Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mapowanie optyczne powierzchni serca z wykorzystaniem fluorescencyjnych barwników wrażliwych na napięcie stało się istotnym narzędziem do badania pobudzenia elektrycznego w modelach eksperymentalnych o różnej skali, od kultur komórkowych po całe organy[1, 2]Wykorzystując najnowocześniejsze systemy obrazowania optycznego, można niemal natychmiast wizualizować generowanie i propagację potencjałów czynnościowych podczas prawidłowego rytmu serca lub w trakcie inicjacji i utrzymywania arytmii[1]Najnowsze dostępne komercyjnie systemy mogą dostarczać informacji o niezwykle wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej i opierają się na specjalistycznym sprzęcie, opracowanym pierwotnie w celu pokonania ograniczeń narzucanych przez bardziej konwencjonalne metody elektrofizjologiczne[1]Postępy w dziedzinie wysokorozdzielczych i szybkich kamer CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) oraz intensywnie świecących diod LED (light-emitting diodes), a także barwników napięciowo-czułych, optyki i filtrów, sprawiły, że akwizycja sygnałów elektrycznych stała się praktyczna dla biologów komórki układu sercowo-naczyniowego, bardziej przyzwyczajonych do pracy z mikroskopami. Chociaż najnowsza generacja kamer CMOS potrafi rejestrować 10 000 klatek na sekundę w matrycy o rozdzielczości 16 384 pikseli, to w zależności od rodzaju przygotowania próbki, dawno ugruntowane technologie akwizycji fluorescencji, takie jak układy fotodiod, systemy skanowania laserowego i chłodzone kamery CCD (charged-coupled device), nadal wykazują pewne wyraźne zalety w zakresie zakresu dynamicznego, stosunku sygnału do szumu i wydajności kwantowej.[1, 3]W niniejszym badaniu przeprowadzono perfuzję serc szczurów linii Lewisex vivoz krystaloidalnym perfuzatem (roztwór Krebsa-Henseleita) w temperaturze 37°C na zmodyfikowanym aparacie Langendorffa. Po 20-minutowym okresie stabilizacji serca były przerywanie perfundowane 11 mMol/L 2,3-butanodionym monoksymem, aby wyeliminować ruchy związane ze skurczem podczas akwizycji obrazu. Do mapowania optycznego wykorzystano w sercach szybką sondę potencjometryczną di-8-ANEPPS[4](5 μMol/L) i krótko naświetlano preparat światłem wzbudzającym o długości fali 475±15 nm. Podczas typowego 2-sekundowego okresu naświetlania, światło o długości fali >605 nm emitowane przez preparat serca było obrazowane za pomocą szybkiej kamery CMOS podłączonej do makroskopu poziomego. W tej demonstracji serca stymulowano z częstotliwością 300 uderzeń na minutę za pomocą elektrody współosiowej podłączonej do izolowanej jednostki stymulacji elektrycznej. Równocześnie rejestrowano bipolarnie zapisy elektrograficzne, które analizowano wraz z sygnałami napięciowymi przy użyciu dostępnego oprogramowania. W ten sposób potencjały czynnościowe na powierzchni serc szczurzych perfundowanych w aparacie Langendorffa mogą być wizualizowane i rejestrowane wraz z sygnałami elektrograficznymi.
Protokół
Część 1: Przygotowanie roztworów i układu izolowanego perfuzyjnego serca
- W poranek w dniu eksperymentu przygotowuje się 4,0 L roztworu Krebsa-Henseleita zgodnie z wcześniejszym opisem[5, 6].
- 11 mMol/L 2,3-butanodionomonoksymu (BDM) rozpuszcza się w 1,0 L roztworu Krebsa-Henseleita odlanego z perfuzatu przygotowanego w kroku 1.1.
- Dodatkowe 150 mL roztworu Krebsa-Henseleita pobiera się z perfuzatu przygotowanego w kroku 1.1 i miesza z 5 Mol/L di-8-ANEPPS (rozcieńczonym z roztworu zapasowego 10 mMol/L rozpuszczonego w dimetylosulfoksydzie (DMSO)).
- Te 3 roztwory przenosi się do szklanych zbiorników z płaszczem wodnym (Radnoti), gdzie są wstępnie ogrzewane do 41,0° C i napowietrzane za pomocą zanurzonego napowietrzacza (Radnoti) przy użyciu gazu 95% O2; 5% CO2 przefiltrowanego przez membranę 0,2 μm. Roztwory z 3 zbiorników zapasowych są pompowane do ściennego systemu Langendorffa za pomocą pomp perystaltycznych MasterFlex™ L/S i silikonowych przewodów o niskiej absorpcji (Cole-Parmer).
