Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Podsumowanie

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Streszczenie

Obserwacja i charakterystyka dynamicznych procesów komórkowych mogą dostarczyć istotnych informacji o aktywności komórki, których nie można uzyskać z obrazów statycznych. Żywe sondy fluorescencyjne, w szczególności zielone białko fluorescencyjne (GFP), zrewolucjonizowały biologię komórki dzięki możliwości znakowania specyficznych przedziałów wewnątrzkomórkowych oraz struktur komórkowych. Na przykład obrazowanie żywych chimer GFP (i ich wariantów spektralnych) pozwoliło na dynamiczną analizę cytoszkieletu, transportu organelli oraz dynamiki błon w wielu organizmach i typach komórek [1-3]. Choć obrazowanie żywych komórek stało się powszechne, podejście to wciąż niesie ze sobą wiele wyzwań technicznych, szczególnie w przypadku pierwotnych kultur neuronów. Jednym z wyzwań jest ekspresja białek z tagiem GFP w neuronach pomitotycznych; innym jest zdolność do rejestrowania obrazów fluorescencyjnych przy jednoczesnym minimalizowaniu fototoksyczności i fotoblaknięcia oraz utrzymaniu ogólnej żywotności komórek. Przedstawiamy tutaj protokół opisujący metodę transfekcji opartą na lipidach, która skutkuje stosunkowo niską wydajnością transfekcji (~0,5%), jest jednak idealna do obrazowania w pełni spolaryzowanych neuronów. Niska wydajność transfekcji jest niezbędna, aby można było scharakteryzować pojedyncze aksony i dendryty pod kątem ich orientacji względem ciała komórki w celu potwierdzenia kierunkowości transportu, tj. transportu anterogradnego w porównaniu z retrogradowym. Nasze podejście do obrazowania neuronów wykazujących ekspresję GFP opiera się na standardowym szerokopolowym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę CCD, oprogramowanie do akwizycji obrazu oraz podgrzewaną komorę obrazowania. Obrazowaliśmy szeroką gamę organelli lub struktur, np. pęcherzyki o gęstym rdzeniu, mitochondria, stożki wzrostu i aktynę, bez potrzeby stosowania specjalnej optyki lub wymagań dotyczących wzbudzenia poza źródłem światła fluorescencyjnego. Dodatkowo można niemal jednocześnie wizualizować białka znakowane fluorescencyjnie o różnych widmach, np. białka z tagami GFP i dsRed, aby scharakteryzować kotransport lub inne skoordynowane zdarzenia komórkowe. Opisana tutaj metoda obrazowania jest elastyczna w wielu zastosowaniach i może zostać wdrożona w laboratorium przy stosunkowo niskich kosztach, pod warunkiem dostępności mikroskopu.

Protokół

Część 1: Transfekcja neuronów z użyciem Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Konfiguracja sprzętu:

Neurony hipokampa szczura lub myszy hoduje się zgodnie z metodą Kaech i Bankera z 2006 r. [4]. Typowa gęstość komórek stosowana do transfekcji wynosi 250,000 cells/6-cm dish. Wymagane odczynniki i sprzęt obejmują: 50 mM kwasu kynurenowego, standardowy laboratoryjny uchwyt do probówek, chłodziarkę laboratoryjną (zalecana do przechowywania odczynnika Lipofectamine w niskiej temperaturze),
odczynnik Lipofectamine, MEM, probówki do mikrocentryfugi, mikropipety oraz sterylne pęsety.

Procedura:

1. Dla każdej transfekcji należy opisać dwie probówki o pojemności 1,5 mL; jedną na plazmidowe DNA, a drugą na odczynnik do transfekcji. Kolejne inkubacje można prowadzić w temperaturze pokojowej.
   1. W jednej probówce należy połączyć 1,0 μg plazmidowego DNA z 100 μL MEM (bez żadnych suplementów; MEM nie musi być wyrównany pod względem temperatury lub pH).
   2. W drugiej probówce 1,5 mL należy połączyć 6,0 μL Lipofectamine z 100 μL MEM.
      1. W przypadku transfekcji podwójnych nie są wymagane żadne korekty, mimo że stosunek Lipofectamine:DNA zostanie w takich przypadkach zmniejszony dwukrotnie. Stosunek Lipofectamine:DNA nadal mieści się w zaleceniach producenta. W celu uzyskania optymalnej ekspresji najlepiej przetestować ilość 0,5-1,0 μg dla każdego plazmidu.
      2. Aby zachować trwałość odczynnika Lipofectamine, należy wyjmować go z lodówki na jak najkrótszy czas i umieszczać w chłodzaku laboratoryjnym, gdy nie jest używany.
         Całkowity czas przebywania poza lodówką powinien być ograniczony do minimum.
2. Probówki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Roztwór DNA w MEM należy przenieść do probówki z lipidami i delikatnie wymieszać pipetą, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po 25 minutach, przed obróceniem szkiełek podstawkowych, należy dodać 60 μL 50 mM kwasu kynurenowego, aby zminimalizować uszkodzenia ekscytotoksyczne w naczyniu z kulturą neuronów.
   1. Za pomocą sterylnej pęsety należy ostrożnie obrócić szkiełka podstawkowe stroną z nóżkami do góry i ułożyć je tak, aby na siebie nie nachodziły. Należy uważać, aby nie zarysować powierzchni szkiełka pokrytej neuronami ani powierzchni naczynia pokrytej glejem.
5. Z naczynia 6-cm należy pobrać około 0,5 mL pożywki i delikatnie wymieszać w probówce z DNA, a następnie przenieść roztwór DNA z powrotem do naczynia, rozprowadzając go równomiernie po powierzchni pożywki.
6. Nie należy kołysać naczyniem, lecz delikatnie przesuwać go w przód i w tył w jednym kierunku, a następnie zatrzymać i powtórzyć ruch w kierunku prostopadłym, aby równomiernie rozprowadzić kompleksy DNA-Lipofectamine. Inkubować przez 90 minut w inkubatorze do hodowli tkanek (37°C, 5% CO₂).
7. Szkiełka podstawkowe należy obrócić stroną z nóżkami do dołu i ułożyć tak, aby na siebie nie nachodziły. Ekspresję należy kontynuować przez pożądany czas, zazwyczaj od nocy do 48 godzin.

Część 2: Obrazowanie na żywo pęcherzyków gęstego rdzenia znakowanych GFP w hodowanych neuronach hipokampa

Konfiguracja sprzętu:

1. Obrazowanie żywych komórek wymaga mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD; stosujemy odwrócony mikroskop Leica DMI 6000B wyposażony w zmienną lampę fluorescencyjną Leica. Wymagana jest również komora obrazowania z kontrolerem temperatury i grzałką obiektywu. Używamy urządzenia Warner Instruments RC-21BR zmodyfikowanego dla szkiełek podstawowych 18 mm, a także grzałki platformy (kat. #PH2) i kontrolera temperatury (kat. #TC324B). Komora nie posiada otwartych portów, co jest modyfikacją, którą można uwzględnić przy zamawianiu urządzenia. Wysoce zalecane jest stosowanie grzałki obiektywu, aby pomóc w utrzymaniu temperatury szkiełka podstawowego i zminimalizować zmiany ostrości wynikające z wahań temperatury. Obrazy są pozyskiwane za pomocą kamery Hamamatsu Orca-ER przy użyciu oprogramowania Metamorph (Molecular Devices) z włączoną funkcją akwizycji w trybie „streaming”. Uwaga – nie korzystamy z komory klimatycznej obejmującej cały mikroskop. Jest to kosztowne rozwiązanie, które nie jest konieczne w przypadku krótkotrwałego obrazowania opisanego w niniejszym protokole.
2. Pozostały sprzęt i odczynniki obejmują: świeżo przygotowane medium do obrazowania żywych komórek (1X Hanks z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,6% glukozy oraz 10mM HEPES), dodatkowe szklane szkiełka podstawowe 18 mm, pęsetę sterylną, pęsetę niesterylną, chusteczki Kimwipes, smar próżniowy oraz strzykawkę (bez igły lub z zmodyfikowaną igłą o szerokim świetle) do nakładania smaru.

