Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie larwy Drosophila

DOI:

10.3791/1107

⸱

4 lutego 2009

 ,  , 
1Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University College of Physicians and Surgeons

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić sekcję larw Drosophila w ramach przygotowań do immunohistochemii i/lub obrazowania połączenia nerwowo-mięśniowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest uznanym systemem modelowym używanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne stosowanie układu ruchu Drosophila wynika z jego dużej dostępności. Można go analizować z rozdzielczością pojedynczej komórki. W każdym półsegmencie znajduje się 30 mięśni, których rozmieszczenie w obwodowej ścianie ciała jest znane. W sumie 35 neuronów ruchowych przyczepia się do tych mięśni we wzorze, który ma wysoką wierność. Za pomocą biologii molekularnej i genetyki można tworzyć transgeniczne zwierzęta lub mutanty. Następnie można badać konsekwencje rozwojowe dla morfologii i funkcji NMJ. Aby uzyskać dostęp do NMJ w celu badania, konieczne jest dokładne wypreparowanie każdej larwy. W tym artykule pokazujemy, jak prawidłowo wypreparować larwy Drosophila w celu zbadania NMJ, usuwając wszystkie narządy wewnętrzne, pozostawiając nienaruszoną ścianę ciała. Ta technika jest odpowiednia do przygotowania larw do obrazowania, immunohistochemii lub elektrofizjologii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanim zaczniesz

  1. Wszystkie kultury powinny być uprawiane w temperaturze 25 ° C.
  2. Bufor rozwarstwiający HL3.1 można przygotować z wyprzedzeniem. Weź 50 ml porcji HL3.1 i trzymaj ją na lodzie.
  3. Przygotuj 15 ml świeżego 3,5% formaldehydu w HL3.1. Trzymaj go na lodzie.

Sekcja larw

  1. Umieść kroplę zimnego HL3.1 na płytce rozwarstwiającej. Dzięki temu zwierzę nie wyschnie i nie ogłuszy zwierzęcia, ułatwiając pracę.
  2. Za pomocą długich kleszczy wybierz wędrującą larwę trzeciego stadium rozwojowego i umieść ją w kropli HL3.1.
  3. Najpierw użyj krótkich kleszczy, aby chwycić maleńką szpilkę. Umieść szpilkę między tylnymi przetchlinkami. Zwierzę zwykle będzie próbowało odczołgać się od szpilki, rozciągając się i ułatwiając umieszczenie szpilki prostopadle w głowie larwy w pobliżu haczyków pyskowych. Rozciągnij zwierzę wzdłuż. Pomoże Ci to zmaksymalizować ilość odsłoniętej ściany ciała, jaką możesz uzyskać podczas cięcia. Uwaga : Jeśli zdecydujesz się najpierw przypiąć głowę, zwierzę może owinąć swoje ciało wokół szpilki lub biczować ciałem w przód iw tył, co utrudni przygwożdżenie. Zwykle można temu przeciwdziałać, usuwając HL3.1 i umieszczając świeżą zimną kroplę, ponownie ogłuszając zwierzę. Oburęczny naukowiec może również po prostu chwycić zwierzę i przytrzymać je w miejscu.
  4. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj poziome nacięcie tuż przed tylną szpilką po grzbietowej stronie larwy. Umieść jedno ostrze nożyczek w nacięciu i wykonaj pionowe cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej w kierunku rostralnego końca larwy. Na mównicy zwierzęcia wykonaj poziome nacięcia po lewej i prawej stronie szpilki. Uwaga: gotowy wynik powinien wyglądać jak I po grzbietowej stronie larwy wzdłuż osi ostroogonowej.
  5. Usuń narządy. Zacznij od nałożenia kilku dodatkowych kropli HL3.1 na larwę. Umożliwi to narządom unoszenie się na zewnątrz ciała, co pozwoli na ich znacznie łatwiejsze usunięcie. Najpierw usuń system tchawicy. Po drugie, użyj kleszczy, aby chwycić resztę narządów i usunąć je.
  6. W kroku 3 wykonałeś lewą klapę i prawą klapę w ścianie korpusu. Przypnij klapki w kolejności zgodnej z ruchem wskazówek zegara, upewniając się, że ściana korpusu jest rozciągnięta zarówno w poziomie, jak i w pionie.

Fiksacja

Napraw każde zwierzę w 3,5% formaldehydzie w HL3.1 przez 25 minut. Umyj zwierzę dwukrotnie w HL3.1 przez 5 minut.

Przechowywanie

Usuń szpilki i przenieś larwy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1X PBS. Jeśli planujesz zobrazować NMJ za pomocą stopionych znaczników fluorescencyjnych, powinieneś zobrazować zwierzęta w ciągu dwóch dni. Wypreparowane larwy można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4°C.

Reprezentatywne wyniki

Istnieje kilka kluczowych elementów prawidłowo wypreparowanej larwy Drosophila. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mięśni, zwłaszcza mięśni 4, 6 i 7. Są to najpopularniejsze mięśnie do badania, a jeśli są uszkodzone, wyrzuć filet, przygotuj i przeprowadź sekcję innego zwierzęcia. Po drugie, należy upewnić się, że zwierzę jest maksymalnie rozciągnięte, aby można było rozróżnić każdy mięsień i NMJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika preparacji pokazana w tym filmie może być wykorzystana do przygotowania larw Drosophila do różnych technik eksperymentalnych. Jeśli obecne są fluorescencyjne znaczniki białkowe, larwy można natychmiast zamontować i zobrazować. W przeciwnym razie można przeprowadzić barwienie immunologiczne w celu oznaczenia określonych przedziałów synaptycznych. Ponadto można łatwo przeprowadzić elektrofizjologię na wypreparowanych larwach w celu oceny funkcjonowania neuroprzekaźnictwa.

NMJ ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy “ Stemi” 2000Carl Zeiss, Inc.495101-9804-000
Źródło światła KL 1500 LCDCarl Zeiss, Inc.000000-1063-181
3mm Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do nauki15000-0
Kleszcze Dumont SSNarzędzia do nauki precyzyjnej11200-33Długie kleszcze
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki o nauce11252-20Krótkie kleszcze
SylGard 182 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning3097358-1004Służy do wykonywania płytek
Formaldehyd Sigma-Aldrich252549-25ML
Szpilki minutien ze stali nierdzewnej -0,1 MM ŚrednicaFine Science Tools26002-10
HL3 Bufor preparacyjny: (w mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalozy, 115 sacharozy i 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Płytka preparacyjna: Delikatnie wymieszaj (aby uniknąć pęcherzyków) 10:1 w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.


Płytka preparacyjna: Wymieszaj delikatnie (aby uniknąć bąbelków) 10:1w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.

Płytka preparacyjna: Wymieszaj delikatnie (aby uniknąć bąbelków) 10:1 w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.
Płytka preparcyjna Sylgard: Wymieszaj delikatnie (aby uniknąć bąbelków) 10:1 w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.
preparacyjnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
  5. Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja larw Drosophiladisekcja z cza nerwowo mi niowegopreparatyka z cza nerwowo mi niowego Drosophilapreparatyka ciany cia a larwyzastosowanie buforu HL 3 1technika usuwania organ wmetoda konserwacji mi nietapy procedury przypinaniaetapy protoko u fiksacjianatomia larwy Drosophila

Powiązane artykuły