- Przed montażem szklane elementy systemu Langendorffa (Radnoti) są starannie myte odczynnikiem E-TOXA-CLEAN (Sigma-Aldrich) i dokładnie płukane 0,1 M/L HCl, 100% etanolem oraz wodą destylowaną.
- Aparat Langendorffa bez recyrkulacji został skonstruowany tak, aby dostarczać stałe ciśnienie 70 mm Hg z 3 oddzielnych napowietrzonych zbiorników, które są oddzielone od serca grzejnymi cewkami z płaszczem wodnym i pułapkami pęcherzyków powietrza (Radnoti)[7]. 3 niezależne linie perfuzyjne zbiegają się nad sercem w dwóch trójdrożnych kranikach, co pozwala na precyzyjną kontrolę podawania roztworów przygotowanych w krokach od 1.1 do 1.3. Szklane elementy z płaszczem wodnym są połączone szeregowo przewodami MasterFlex PharMed BPT (Cole-Parmer) i ogrzewane do 39° C wodą destylowaną za pomocą dwóch cyrkulatorów E100 (Lauda). Strata ciepła przez silikonowe przewody utwardzane platynowo (Cole-Parmer), które łączą zbiorniki ciśnieniowe z cewkami grzejnymi i pułapkami pęcherzyków, skutkuje dotarciem perfuzatu o temperaturze 37° C do serca.
Część 2: Pobranie serca szczura i przygotowanie perfuzji w układzie Langendorffa
- Aby wywołać głęboką narkozę ogólną u szczurów linii Lewis o masie 200-250 g, do jamy otrzewnowej wstrzykuje się 100 mg/kg Ketaminy i 10 mg/kg Ksylazyny. Do tej mieszaniny dodajemy 500 U/kg Heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi i niedokrwieniu mięśnia sercowego podczas procedury eksplantacji.
- W celu uzyskania łatwego dostępu do serca i głównych naczyń krwionośnych usuwa się przednią ścianę klatki piersiowej. Następnie ostrożnie rozcina się tkanki otaczające i otwiera worek osierdziowy.
- Po zidentyfikowaniu żyły głównej dolnej naczynie to zostaje podwiązane nicią jedwabną 5-0 (Ethicon), a cały blok serce-płuca zostaje wyjęty. Tkankę bezzwłocznie umieszcza się w lodowatym roztworze Krebsa-Henseleita w zlewce 50 mL ustawionej na lodzie.
- Szybko identyfikuje się aortę wstępującą i oddziela ją od tkanek otaczających. Do aorty wprowadza się kanulę (Harvard Apparatus) o odpowiedniej średnicy, dbając o to, by nie przerwać niezbędnej perfuzji tętnic wieńcowych poprzez zbyt głębokie wprowadzenie kanuli do zastawki aorty. Kanulę mocuje się do aorty wstępującej nicią jedwabną 5-0 (Ethicon).
- Następnie serce szczura umieszcza się w aparacie Langendorffa, uważając, aby do kanuli nie dostały się pęcherzyki powietrza. Uruchamia się wsteczną perfuzję naczyń wieńcowych za pomocą ciepłego, natlenionego roztworu Krebsa-Henseleita z zasobnika ciśnieniowego opisanego w kroku 1.6.
- Usuwa się nadmiar tkanek, w tym płuca, a serce poddaje się perfuzji przez 20 minut, aby umożliwić odzyskanie funkcji i stabilizację rytmu. W tym czasie do jamy lewej komory wprowadza się bardzo cienką sondę termoparową (Cole-Parmer) i mocuje ją szwem Prolene 5-0 (Ethicon). Sondę podłącza się do termokontrolera (Digi-Sense), aby zapewnić utrzymanie temperatury serca na poziomie 37° C poprzez regulację ustawień pomp cyrkulacyjnych wody. Minimalizuje się ruch wywołany skapywaniem perfuzatu z wierzchołka serca, umieszczając kawałek gazy w naczyniu na odpływ.
Część 3: Obciążenie serca barwnikiem potencjometrycznym oraz rejestracja sygnałów elektrograficznych i optycznych
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) wprowadza się do serca, przełączając za pomocą kurka na linię perfuzyjną zawierającą roztwór Krebsa-Henseleita z dodatkiem barwnika fluorescencyjnego. Dodatkowo do lewego i/lub prawego przedsionka wprowadza się kaniulę 18G, przez którą powoli podaje się kolejne 50 ml roztworu barwnika do każdej z tych jam, ponieważ nie są one wystarczająco perfundowane barwnikiem wprowadzonym przez tętnice wieńcowe.