Procedura:

1. Przygotować świeże pożywkę do obrazowania żywych komórek (1X Hanks z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,6% glukozy oraz 10mM HEPES). Zazwyczaj przygotowuje się 50 ml jednorazowo i przechowuje w temperaturze 4^oC, gdy nie jest używana. Zaleca się przygotowanie ilości wystarczającej na nie więcej niż jeden tydzień. Na jedną szalkę z neuronami zużywa się około 5-10 mL.
2. Uruchomić mikroskop, kamerę, lampę fluorescencyjną oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu. Włączyć również zasilanie platformy komory oraz grzałek obiektywów.
3. Przygotować komorę do obrazowania.
   1. Komora Warnera zawiera teflonową wkładkę do montażu szkiełek podstawowych. Dla ułatwienia manipulacji należy oznaczyć jeden bok wkładki napisem „góra” za pomocą niezmywalnego markera.
   2. Nanieść pierścień smaru do rowka otaczającego otwór po stronie komory oznaczonej jako „góra”. Należy unikać nadmiaru smaru, ponieważ dostanie się on do wnętrza komory i zmniejszy obszar obserwacyjny.
   3. Za pomocą pęsety przymocować czyste, nieużywane szkiełko podstawowe o rozmiarze 18 cm do strony „góra” komory; delikatnie docisnąć krawędzie szkiełka, aby stworzyć szczelne połączenie w zagłębieniu rowka komory.
   4. Odwrócić komorę i nanieść analogiczny pierścień smaru do rowka po przeciwległej (dolnej) stronie komory.
   5. Umieścić przygotowaną komorę — stroną dolną do góry — na zakrętce probówki 50-mL, która stanowi idealny uchwyt komory.
   6. Dodać do komory 750 μL pożywki do obrazowania. Jest to ilość nadmiarowa, ale smar powinien zapobiec wylaniu pożywki, a nadmiar pomoże uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza podczas nakładania szkiełka z komórkami.
   7. Przechowywać przygotowaną komorę w inkubatorze do hodowli tkanek do momentu użycia. Należy unikać przedłużonej inkubacji (~ 1 godzina), ponieważ pożywka do obrazowania odparuje, co zmieni jej skład.
4. Przeprowadzić końcowy montaż komory i obrazowanie żywych komórek.
   1. Przenieść przygotowaną komorę oraz szalkę z przetransfekowanymi szkiełkami z inkubatora do dygestorium do hodowli tkanek.
   2. Końcowy montaż komory powinien zostać przeprowadzony szybko, aby zapewnić komórkom ciągłe zanurzenie w pożywce w temperaturze 37°C.
   3. Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie wyjąć jedno szkiełko z szalki z przetransfekowanymi komórkami; dotknąć krawędzi szkiełka chusteczką Kimwipe, aby usunąć pożywkę wzrostową.
   4. Położyć szkiełko stroną z neuronami do dołu na przygotowanej komorze. Najpierw dotknąć jedną krawędzią szkiełka smaru, a następnie docisnąć go wokół krawędzi, aby szkiełko przyległo płasko bez uwięzienia pęcherzyków powietrza. Nadmiar pożywki do obrazowania wypłynie zgodnie z oczekiwaniami.
   5. Zetrzeć nadmiar pożywki do obrazowania, uważając, aby nie przesunąć szkiełek z ich pozycji.
   6. Przenieść komorę na wstępnie podgrzaną platformę grzewczą i zamocować komorę na miejscu.
   7. Przenieść komorę na stolik mikroskopu.
   8. Aby zredukować fotoblaknięcie i fototoksyczność, ustawić lampę na minimalną intensywność niezbędną do zlokalizowania przetransfekowanych komórek.
   9. Znaleźć interesującą komórkę za pomocą olejowego obiektywu o niskim powiększeniu (40X). Wskazane jest trzymanie się zaplanowanego schematu poszukiwań, aby zapewnić maksymalne pokrycie szkiełka i uniknąć redundantnej akwizycji obrazów, np. zaczynając od lewego górnego rogu szkiełka i skanując w górę i w dół, przesuwając się w prawo.
   10. Przełączyć na olejowy obiektyw o wysokim powiększeniu (60-100x) po zlokalizowaniu pożądanego pola widzenia.
   11. Użyć funkcji „stream acquisition” lub analogicznej funkcji oprogramowania do obrazowania, aby zarejestrować wideo dynamiki białek znakowanych fluorescencyjnie.
   12. Wykonać obraz w kontraście fazowym oraz wszelkie inne towarzyszące obrazy (np. rozpuszczalne GFP) do późniejszej analizy i prezentacji.
   13. Zapisać wszystkie obrazy przed dalszą eksploracją szkiełka i nagraniem kolejnego wideo.
   14. Zazwyczaj za sukces uznaje się nagranie 3-5 filmów z jednego szkiełka. Należy pamiętać o fototoksyczności i ogólnym stanie zdrowia komórek, ponieważ w komórkach uszkodzonych transport jest zredukowany. Stan zdrowia komórek można monitorować za pomocą mikroskopii fazowej. Nagrania zazwyczaj trwają około 30 minut na jedno szkiełko.

