Wypreparowanie woreczków Saccharomyces Cerevisiae

Podsumowanie

Mikromanipulacja komórkami drożdży jest niezbędna do analizy genetycznej mejozy lub do selekcji zygot diploidalnych. Mikromanipulacje te przeprowadza się przy użyciu mikroigły mikroskopu sekcyjnego. Mikroigła służy do przenoszenia komórek i jest sterowana przez mikromanipulator, który może być dostępny w różnych stopniach automatyzacji.

Streszczenie

Drożdże są niezwykle podatnym na badania systemem modelowym, wykorzystywanym do analizy wielu różnych procesów komórkowych. Powszechny szczep laboratoryjnySaccharomyces cerevisiaewystępuje w stanie haploidalnym lub diploidalnym. Możliwość łączenia alleli z dwóch haploidów oraz wprowadzania modyfikacji do genomu wymaga produkcji i sekcji worków. Produkcja worków z komórek haploidalnych rozpoczyna się od krzyżowania dwóch haploidalnych szczepów drożdży o zgodnych typach kopulacyjnych w celu uzyskania szczepu diploidalnego. Można to osiągnąć na kilka sposobów, zarówno na podłożu stałym, jak i w cieczy. Korzystne jest selekcjonowanie diploidów na podłożu, które selektywnie promuje ich wzrost w porównaniu do któregokolwiek ze szczepów haploidalnych. Następnie diploidom pozwala się na sporulację na podłożu ubogim w składniki odżywcze w celu utworzenia worków, czyli skupisk czterech haploidalnych komórek potomnych powstałych w wyniku reprodukcji meiotycznej diploida. Mieszaninę komórek wegetatywnych i worków traktuje się enzymem zymolazą, aby strawić błonę otaczającą askospory w workach. Wykorzystując mikromanipulację z użyciem mikroigły pod mikroskopem sekcyjnym, można pobrać pojedyncze worki, a następnie rozdzielić i przenieść cztery askospory. Zwysekcjonowane worki hoduje się przez kilka dni i testuje pod kątem interesujących markerów lub alleli poprzez metodę replica plating na odpowiednich podłożach selekcyjnych.

Protokół

Konstrukcja szczepów diploidalnych
Protokół otrzymywania diploidów poprzez krzyżowanie

1. Początkowe szczepy należy wysiać na podłożu YPD lub, jeśli jest to konieczne, na podłożu selektywnym w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Dwa szczepy haploidalne powinny być przeciwstawnych typów macierzyńskich (tj. MATa i MATα).
2. Za pomocą sterylnej pętli do szczepienia należy pobrać niewielką część kolonii z jednego z dwóch szczepów haploidalnych. Na nowej płytce YPD należy wykonać jeden prosty posiew w linii przez całą płytkę. Kierunek posiewu należy zaznaczyć strzałką na spodzie płytki.
3. Procedurę tę należy powtórzyć dla drugiego szczepu na tej samej płytce YPD. Tym razem kolonię należy wysiać prostopadle do pierwszej linii, tak aby drugi posiew przecinał pierwszy. Należy zaznaczyć kierunek drugiego posiewu i określić obszar, w którym drugi posiew przecina pierwszy. W tym obszarze powstaną diploidy.
4. Płytkę YPD należy inkubować przez noc w temperaturze 30°C.
5. Z płytki YPD należy wykonać posiewy replikacyjne na podłoża selektywne, które umożliwiają selektywny wzrost nowo powstałych diploid.
6. Należy pobrać pojedynczą kolonię, jeśli to możliwe, lub niewielką część smugi diploidalnej i wysiać na to samo podłoże selektywne w celu uzyskania pojedynczych kolonii.

Sporulacja i trawienie worków
Protokół

1. Wybierz pojedyncze kolonie z powyższej płytki i wykonaj niewielkie (1 cm x 1 cm) pasy na płytkach do sporulacji (SPO), a następnie inkubuj w temperaturze 30°C przez 3-7 dni w celu indukowania sporulacji.
2. Sporulację można sprawdzić, obserwując komórki z każdego pasa pod mikroskopem świetlnym. Umieść komórki na szkiełku przedmiotowym w 5-10 μl wody, przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym i poszukaj obecności woreczników. Jeśli woreczniki nie są łatwo widoczne, przenieś próbki z powrotem do inkubatora.
3. W przypadku stwierdzenia efektywnej sporulacji w jednym z pasów, przygotuj sterylną probówkę stożkową 15 mL zawierającą 100 μL soku do tetrad.
4. Pobierz komórki z tego pasa sporulacyjnego za pomocą sterylnej pętli szczepiącej 3 mm (komórki powinny pokrywać ¼ pętli) i umieść je w soku do tetrad. Delikatnie zakręć pętlą, aby komórki oddzieliły się od niej i wymieszały z roztworem.
5. Pozostaw w soku do tetrad (zawierającym zymolazę) na 4-10 min (w zależności od stężenia i aktywności zymolazy oraz od konkretnego szczepu). Pozwala to na trawienie ściany komórkowej otaczającej ascospory.
6. Zaznacz górną i dolną granicę obszaru inokulacji na płytce YPD.
7. Opcjonalnie. Reakcję można zatrzymać, dodając 1 mL lodowatej sterylnej dH₂O. Pozostaw komórki na 5 min do osadzenia. Odlej 1 mL nadsączu, a następnie lekko wymieszaj ręcznie i przechowuj w lodzie.
8. Pobierz 5 μL strawionych komórek z kroku 5 i delikatnie nanieś krople w linii w obszarze inokulacji na wcześniej zaznaczonej płytce YPD.
9. Używając sterylnej pętli szczepiącej 3 mm, bardzo delikatnie rozmaż krople 1-3 razy w linii, ledwo dotykając agaru.
10. Pozostaw ciecz do wchłonięcia w agar (jeśli pominięto krok 7, to w tym momencie trawienie zewnętrznej ściany komórkowej zostanie ograniczone lub całkowicie zatrzymane). Przejdź do mikroskopu sekcyjnego.

