Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Podsumowanie

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Streszczenie

Mutageneza celowana całych plazmidów jest prostym sposobem tworzenia niewielkich wariantów oryginalnego plazmidu. Dzięki tej metodzie klonowany gen docelowy może zostać zmodyfikowany poprzez substytucję, delecję lub insercję kilku zasad bezpośrednio w plazmidzie. Proces ten polega na amplifikacji całego plazmidu w reakcji termocyklicznej niewykorzystującej standardowej metody PCR. W trakcie reakcji do nowo syntetyzowanego plazmidu wbudowywane są primery mutagenne zawierające pożądaną mutację. W tym samouczku wideo demonstrujemy łatwy i tani sposób wprowadzania substytucji zasad do plazmidu. Protokół ten opiera się na standardowych odczynnikach i jest niezależny od komercyjnych zestawów, które często są bardzo kosztowne. Zastosowanie tego protokołu może zredukować całkowity koszt reakcji do jednej ósmej ceny niektórych zestawów komercyjnych. W niniejszym filmie komentujemy również krytyczne etapy procesu oraz przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące projektowania primerów mutagennych.

Protokół

Zasada metody:

Mutageneza ukierunkowana całych plazmidów wyjaśniona w tym filmie to metoda mutagenezy, która pozwala na modyfikację sklonowanego genu docelowego poprzez substytucję, delecję lub insercję kilku zasad bezpośrednio w plazmidzie. Metoda ta polega na amplifikacji całego plazmidu w reakcji termocyklicznej, która nie opiera się na standardowym PCR. Podczas reakcji primery mutagenne, zawierające pożądaną mutację w formie niedopasowań do oryginalnego plazmidu, zostają wbudowane w nowo syntetyzowany plazmid. Po usunięciu oryginalnego plazmidu z mieszaniny reakcyjnej zmutowany plazmid zostaje przetransformowany do E. coli. Kolejne kroki służą wyłącznie celom przesiewowym, ponieważ wydajność mutacji w tej metodzie nie wynosi 100%. Cała procedura trwa trzy dni, jednak główną część można przeprowadzić w ciągu jednego dnia.

1.0 Dzień pierwszy:

1.1 Reakcja w termocyklerze:

Oryginalny plazmid: Niniejszy protokół mutagenezy kierowanej najlepiej sprawdza się w przypadku plazmidów o rozmiarze do 10kb. Większe plazmidy są nieco trudniejsze do zmutowania tą metodą i mogą wymagać cierpliwości oraz dostosowania warunków termocyklingu i/lub komórek kompetentnych. Ponadto plazmid, z którym się pracuje, musi zostać wyizolowany ze szczepu bakterii dam+. Do reakcji termocyklingu potrzebne będzie od 10 do 60 ng plazmidu przeznaczonego do mutacji.

Startery: Przed przystąpieniem do reakcji termocyklingu należy przygotować startery. Potrzebne jest około 150 ng każdego startera mutagennego. Dopuszczalne jest pobranie 1,5 µl stoku 100 pM rozcieńczonego w stosunku 1:10. Podczas projektowania starterów mutagennych należy wziąć pod uwagę kilka prostych wytycznych:

• Startery powinny być komplementarne względem siebie
• Długość starterów powinna wynosić od 25 do 45 nukleotydów
• Mutacje w formie niedopasowań do oryginalnego plazmidu muszą znajdować się w obu starterach
• Niedopasowania powinny być umieszczone w centralnej części startera, z co najmniej 8 nukleotydami po każdej stronie
• Zawartość GC w starterach powinna wynosić co najmniej 40%
• Końce starterów na 5' oraz 3' powinny kończyć się jednym lub większą liczbą G lub C
• Startery nie muszą być fosforylowane ani oczyszczane metodą FPLC lub PAGE; wystarczy, że będą odsolone
• Do obliczenia Tm nie jest potrzebny żaden wzór, jednak Tm na certyfikacie wysyłkowym powinna być wyższa niż 60°C
• W celach screeningowych praktyczne jest wprowadzenie lub usunięcie miejsca restrykcyjnego wraz z mutacją. Ze względu na degenerację kodu genetycznego istnieje wiele możliwości wprowadzenia miejsca restrykcyjnego wraz z pożądaną mutacją. Strona internetowa New England Biolabs udostępnia narzędzie do znalezienia odpowiedniego miejsca restrykcyjnego. Wystarczy wprowadzić sekwencję startera kodującą pożądaną sekwencję aminokwasów, używając kodu niejednoznaczności dla DNA. Narzędzie do wyszukiwania enzymów wskaże, które miejsca restrykcyjne można wprowadzić równolegle z pożądaną mutacją. Jeśli w ten sposób nie uda się znaleźć żadnego możliwego lub praktycznego miejsca restrykcyjnego, można wprowadzić dowolne nowe miejsce restrykcyjne w miejscu mutacji, nie uwzględniając kodu genetycznego. Następnie można wykorzystać ten plazmid jako matrycę dla serii mutacji, w których miejsce restrykcyjne to zostanie usunięte poprzez wprowadzenie nowych starterów mutagennych. Podejście to może być bardzo wygodne w przypadku planowania serii mutacji w tym samym miejscu plazmidu

Polimeraza DNA: Do tej metody potrzebna jest termostabilna polimeraza DNA wykazująca aktywność egzonukleazy 3’–5’ i tworząca tępe końce. Zawsze stosujemy rekombinowaną polimerazę Pfu z firmy Fermentas. W przypadku problemów z etapami amplifikacji można spróbować użyć polimerazy wyższej jakości, jednak dla większości zastosowań standardowa Pfu będzie wystarczająca. Reakcję należy uzupełnić dNTP, buforem do polimerazy oraz wodą.

1.2 Warunki termocyklowania

Termocykler należy skonfigurować w następujący sposób. Początkową i powtarzającą się fazę denaturacji ustawia się na 30sec w 95°C.

Temperatury hybrydyzacji starterów nie należy obliczać za pomocą skomplikowanych wzorów. Zazwyczaj ustawiamy temperaturę hybrydyzacji na 55°C, a czas hybrydyzacji na jedną minutę. W przypadku starterów o długości od 25 do 30 nukleotydów, których będą Państwo używać najczęściej, metoda ta sprawdza się u nas w 95% przypadków. Jeśli jednak nie przyniesie ona efektu, należy po prostu spróbować zmienić temperaturę hybrydyzacji w zakresie od 50- do 60°C.

Temperatura elongacji zależy od użytej polimerazy. W niniejszej demonstracji zastosowano polimerazę Pfu z firmy Fermentas, która wymaga temperatury elongacji 72°C. Czas elongacji różni się w zależności od wielkości plazmidu. Zawsze przyjmujemy 1 min na kb i dodajemy do tego czasu jedną dodatkową minutę. Na przykład dla plazmidu o wielkości 9kb jako czas elongacji wybieramy 10min.

18 cykli jest wystarczających, aby stworzyć odpowiednią ilość zmutowanego plazmidu do dalszego wykorzystania. Utrzymanie niskiej liczby cykli pozwala również zaoszczędzić czas.

1.3 Kontrola żelowa po reakcji termocyklowania

Pomyślną amplifikację należy sprawdzić, wykonując elektroforezę. Bezpośrednio po zakończeniu cykli nanieś 5 µl reakcji na 1% żel agarozowy TAE. Jeśli amplifikacja przebiegła pomyślnie, powinna być widoczna wyraźna prążek. Jeśli jednak nowo zsyntetyzowane DNA nie jest wyraźnie widoczne na żelu, można spróbować wytrącić całą reakcję i wykorzystać ją do transformacji w następnym kroku. W naszym przypadku rzadko przynosiło to rezultaty, ale warto spróbować. Najlepszym rozwiązaniem w przypadku niepowodzenia reakcji jest dostosowanie temperatury przyłączania.