- Podczas procedury ładowania 3 odprowadzenia EKG (Harvard Apparatus) są delikatnie umieszczane na powierzchni serca, która nie jest skierowana w stronę optyki używanej do mapowania. Elektroda No 1 jest umiejscowiony na tylnej części wierzchołkowej lewej komory, No 2 na lewym przedsionku, a No 3 jako elektrodę referencyjną w obrębie pierścienia aorty (Rysunek 1). Sygnały elektrograficzne z przedsionków i komór są następnie wzmacniane, digitalizowane i wyświetlane wraz z sygnałami optycznymi przy użyciu oprogramowania (RedShirt Imaging) (Rysunek 2). Do wizualizacji powierzchniowego EKG w czasie rzeczywistym oraz zapewnienia prawidłowego stymulowania wykorzystywany jest również oscyloskop (Tektronix model TDS 1002).
- Ustawienia wzmacniacza EKG (Hugo Sachs Elektronik):
Filtr górnoprzepustowy: 0,1 Hz
Filtr dolnoprzepustowy: 150 Hz - Kamerę CMOS (RedShirt Imaging) oraz makroskop ustawia się za pomocą regulacji w osiach X-Y-Z w taki sposób, aby powierzchnia serca była w ostrości i znajdowała się w centrum ramki akwizycji. Kamera i układ optyczny są zamontowane na stole wibroizolacyjnym (Minus K Technology) w celu zminimalizowania częstotliwości rezonansowych. Jednocześnie na prawym przedsionku umieszcza się współosiową elektrodę stymulującą (Harvard Apparatus), sterowaną za pomocą izolowanej jednostki elektrostymulacji S48 (Grass), a serce jest stymulowane z częstotliwością 300 uderzeń na minutę (Rysunek 1).
- Ustawienia stymulacji elektrycznej (Grass):
Częstotliwość: 5 impulsów na sekundę
Opóźnienie: 0,2 ms
Czas trwania: 2 ms
Napięcie: 6–12 V
Tryb: Powtórzenie
Impuls: pojedynczy - W przypadku rejestracji optycznej, w której należy wyeliminować artefakty ruchowe wynikające z kurczenia się, serce musi zostać rozsprzężone elektromechanicznie. W tym celu ponownie przełączamy linie perfuzyjne na roztwór Krebsa-Henseleita zawierający 11 mMol/L BDM. Pomiędzy poszczególnymi pomiarami serce jest perfundowane czystym roztworem Krebsa-Henseleita, aby pomóc zachować żywotność preparatu.
- Parametry rejestracji są ustawiane za pomocą oprogramowania (RedShirt Imaging) z następującymi ustawieniami akwizycji:
Konfiguracja: 2 000 Hz; macierz 128x128 pikseli
Interwał klatek: 0,5 ms
Wzmocnienie wzmacniacza kamery: 5x
Wzmocnienie w układzie (On-Chip Gain): 8x-12Me-well
Migawka: opóźnienie 500 ms
Liczba klatek: 4000
Czas trwania: 2000 ms - Wszystkie światła w pomieszczeniu oraz w urządzeniach zostają wyłączone lub osłonięte, aby wyeliminować szumy tła podczas rejestracji. Światło LED oświetla serce wyłącznie podczas rejestracji optycznej, aby zredukować fotowyblakanie i toksyczność barwnika. Przesłona źródła światła jest sterowana impulsem 5 V dostarczanym przez panel sterujący za pomocą karty cyfrowo-analogowej (D-to-A) w komputerze (RedShirt Imaging).
Część 4: Analiza informacji o akwizycji przy użyciu oprogramowania RedShirt Imaging Software
- Po akwizycji dane są przetwarzane przy użyciu różnych ustawień filtrów. Zazwyczaj stosujemy ustawienia domyślne, z wyjątkiem regulacji filtra pasmowo-zaporowego/pasmowo-przepustowego, w którym lewa granica jest ustawiona na 44.0, a prawa na 98.0. Następnie zarejestrowane informacje są przetwarzane i generowany jest film (RedShirt Imaging).
- Dane z jednej akwizycji odpowiadają lokalnej aktywacji elektrycznej w 16 384 punktach na powierzchni serca w okresie 2 sekund. Oprogramowanie umożliwia bezpośrednie porównanie tych lokalnych sygnałów ze sobą oraz z zapisami elektrograficznymi przedsionków i komór. Następnie dane są wizualizowane poprzez mapowanie lokalnej aktywacji elektrycznej na kolory i renderowanie tych informacji w formie animacji przedstawiającej spatiotemporealną aktywację elektryczną na powierzchni serca. Aby utworzyć taką animację, używamy oprogramowania, aby:
- przefiltrować dane czasowo i/lub przestrzennie
- wybrać czas rozpoczęcia i zakończenia animacji
- zmapować sygnały optyczne na kolory w oparciu o spoczynkową intensywność światła każdego piksela
- nałożyć wynikowe dane kolorystyczne na obraz serca
- wygenerować animację
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Jeśli preparat perfundowanego serca pozostawał w bezruchu podczas rejestracji, sygnały optyczne wykazują jeden wyraźny szczyt dla każdego piksela zaangażowanego w zmianę intensywności emisji di-8-ANEPPS. Odpowiednie filmy (ryciny 3 i 4) obrazują front fali pobudzenia rozprzestrzeniający się po powierzchni epikardialnej serca, a także równolegle zarejestrowane zapisy elektrograficzne (rycina 2).