Disekcja worków sukcesyjnych
Protokół

Należy zauważyć, że poniższy protokół został opracowany dla mikromanipulatora Singer MSM System 200. Protokół ten można stosować z niewielkimi modyfikacjami w przypadku korzystania z manualnego mikromanipulatora, takiego jak mikromanipulator Zeiss MR.

1. Ustaw ostrość na obszarze płytki, gdzie połowę pola widzenia zajmują komórki, a druga połowa jest pusta. Powoli przesuń igłę w głąb pola widzenia, tak aby dotknęła pustego obszaru. Zapewni to, że igła nie zawiera komórek z poprzedniego użycia. Kontakt igły z agarem jest widoczny jako ciemne, czarne koło, które powoli staje się ostre.
2. Przejdź do macierzy w pozycji A1 i zrób oznaczenie, ponownie przebijając agar. Pomoże to określić orientację płytki, jeśli zostanie ona zdjęta z mikroskopu przed zakończeniem pracy.
3. Przełącz się w tryb wyszukiwania. Zlokalizuj worek (ascus). Wybieraj preferencyjnie worki znajdujące się w obszarach, gdzie komórki są dobrze rozproszone. Unikaj obszarów z skupiskami komórek. Cztery ascosporu z jednego worka powinny być nadal ze sobą połączone. Dwie ascosporu mogą być nieco większe od dwóch pozostałych. Unikaj wyboru worków, w których jedna ascospora jest luźna i niepołączona z pozostałymi.
4. Pobierz worek za pomocą igły. Powoli zbliż igłę do płytki. Gdy pojawi się cień mikroiigły, wyrównaj go z workiem do pobrania. Ponownie zbliż igłę, aż pojawi się czarny obrys koła (koniec igły). Dotknij tetrady tym kołem, a następnie szybko odsuń igłę. Upewnij się, że wszystkie cztery ascosporu z jednego worka przylgnęły do igły i że na mikroiigle nie zebrały się żadne dodatkowe komórki, które nie są częścią tego worka.
5. Odsuń mikroiigłę daleko od płytki i przejdź do macierzy (dla pierwszego worka przejdź do pozycji A1). Odnotuj każdą pozycję, na którą przeniesiono worek. Umieść worek, dotykając płytki mikroiigłą i odsuwając ją, aż wszystkie cztery ascosporu oddzielą się od mikroiigły. Na tym etapie często przydatne jest delikatne opukiwanie ramienia igły lub platformy trzymającej płytkę YPD.
6. Powtórz kroki 3-5 i umieszczaj worki w kolejnych pozycjach macierzy, aż do pobrania pożądanej liczby worków.
7. Wróć do każdego worka i rozdziel cztery komórki, delikatnie rozsuwając je igłą, opukując platformę lub stosując obie te metody. Pobieraj komórki, zostawiając jedną w nowej pozycji w macierzy, aż każda ascospora z każdego worka zostanie rozdzielona w rzędach po cztery.
8. Umieść płytkę YPD w inkubatorze w temperaturze 30°C na kilka dni, aby zaobserwować wzór wzrostu.
9. Jeśli jest to konieczne, wykonaj posiew replikacyjny rozdzielonych komórek na podłoże selektywne.

