Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Podsumowanie

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.

Streszczenie

Tetramery głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy II umożliwiają bezpośrednią wizualizację antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta opiera się na wysoce swoistej interakcji między kompleksami MHC obciążonymi peptydem a odpowiadającymi im receptorami limfocytów T. Chociaż powinowactwo pojedynczej cząsteczki MHC/peptyd jest niskie, sieciowanie kompleksów MHC/peptyd za pomocą streptawidyny zwiększa awidność interakcji, co umożliwia ich wykorzystanie jako odczynników do barwienia. Ze względu na stosunkowo niską częstotliwość występowania limfocytów T CD4+ (~1 na 300 000 dla jednej swoistości), w badaniu tym zastosowano etap amplifikacji in vitro w celu zwiększenia progu detekcji. Komórki mononuklearne są oczyszczane z krwi obwodowej metodą warstwową z użyciem Ficollu. Następnie komórki CD4+ są izolowane poprzez selekcję negatywną z wykorzystaniem koktajlu biotynylowanych przeciwciał i kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami antybiotynowymi. Przy użyciu komórek adherentnych z frakcji komórek CD4- jako komórek prezentujących antygen, limfocyty T CD4+ są namnażane w pożywce poprzez dodanie antygenowego peptydu oraz IL-2. Namnożone komórki barwi się odpowiadającym im tetramerem klasy II poprzez inkubację w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie barwi się je za pomocą przeciwciał powierzchniowych, takich jak anty-CD4, anty-CD3 i anty-CD25. Po znakowaniu komórki można poddać bezpośredniej analizie cytometrycznej. Komórki dodatnie pod względem tetrameru zazwyczaj tworzą odrębną populację wśród namnożonych limfocytów T CD4+. Komórki tetramer-dodatnie są zazwyczaj CD25+ i często wykazują wysoką ekspresję CD4. Ponieważ poziom tła w barwieniu tetramerami może być zmienny, dodatnie wyniki barwienia należy zawsze porównywać z barwieniem tych samych komórek nieistotnym tetramerem. Możliwe są liczne modyfikacje tego podstawowego badania. Komórki tetramer-dodatnie mogą być sortowane w celu dalszej analizy fenotypowej, włączenia do testów ELISPOT lub testów proliferacyjnych bądź innych analiz pomocniczych. Kilka grup badawczych zademonstrowało również możliwość jednoczesnego barwienia z użyciem tetramerów oraz przeciwciał antycytokinowych lub anty-FoxP3.

Protokół

1. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)

1. Pobrać próbkę krwi – krew należy zebrać do strzykawek lub probówek do krwi i przeciwzakrzepić heparyną (w stosunku 1:50), aby zapobiec krzepnięciu. Przewidywana wydajność to około 1×10⁶ PBMC na mL krwi – z czego około 40% stanowić będą limfocyty T CD4 dodatnie (CD4+).
2. Rozdzielić krew do stożkowych probówek 50 mL, po 25 mL na probówkę. Jeśli krew uległa rozdzieleniu, przed rozdzieleniem należy ją delikatnie wymieszać w celu równomiernego rozłożenia osocza
3. Dodać PBS, doprowadzając całkowitą objętość do 40 mL, a następnie utworzyć warstwę podkładową, pobierając 11 mL Ficollu, wprowadzając go do probówki z krwią i ostrożnie zdejmując Pipet-Aid z pipety. Ficoll powoli spłynie na dno probówki. Po wyrównaniu poziomów powoli wyjąć pipetę z probówki z krwią i ją wyrzucić.
4. Zakręcić probówki z krwią i umieścić je w kanistrach Aerosolve. Szczelnie zamknąć kanistry i wirować przy 900×g przez 20 minut – bez hamowania. Jest kluczowe, aby na koniec wirowania nie stosować hamowania, ponieważ siła hamowania zakłóci warstwę komórek.
5. Po wirowaniu PBMC powinny utworzyć wyraźną białą warstwę między żółtym osoczem (powyżej) a przezroczystym ficollu (poniżej). Delikatnie zebrać warstwę białych krwinek za pomocą pipety transferowej i przenieść do nowej probówki. Wraz z PBMC może zostać pobrane nieco osocza i Ficollu, należy jednak unikać pobierania warstwy czerwonych krwinek. Zazwyczaj na tym etapie można połączyć zawartość dwóch probówek z krwią w jednej probówce z komórkami, aby zwiększyć wielkość osadu.
6. Dodać PBS, doprowadzając całkowitą objętość do 50 mL, i wirować przy 500×g przez 15 minut – słabe hamowanie w kanistrach Aerosolve.
7. Odssać ciecz za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć osadu
8. Potraktować buforem hemolitycznym, dodając 5-6 mL do każdej probówki i delikatnie mieszając w celu usunięcia grudek. Inkubować nie dłużej niż 5 minut.
9. Dodać PBS, doprowadzając całkowitą objętość do 50 mL, i wirować przy 230×g przez 10 minut – słabe hamowanie. Kanistry Aerosolve nie są już potrzebne przy tych wolniejszych wirowaniach.
10. Przemyć dwukrotnie: odessać ciecz za pomocą pipety Pasteura, napełnić probówkę PBS i wirować przy 230×g przez 10 minut.
11. Przed końcowym etapem przemywania pobrać alikwot resuspendowanych komórek, rozcieńczyć błękitem trypanu i policzyć za pomocą hemocytometru. Liczba komórek określi objętości odczynników użytych w etapie separacji limfocytów T.

