Artykuł metodologiczny

Disekcja złącza neuromięśniowego (NMJ) larwy Drosophila

DOI:

10.3791/1107

⸱

4 lutego 2009

 ,  , 
1Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University College of Physicians and Surgeons

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół demonstruje sposób preparowania larw Drosophila do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
TheDrosophilazłącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanieDrosophilaukład ruchowy jest ceniony ze względu na jego wysoką dostępność. Może on być analizowany z rozdzielczością pojedynczych komórek. W każdym hemisegmencie znajduje się 30 mięśni, których rozmieszczenie w obwodowej ścianie ciała jest znane. Łącznie 35 neuronów ruchowych przyczepia się do tych mięśni w sposób wykazujący wysoką wierność. Wykorzystując biologię molekularną i genetykę, można stworzyć zwierzęta transgeniczne lub mutanty. Następnie można badać wpływ rozwoju na morfologię i funkcję NMJ. Aby uzyskać dostęp do NMJ w celu przeprowadzenia badań, konieczne jest staranne przeprowadzenie mikrodysekcji każdej larwy. W niniejszym artykule demonstrujemy, jak prawidłowo przeprowadzić dysekcjęDrosophilalarwy do badań połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) poprzez usunięcie wszystkich organów wewnętrznych przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej ściany ciała. Technika ta jest odpowiednia do przygotowania larw do obrazowania, immunohistochemii lub elektrofizjologii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem

  1. Wszystkie hodowle należy prowadzić w temperaturze 25° C.
  2. Bufor do sekcji HL3.1 można przygotować wcześniej. Odmierzyć 50 ml buforu HL3.1 i przechowywać go w lodzie.
  3. Przygotować 15 ml świeżego 3,5% formaldehydu w buforze HL3.1. Przechowywać w lodzie.

Disekcja larv

  1. Nanieś kroplę zimnego roztworu HL3.1 na płytkę sekcyjną. Zapobiegnie to wysychaniu zwierzęcia i wprowadzi je w stan odrętwienia, co ułatwi pracę.
  2. Używając długiej pęsety, wybierz wędrującą larvę trzeciego stadium i umieść ją w kropli HL3.1.
  3. Najpierw za pomocą krótkiej pęsety chwyć szpilkę entomologiczną. Umieść szpilkę między przysmoczkami tylnymi. Zwierzę zazwyczaj będzie próbowało odpełznąć od szpilki, wyciągając się, co ułatwi precyzyjne wbicie drugiej szpilki w głowę larwy w pobliżu haczyków gębowych. Rozciągnij zwierzę wzdłużnie. Pomoże to zmaksymalizować powierzchnię odsłoniętej ściany ciała podczas nacinania. Uwaga: Jeśli zdecydujesz się najpierw przypiąć głowę, zwierzę może owinąć ciało wokół szpilki lub gwałtownie nim machać, co utrudni unieruchomienie. Można temu przeciwdziałać, usuwając HL3.1 i nakładając nową zimną kroplę, aby ponownie odrętwiać zwierzę. Badacz sprawny obiema rękami może po prostu chwycić zwierzę i utrzymać je w miejscu.
  4. Używając nożyczek sprężynowych, wykonaj nacięcie poziome bezpośrednio przed tylną szpilką na stronie grzbietowej larwy. Wsuń jedno ostrze nożyczek w nacięcie i wykonaj cięcie pionowe wzdłuż linii środkowej grzbietu w stronę końca rostralnego larwy. Na samym rostrum zwierzęcia wykonaj nacięcia poziome po lewej i prawej stronie szpilki. Uwaga: końcowy efekt powinien przypominać literę I na stronie grzbietowej larwy wzdłuż osi rostrokaudalnej.
  5. Usuń organy. Zacznij od naniesienia kilku dodatkowych kropli HL3.1 na larvę. Pozwoli to organom wypłynąć z ciała, co znacznie ułatwi ich usunięcie. Najpierw usuń układ tchawkowy. Następnie za pomocą pęsety chwyć i usuń pozostałe organy.
  6. W kroku 3 wykonano lewą i prawą klapę w ścianie ciała. Przypnij klapy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, dbając o to, aby rozciągnąć ścianę ciała zarówno poziomo, jak i pionowo.

Fiksacja

Utrwal każde zwierzę w 3,5% formaldehydzie w HL3.1 przez 25 minut. Przemyj zwierzę dwukrotnie w HL3.1 przez 5 minut.

Przechowywanie

Usuń piny i przenieś larwy do probówki 1,5 ml zawierającej 1X PBS. Jeśli planujesz obrazowanie NMJ z wykorzystaniem połączonych znaczników fluorescencyjnych, należy wykonać obrazowanie zwierząt w ciągu dwóch dni. Przeprowadzone sekcje larw można przechowywać do jednego tygodnia w temperaturze 4°C.

Reprezentatywne wyniki

Istnieje kilka kluczowych elementów prawidłowo przeprowadzonej sekcji larwy Drosophila. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mięśni, w szczególności mięśni 4, 6 i 7. Są to najczęściej badane mięśnie i w przypadku ich uszkodzenia należy odrzucić preparat typu fillet i przeprowadzić sekcję innego zwierzęcia. Po drugie, należy upewnić się, że zwierzę jest maksymalnie rozciągnięte, tak aby każdy mięsień i NMJ można było wyraźnie rozróżnić.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika sekcji zaprezentowana w tym filmie może być wykorzystana do przygotowania larw Drosophila do różnych technik eksperymentalnych. W przypadku obecności fluorescencyjnych znaczników białkowych, larwy można zamontować i obrazować natychmiast. W przeciwnym razie można przeprowadzić immunobarwienie w celu oznaczenia konkretnych przedziałów synaptycznych. Ponadto na wysekcjonowanych larwach można łatwo przeprowadzić badania elektrofizjologiczne w celu oceny funkcjonowania neurotransmisji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy “ Stemi” 2000Carl Zeiss, Inc.495101-9804-000
Źródło światła KL 1500 LCDCarl Zeiss, Inc.000000-1063-181
3mm Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do nauki15000-0
Kleszcze Dumont SSNarzędzia do nauki precyzyjnej11200-33Długie kleszcze
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki o nauce11252-20Krótkie kleszcze
SylGard 182 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning3097358-1004Służy do wykonywania płytek
Formaldehyd Sigma-Aldrich252549-25ML
Szpilki minutien ze stali nierdzewnej -0,1 MM ŚrednicaFine Science Tools26002-10
HL3 Bufor preparacyjny: (w mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalozy, 115 sacharozy i 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Płytka preparacyjna: Delikatnie wymieszaj (aby uniknąć pęcherzyków) 10:1 w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.


Płytka preparacyjna: Wymieszaj delikatnie (aby uniknąć bąbelków) 10:1w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.

Płytka preparacyjna: Wymieszaj delikatnie (aby uniknąć bąbelków) 10:1 w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.
Płytka preparcyjna Sylgard: Wymieszaj delikatnie (aby uniknąć bąbelków) 10:1 w zlewce. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze 37C.
preparacyjnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
  5. Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja larw Drosophiladisekcja z cza nerwowo mi niowegopreparatyka z cza nerwowo mi niowego Drosophilapreparatyka ciany cia a larwyzastosowanie buforu HL 3 1technika usuwania organ wmetoda konserwacji mi nietapy procedury przypinaniaetapy protoko u fiksacjianatomia larwy Drosophila

Powiązane artykuły