1.4 Trawienie enzymem DpnI:

Przed transformacją oryginalny plazmid, który służył jako matryca, musi zostać usunięty z reakcji, aby zapobiec silnemu tłu. Odbywa się to poprzez trawienie restrykcyjne za pomocą DpnI. Ta endonukleaza restrykcyjna przecina wyłącznie zmetylowany plazmid. Jej miejsce rozpoznawania i cięcia to sekwencja GATC, przy czym A musi być zmetylowane. Podczas trawienia DpnI przecina tylko oryginalny, niezmutowany plazmid wyizolowany ze szczepu dam+, natomiast nowo zsyntetyzowany zmutowany plazmid, który nie jest zmetylowany, nie ulega działaniu DpnI. Należy po prostu dodać 1-2 µl DpnI do reakcji i inkubować przez co najmniej jedną godzinę w 37°. Przy użyciu Fast digest DpnI czas inkubacji można skrócić do około 15 minut. Jakość enzymu DpnI oraz czas inkubacji tego trawienia restrykcyjnego w znacznym stopniu determinują poziom tła z niezmutowanym plazmidem.

1.5 Transformacja:

Po trawieniu enzymem DpnI plazmid jest gotowy do transformacji do kompetentnych komórek E. coli. Należy dodać 5 µl z reakcji trawienia DpnI do kompetentnych komórek i przeprowadzić transformację zgodnie z zaleceniami stosowanymi w laboratorium. W naszym przypadku stosujemy procedurę szoku termicznego, inkubując mieszaninę bakterii i plazmidu na lodzie przez 30 min, a następnie poddając ją szokowi termicznemu w temperaturze 42°C przez 90 sec. Po dodaniu 200 µl roztworu SOC bakterie inkubuje się w temperaturze 37°C przez 1 h, intensywnie wstrząsając. Po 1 godzinie bakterie wysiewa się na selekcyjne podłoża agarowe.

2.0 Dzień drugi

2.1 Przesiewanie klonów część 1: Wybór klonów

Ponieważ wydajność mutacji nie wynosi 100%, konieczne jest przeprowadzenie przesiewu mutantów. Wykonujemy to za pomocą trawienia restrykcyjnego, podczas którego sprawdzamy obecność lub brak miejsca restrykcyjnego, które dodaliśmy lub usunęliśmy poprzez integrację starterów. W tym celu zazwyczaj wybieramy osiem kolonii i inkubujemy je przez noc w celu przygotowania plazmidów następnego dnia.

3.0 Dzień trzeci

3.1 Przesiewanie klonów część 2: Trawienie restrykcyjne enzymem markerowym

Trzeciego dnia przeprowadza się Mini Prep, a następnie trawienie restrykcyjne przy użyciu enzymu markerowego. Na żelu można wówczas stwierdzić, które z klonów posiadają pożądaną mutację, a które nie.

Metoda przesiewowa z wykorzystaniem trawienia enzymami restrykcyjnymi działa bardzo dobrze. Należy jednak potwierdzić pomyślną mutację za pomocą sekwencjonowania.

Dyskusja

Mutageneza skierowana jest metodą mutagenezy, która zapewnia szybki sposób na wprowadzenie mutacji do genu przenoszonego przez plazmid. Cała reakcja może zostać przeprowadzona w ciągu jednego dnia. W tej metodzie wymagana jest jedynie para komplementarnych starterów zawierających pożądane mutacje oraz polimeraza z aktywnością korekcyjną, taka jak Pfu-Polymerase. Nowo zsyntetyzowany plazmid można oddzielić od plazmidu rodzicielskiego poprzez trawienie mieszaniny poreakcyjnej enzymem restrykcyjnym DpnI. Enzym ten trawi wył...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polimeraza Pfu (rekombinowana lub natywna)	Fermentas	EP0571 lub EP0501
Mieszanina dNTP 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI lub DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
startery	Invitrogen		odsolone