Relokacja zygot
Protokół

1. Wysiać dwa szczepy haploidalne o przeciwnych typach macierzystych na odpowiednim podłożu w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
2. Skrzyżować oba szczepy zgodnie z powyższym opisem i pozostawić do wzrostu na 4 do 6 godzin (lub na noc, jeśli jest to konieczne).
3. Sprawdzić obecność zygot pod mikroskopem świetlnym. Zygoty będą wyglądać jak komórki w kształcie hantla, z pączkiem lub bez niego.
4. Pobrać komórki za pomocą pętli szczepiącej o średnicy 3mm (komórki powinny pokrywać ¼ pętli) i delikatnie przenieść do 100μL sterylnej dH₂O.
5. Zaznaczyć górną i dolną krawędź obszaru szczepienia na płytce YPD.
6. Pobrać 5μL i delikatnie nanosić krople w linii w obszarze szczepienia na wcześniej zaznaczonej płytce YPD.
7. Użyć pętli szczepiącej o średnicy 3mm, aby bardzo delikatnie rozprowadzić krople w linii, ledwie dotykając agaru.
8. Pozostawić ciecz do wchłonięcia w agar. Przejść do mikroskopu sekcyjnego.
9. Ustawić ostrość na obszarze płytki, gdzie połowa pola widzenia jest zajęta przez komórki, a druga połowa jest pusta. Powoli ustawić ostrość igły tak, aby dotykała pustego obszaru pola. Zapewni to, że igła nie zawiera komórek z poprzedniego użycia. Kontakt igły z agarem jest widoczny jako ciemny czarny krąg, który powoli staje się ostry.
10. Przejść do macierzy w pozycji A1 i zrobić zaznaczenie, ponownie przebijając agar. Pomoże to określić orientację płytki, jeśli zostanie ona zdjęta z mikroskopu przed zakończeniem pracy.
11. Przełączyć na tryb wyszukiwania. Zlokalizować zygotę.
12. Pobrać zygotę za pomocą igły.
13. Umieścić zygoty pojedynczo na macierzy.
14. Pozostawić zygoty do wzrostu przez kilka dni.
15. Przeprowadzić przesiew (replica plating) zygot na odpowiednie podłoże selekcyjne.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1: Krzyżowanie dwóch haploidalnych szczepów o przeciwstawnych typach zapłodnienia prowadzi do powstania szczepu diploidalnego.

Rysunek 2: (A) Płytka YPD z wynikami krzyżowania szczepu temperaturowrażliwego (z aukstrofią leu2 ) i szczepu typu dzikiego (LEU2). Przetrawione komórki zostały wysiane w obszarze inokulum po lewej stronie, gdzie widoczny jest gęsty wzrost między dwiema czarnymi liniami. Wypreparowane aski rosną w równych odstępach w matrycy po prawej stronie. (B) Płytka z (A) została przeniesiona na płytkę SD z brakiem leucyny (drop-out). Zwróć uwagę na wzrost w stosunku 2:2 dla markera LEU2 , co wskazuje na wypreparowanie zwalidowanego ascospory. (C) Płytka z (A) została przeniesiona na płytkę YPD i inkubowana w 37°C. Zwróć uwagę na wzrost w stosunku 2:2, który dodatkowo potwierdza, że wypreparowano ascosporę.

Dyskusja

Disekcja drożdży jest użytecznym narzędziem do selekcji nowych szczepów z pożądanymi markerami. Przy określaniu teoretycznego wzorca wzrostu czterech ascospor ważne jest przeanalizowanie genotypu komórki wegetatywnej. W przypadku obecności plazmidu należy wiedzieć, czy jest on pojedynczy, czy występuje w niskiej lub wysokiej liczbie kopii, ponieważ wpływa to na to, która z ascospor otrzyma plazmid, a tym samym rzutuje na przewidywania i wnioski dotyczące manipulowanych szczepów.

Niektóre szcze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Singer MSM System 200	Mikroskop	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Odczynnik	BioShop Canada	SOR508
Tris	Odczynnik	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Odczynnik	Seikagaku Corporation	120493
Ekstrakt drożdżowy	Odczynnik	BioShop Canada	YEX401
Pepton	Odczynnik	BioShop Canada	PEP 403
D-glukoza	Odczynnik	BioShop Canada	GLU501
Podstawa azotowa dla drożdży (Yeast nitrogen base)	Odczynnik	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptona	Odczynnik	BioShop Canada	TRP402
Chlorek sodu	Odczynnik	BioShop Canada	SOD002
Octan potasu	Odczynnik	BioShop Canada	POA 301
Agar	Odczynnik	BioShop Canada	AGR003
Siarczan adeniny	Odczynnik	BioShop Canada	ADS201
L-uracyl	Odczynnik	BioShop Canada	URA 241
L-tryptofan	Odczynnik	BioShop Canada	TRP 100
L-histydyna	Odczynnik	BioShop Canada	HIS 200
L-arginina	Odczynnik	Amresco	0877-100G
L-metionina	Odczynnik	BioShop Canada	MET 222
L-tyrozyna	Odczynnik	BioShop Canada	TYR 333
L-izoleucyna	Odczynnik	BioShop Canada	ISO 910
L-walina	Odczynnik	BioShop Canada	VAL 201
L-lizyna	Odczynnik	BioShop Canada	LYS 101
L-fenyloalanina	Odczynnik	BioShop Canada	PHA 302
Kwas L-glutaminowy	Odczynnik	BioShop Canada	GLU 202
L-treonina	Odczynnik	BioShop Canada	THR002
L-leucyna	Odczynnik	BioShop Canada	LEU 222