Część 3: Reprezentatywne wyniki:

Obserwacje z obrazowania żywych komórek zazwyczaj składają się z filmów (znanych również jako „stosy” obrazów), które pokazują ruch znakowanych fluorescencyjnie organelli w polu widzenia (Rycina 1A). Każdemu filmowi często towarzyszą obrazy pomocnicze, które ilustrują orientację pola widzenia względem ciała komórki, poziom ekspresji białka i/lub stan zdrowia komórki. Filmy z transportu mogą zostać poddane analizie ilościowej poprzez przekształcenie ich w kymografy (Rycina 1B). Kymografy to obrazy ilustrujące ruch cząsteczek poprzez zestawienie skanów liniowych, w których każdy punkt czasowy jest reprezentowany przez kolumnę w kymografie. Rycina 2 pokazuje, w jaki sposób dwie cząsteczki poruszające się w przeciwnych kierunkach są reprezentowane na kymografie. Dalsza analiza kymografów może dostarczyć informacji o strumieniu cząsteczek, prędkości, długości przebiegu, odwróceniach kierunku ruchu oraz cząsteczkach stacjonarnych.

Rysunek 1. Reprezentatywne obserwacje z obrazowania żywych komórek. (A) Wybrane klatki z filmu przedstawiającego transport aktywatora plazminogenu tkankowego (TPA) znakowanego mCherry. Wskazano poszczególne cząsteczki poruszające się w kierunku anterogradnym (zielone strzałki) i retrogradnym (czerwone strzałki). (B) Kymografy ilustrujące ruch TPA-mCherry w aksonie. Linie poziome na kymografach reprezentują obiekty stacjonarne, natomiast linie ukośne reprezentują organelle poruszające się od ciała komórki (dodatni nachylenie) lub w stronę ciała komórki (ujemne nachylenie). Długie zielone i czerwone strzałki wskazują przebiegi odpowiadające cząsteczkom w (A). Zmiany w transporcie wywołane przez nocodazol, odczyn depolimeryzujący mikrotubule, zostały również przedstawione na kymografie. Zauważalny jest spadek liczby poruszających się organelli, co przejawia się brakiem linii ukośnych.

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek jest wymagającą, ale potężną techniką bezpośredniej obserwacji transportu organelli w hodowlach neuronów. Trudności mogą pojawić się jeszcze przed samą procedurą, w postaci pogorszonej kondycji neuronów wynikającej z komplikacji związanych z hodowlą. Dlatego przed i po transfekcji należy ocenić stan zdrowia komórek (przykłady w ref. 4), obserwując szkiełka podstawowe w pożywce wzrostowej za pomocą mikroskopu świetlnego do hodowli tkankowych. Proces przenoszenia szkiełek z neuronami do komory ob...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MEM-Eagle z solami Earle'a i L-glutaminą	Odczynnik	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Odczynnik	Invitrogen	11668-027	Odczynnik do transfekcji
10X Hanks z Ca2+ i Mg2+	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Pożywka do obrazowania na żywo
1M HEPES	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Pożywka do obrazowania na żywo