 9 Gy na 4–24 godziny przed iniekcją.
27. 48 godzin po iniekcji pobrać szpik kostny z kończyn tylnych każdego zwierzęcia biorcy.
28. Przetworzyć materiał zgodnie z opisem dla dawców. Resuspender komórki z każdego zwierzęcia w 1 cm³ PBS. Wyznaczyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
29. Odczytać wyniki na cytometrze przepływowym LSR II firmy BD lub urządzeniu równoważnym. Wynik można wyrazić jako procent lub bezwzględną liczbę komórek w analizowanym szpiku kostnym, które są dodatnie pod względem DiI.

Dyskusja

Homing jest procesem, w którym komórki szpiku kostnego, w tym komórki macierzyste, komórki progenitorowe oraz komórki zróżnicowane, przedostają się do szpiku kostnego po wstrzyknięciu ich do krwiobiegu lub jamy szpiku kostnego myszy. Z definicji wynika, że badacz może zdecydować się na analizę homingu komórek macierzystych krwiotwórczych, komórek progenitorowych lub komórek zróżnicowanych, zidentyfikowanych za pomocą immunofenotypowania i wyizolowanych poprzez sortowanie komórek. Zazwyczaj naukowcy wstrzykują komórki szp...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline – sól fizjologiczna z buforem fosforanowym)	Mediatech, Inc.	21-031-CV
Sterylna płodowa surowica bydlęca	Valley Biomedical, Inc.	BS3033
0.5M EDTA (pH 8.0)	Boston BioProducts	BM-150
Roztwór błękitu trypanowego	Mediatech, Inc.	25-900-CI
Bufor do lizy ACK	Lonza Inc.	10-548E
Isopropranolol U.S.P.	Denison Pharmaceuticals, Inc
Roztwór do znakowania komórek Vybrant DiD	Invitrogen	V22887
Roztwór do znakowania komórek Vybrant DiI	Invitrogen	V22885