Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunohistochemia NMJ larw Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
TheDrosophilazłącze neuromięśniowe (NMJ) jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanieDrosophilaukład ruchowy jest ceniony ze względu na jego wysoką dostępność. Można go analizować z rozdzielczością pojedynczych komórek. W każdym hemisegmencie znajduje się 30 mięśni, których rozmieszczenie w obwodowej ścianie ciała jest znane. Łącznie 31 neuronów ruchowych łączy się z tymi mięśniami w sposób wykazujący wysoką wierność. Wykorzystując biologię molekularną i genetykę, można tworzyć zwierzęta transgeniczne lub mutanty. Następnie można badać wpływ rozwoju na morfologię i funkcję NMJ. Immunohistochemię można wykorzystać do wyraźnego obrazowania komponentów NMJ. W niniejszym artykule demonstrujemy, jak wykorzystać barwienie przeciwciałami do wizualizacjiDrosophilalarwalne NMJ.
Protokół
Przed rozpoczęciem
- Przygotować następujące roztwory: PBT (0,1% Triton X100 w 1X PBS), PBTB (0,2% BSA w PBT) oraz PBTN (2% NGS w PBTB).
- Przeprowadzić sekcję larw Drosophila. Prosimy zapoznać się z materiałem Drosophila Larval NMJ Dissection (Sekcja NMJ larw Drosophila).
Immunohistochemia
- Przenieś larwy do probówki 1,5 ml zawierającej PBT. Przemyj larwy dwukrotnie w PBT przez 15 minut. Uwaga: aby przemyć próbki, umieść probówkę 1,5 ml na mieszalniku nutacyjnym. Usuń płyn za pomocą pipety i zastąp go świeżym roztworem.
- Usuń PBT. Przemyj dwukrotnie w PBTB przez 30 minut.
- Usuń PBTB. Przemyj dwukrotnie w PBTN przez 15 minut.
- Inkubuj w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBTN w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4º C przez noc.
- Opłucz dwukrotnie PBTB. Uwaga: aby opłukać, dodaj roztwór i szybko go usuń.
- Przemyj dwukrotnie w PBTB przez 15 minut.
- Przemyj w PBTN przez 30 minut.
- Inkubuj w przeciwciałach wtórnych (oraz w koniugacie przeciwciał pierwszorzędowych, jeśli jest używany) rozcieńczonych w PBTN.
- Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
- Opłucz dwukrotnie PBTB.
- Przemyj dwukrotnie PBTB przez 15 minut.
- Przejdź do montowania preparatów.
Montaż
Uwaga: W przypadku natychmiastowego obrazowania próbek należy zastosować montowanie w glicerolu. W przypadku przechowywania próbek przed obrazowaniem (powyżej jednego tygodnia) lub konieczności wielokrotnego obrazowania należy zastosować medium Prolong Gold. Aby go użyć, umieść butelkę z medium Prolong w kąpieli wodnej o temperaturze 65ºC na 2-3 minuty. Pobierz aletkot Prolong Gold i przechowuj ją na bloku grzewczym w temperaturze 45-50º C.
- Przelej barwione preparaty w PBT do szkiełka zegarkowego.
- Nanieś niewielką ilość glicerolu na czyste szkiełko przedmiotowe do obróbki.
- Przenieś zwierzęta na szkiełko do obróbki, wyjmując je z szkiełka zegarkowego za róg za pomocą pęsety. Upewnij się, że są one skierowane kutykulą do dołu.
- Usuń głowę i ogon za pomocą nowej żyletki na szkiełku do obróbki. W tym celu dobrze sprawdza się nóż typu Exacto z ostrzem nr 16.
- Na innym szkiełku (szkiełku do montażu) umieść małą kroplę glicerolu/ProLong i rozprowadź ją czystą pęsetą.
- Przenieś rozsekcjonowane zwierzęta na szkiełko do montażu za ich krawędź, uważając, aby ich nie odwrócić. Staraj się montować je w rzędach w tej samej orientacji. Na jednym szkiełku zamontuj od 6 do 8 zwierząt.
- Nałóż szkiełko nakrywkę, przykładając jej krawędź do glicerolu/ProLong i powoli ją puszczając.
- Zapieczętuj szkiełko lakierem do paznokci. Uwaga [Nie wykonuj zdjęć, dopóki lakier nie wyschnie. Zazwyczaj trwa to dziesięć minut. W przypadku próbek montowanych w ProLong Gold pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej trzy godziny przed zapieczętowaniem lub obrazowaniem].
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Immunohistochemia (IHC) jest kluczowa w badaniu biologii NMJ, ponieważ umożliwia wizualizację złącza nerwowo-mięśniowego. Osiąga się to poprzez zastosowanie przeciwciał rozpoznających błonę neuronalną (np. HRP), presynapsę (np. CSP, SYT) i/lub postsynapsę (np. DLG). Można również barwić cząsteczki sygnałowe, białka strukturalne lub nowe białka będące przedmiotem zainteresowania. Następnie można wprowadzić mutacje w genach lub zmienić ich ekspresję, a IHC pozwala wykryć zaburzenia struktury synaptycznej i/lub sygnalizacji...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Źródło światła KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Pinceta Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinceta Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Mieszadło nutacyjne Adams™ | BD Biosciences | 421105 | |
| Nóż precyzyjny nr 1 | X-Acto | 3201 | |
| Ostrza nr 16 | X-Acto | 216 | |
| Odczynnik antyfadingowy ProLong Gold | Invitrogen | 36930 |
Bibliografia
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