Rycina 1. Fotografia preparatu serca perfundowanego metodą Langendorffa, przedstawiająca położenie elektrody stymulującej w prawym przedsionku oraz odprowadzeń EKG, zgodnie z opisem w kroku 3.2.
Rysunek 2. Reprezentatywne sygnały optyczne i zapisy elektrograficzne z perfundowanego serca szczura szczepu Lewis. Panel A przedstawia obraz powierzchni epikardialnej wykorzystanej do obrazowania optycznego. Pozycje pikseli wybranych w celu zademonstrowania zmian emisji fluorescencji w czasie w panelu B są wskazane kolorowymi strzałkami. Sygnały elektrograficzne przedstawiono w panelu C, gdzie czerwona linia oznacza aktywację przedsionków, a jasnoniebieska linia odpowiada sygnałowi komorowemu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, prosimy kliknąć tutaj.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Usunięcie serca z znieczulonych szczurów musi zostać przeprowadzone szybko, aby uniknąć niedokrwienia mięśnia sercowego. W przypadku wystąpienia niedokrwienia lub niewystarczającej perfuzji wieńcowej, w sercu prawdopodobnie rozwiną się arytmie i może dojść do zawału. Ponadto, takie serca będą wykazywać niewystarczającą emisję fluorescencji, co uniemożliwi uzyskanie informatywnych zapisów i przeprowadzenie późniejszych analiz. Przed załadowaniem barwnika, komórki mięśnia sercowego muszą zostać odpowiednio przepłukane rozt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Children's Hospital Boston.
Podziękowania
Niniejsza praca jest finansowana z grantów badawczych Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health, HL068915; HL088206) oraz z wpłat na fundusz Cardiac Conduction Fund w Children's Hospital Boston.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| CardioCMOS-SM128f | Sprzęt | RedShirtImaging, LLC | ||
| Oprogramowanie CardioPlex | Sprzęt | RedShirtImaging, LLC | ||
| Źródło światła LED LUXEON 460-490 nm | Sprzęt | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| Wzmacniacz EKG Typ 689 Hugo Sachs Elektronik | Sprzęt | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Lustro dichroiczne 505 nm | Sprzęt | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Filtr emisyjny długoprzepustowy 605 nm | Sprzęt | SciMedia | ||
| THT boczny | Sprzęt | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Uchwyt z miniprzegubem kulowym | Sprzęt | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Zestaw małych elektrod stymulujących | Sprzęt | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| Platforma izolacyjna od wibracji nablatowa BM-6 | Sprzęt | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Jednobiegunowa elektroda EKG | Sprzęt | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Pompa perystaltyczna SCI 400 | Sprzęt | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Pompa perystaltyczna MasterFlex Easy Load II | Sprzęt | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Przewód Marprene nr 14 | Sprzęt | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| Przewody MasterFlex | Sprzęt | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| Stymulator impulsów prostokątnych S48 | Sprzęt | Technologie traw | Model S48 | |
| JEDNOSTKA IZOLACYJNA TRANSFORMATORA RF SIU5 | Sprzęt | Technologie traw | Model SIU5 | |
| Zbiornik z płaszczem grzewczym o pojemności 5 litrów | Sprzęt | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| Zbiornik z płaszczem wodnym o pojemności 2 litrów | Sprzęt | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| Zbiornik z płaszczem wodnym o pojemności 0,5 litra | Sprzęt | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| Zbiornik z płaszczem wodnym o pojemności 0,25 litra | Sprzęt | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| Wężownica grzewcza 10 ml | Sprzęt | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Pułapka pęcherzykowa z regulacją podatności | Sprzęt | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Kaniula z złączem Luer Disconnect | Sprzęt | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| Kurek trójdrożny, Luer-Lock żeński do Luer-Lock żeńskiego, bez zaślepek portów | Sprzęt | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Termometr termoparowy | Sprzęt | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Elastyczna mikrosonda Ultra Fine z serii IT | Sprzęt | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscyloskop Tektronix TDS 1002 | Sprzęt | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| Monoksym 2,3-butanodionu | Odczynnik | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Klaweketaminy HCl | Odczynnik | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Ksylazyna | Odczynnik | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Odczynnik | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Odczynnik | Invitrogen | D-3167 |
Bibliografia
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
