Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
TheDrosophilazłącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest uznanym modelem systemowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanieDrosophilaukład ruchowy ze względu na jego wysoką dostępność. Można go analizować z rozdzielczością pojedynczych komórek. Na każdy hemisegment przypada 30 mięśni, których rozmieszczenie w obrębie obwodowej ściany ciała jest znane. Łącznie 35 neuronów ruchowych przyłącza się do tych mięśni w sposób wykazujący wysoką wierność. Wykorzystując biologię molekularną i genetykę, można tworzyć zwierzęta transgeniczne lub mutanty. Następnie można badać konsekwencje rozwojowe dla morfologii i funkcji NMJ. Aby uzyskać dostęp do NMJ w celu przeprowadzenia badań, konieczne jest staranne wypreparowanie każdej larwy. W niniejszym artykule demonstrujemy, jak prawidłowo przeprowadzić preparacjęDrosophilalarwy do badania NMJ poprzez usunięcie wszystkich organów wewnętrznych przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej ściany ciała. Technika ta jest odpowiednia do przygotowania larw do obrazowania, immunohistochemii lub elektrofizjologii.
Protokół
Przed rozpoczęciem
- Wszystkie kultury należy hodować w temperaturze 25° C.
- Bufor do sekcji HL3.1 można przygotować wcześniej. Odmierzyć 50 ml buforu HL3.1 i przechowywać go w lodzie.
- Przygotować 15 ml świeżego 3,5% Formaldehyde w buforze HL3.1. Przechowywać w lodzie.
Disekcja larwy
- Nanieś kroplę zimnego roztworu HL3.1 na płytkę sekcyjną. Zapobiegnie to wysychaniu zwierzęcia i go ogłuszy, co ułatwi pracę.
- Używając długiej pęsety, wybierz wędrującą larvę trzeciego stopnia i umieść ją w kropli HL3.1.
- Najpierw za pomocą krótkiej pęsety chwyć szpilkę minutien. Umieść szpilkę pomiędzy przetchlikami tylnymi. Zwierzę zazwyczaj będzie próbowało odpełznąć od szpilki, wyciągając się, co ułatwi precyzyjne wbicie kolejnej szpilki w głowę larwy w pobliżu haczyków gębowych. Rozciągnij zwierzę wzdłuż jego osi. Pomoże to zmaksymalizować powierzchnię odsłoniętej ściany ciała podczas nacinania. Uwaga: Jeśli zdecydujesz się najpierw przypiąć głowę, zwierzę może owinąć ciało wokół szpilki lub gwałtownie nim machać, co utrudni przypięcie. Można temu zazwyczaj przeciwdziałać, usuwając HL3.1 i dodając świeżą zimną kroplę, aby ponownie ogłuszyć zwierzę. Naukowiec sprawnie posługujący się obiema rękami może po prostu chwycić zwierzę i unieruchomić je w miejscu.
- Używając nożyczek sprężynowych, wykonaj nacięcie poziome tuż przed tylną szpilką na stronie grzbietowej larwy. Wsuń jedno ostrze nożyczek w nacięcie i wykonaj cięcie pionowe wzdłuż linii środkowej grzbietu w kierunku końca rostralnego larwy. W części rostralnej zwierzęcia wykonaj nacięcia poziome po lewej i prawej stronie szpilki. Uwaga: końcowy efekt powinien przypominać literę I na stronie grzbietowej larwy wzdłuż osi rostrokaudalnej.
- Usuń organy. Zacznij od dodania kilku dodatkowych kropli HL3.1 na larvę. Dzięki temu organy wypłyną z ciała, co pozwoli na znacznie łatwiejsze ich usunięcie. Najpierw usuń układ tchawkowy. Następnie za pomocą pęsety chwyć pozostałe organy i usuń je.
- W kroku 3 utworzyłeś lewą i prawą zakładkę ściany ciała. Przypnij zakładki zgodnie z ruchem wskazówek zegara, dbając o to, aby rozciągnąć ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie.
Fiksacja
Utrwal każde zwierzę w 3,5% formaldehydzie w HL3.1 przez 25 minut. Przemyj zwierzę dwukrotnie w HL3.1 przez 5 minut.
Przechowywanie
Usuń szpilki i przenieś larwy do probówki 1,5 ml zawierającej 1X PBS. Jeśli planujesz obrazowanie NMJ z wykorzystaniem fuzji znaczników fluorescencyjnych, zwierzęta należy poddać obrazowaniu w ciągu dwóch dni. Wypreparowane larwy można przechowywać do jednego tygodnia w temperaturze 4°C.
Reprezentatywne wyniki
Prawidłowo zdyssekowana larwa Drosophila składa się z kilku kluczowych elementów. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mięśni, zwłaszcza mięśni 4, 6 i 7. Są to najczęściej badane mięśnie i w przypadku ich uszkodzenia należy odrzucić przygotowany płatek i zdyssekować inne zwierzę. Po drugie, należy upewnić się, że zwierzę jest maksymalnie rozciągnięte, aby każdy mięsień i NMJ były możliwe do rozróżnienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika sekcji zaprezentowana w tym filmie może być wykorzystana do przygotowania larw Drosophila do różnorodnych technik eksperymentalnych. W przypadku obecności fluorescencyjnych znaczników białkowych, larwy mogą zostać zamontowane i poddane obrazowaniu natychmiast. W przeciwnym razie można przeprowadzić immunobarwienie w celu oznakowania specyficznych przedziałów synaptycznych. Ponadto na wysekcjonowanych larwach można łatwo przeprowadzić badania elektrofizjologiczne, aby ocenić funkcjonowanie neurotransmisj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Źródło światła KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| nożyczki sprężynowe Vannasa 3 mm | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Pinceta Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | Długa pęseta |
| Pinceta Dumont nr 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Krótki pęseta |
| Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego SylGard 182 | Dow Corning | 3097358-1004 | Służy do przygotowywania płytek do sekcji |
| Formaldehyd | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Szpilki entomologiczne ze stali nierdzewnej – średnica 0,1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Bufor do sekcji HL3: (w mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalozy, 115 sacharozy i 5 HEPES, pH 7,3. Płytka do sekcji z Sylgardu: Delikatnie wymieszać (aby uniknąć pęcherzyków powietrza) w zlewce w proporcji 10:1. Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C. | |||
Płytka do sekcji z Sylgardu: W zlewce delikatnie wymieszać składniki w proporcji 10:1 (aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza). Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić Sylgard do utwardzenia na noc w inkubatorze w temperaturze 37°C. | |||
Płytka do sekcji z Sylgardu: W zlewce delikatnie wymieszać (aby uniknąć pęcherzyków powietrza) w stosunku 10:1. Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić Sylgard do utwardzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C. | |||
| Płytka do sekcji Sylgard: Delikatnie zmieszać (aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza) w proporcji 10:1 w zlewce. Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnego rozmiaru). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C. |
Bibliografia
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