2. Separacja limfocytów T CD4+^*

1. Odssać ciecz i dodać bufor roboczy, aby uzyskać całkowitą objętość 40 uL na 10 milionów komórek. Zazwyczaj wymaga to dodania 30 uL buforu do pozostałej objętości osadu.
2. Przenieść tę objętość do stożkowej probówki 15 mL.
3. Dodać koktajl przeciwciał z zestawu do izolacji CD4 – 10 uL na 10 milionów komórek, zakręcić probówkę i pozostawić w lodzie na 10 minut.
4. Wyjąć probówkę z lodu, zdjąć zakrętkę i dodać 30 uL buforu roboczego na 10 milionów komórek.
5. Dodać kulki magnetyczne z zestawu do izolacji CD4 – 20 uL na 10 milionów komórek, zakręcić probówkę i pozostawić w lodzie na 15 minut.
6. Dodać dziesięciokrotność objętości buforu roboczego w celu przemycia i wirować przy 230×g przez 10 minut.
7. Podczas wirowania przygotować magnes oraz polipropylenową probówkę 5 mL w miejscu pracy.
8. Odssać ciecz znad osadu komórkowego, dodać 2 mL buforu roboczego i usunąć grudki za pomocą pipety transferowej.
9. Używając tej samej pipety transferowej, przenieść komórki do probówki 5 mL i inkubować w magnesie przez 15 minut.
10. Ostrożnie przelać frakcję komórek CD4+ do oznakowanej probówki 15 mL, odwracając magnes i opróżniając zawartość aż do ostatniej kropli.
11. Dodać kolejne 2 mL buforu roboczego do probówki 5 mL i wyjąć ją z magnesu.
12. Delikatnie spłukać komórki CD4- ze ścianek probówki i przenieść je do oznakowanej probówki 15 mL.
13. Dodać 2 mL pożywki do limfocytów T do każdej probówki, pobrać alikwoty do zliczenia komórek i wirować przy 230×g przez 10 minut.
14. Rozcieńczyć alikwoty komórek błękitem trypanu i zliczyć je za pomocą hemocytometru. Wyniki zliczenia komórek określą liczbę dołków wykorzystanych w etapie hodowli ekspansyjnej.

* Alternatywnie, zamiast kroków 2.2 – 2.11, można zastosować kolumny i kulek MACS (Miltenyi Biotec), separator komórek AutoMACS (Miltenyi Biotec) lub separator komórek Robosep (Stem Cell Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Hodowla ekspansyjna in vitro

1. Odssać ciecz z osadów komórek CD4+ i CD4-, a następnie, w zależności od liczby komórek, dodać pożywkę hodowlaną (zazwyczaj stężenie 3 milionów komórek CD4+ na mL i 10 milionów komórek CD4- na mL jest odpowiednie do przygotowania hodowli). Hodowla ekspansyjna wymaga 3–5 milionów komórek CD4- na studzienkę i 2–3 milionów komórek CD4+ na studzienkę w całkowitej objętości 1 mL pożywki w 48-studzienkowej płytce hodowlanej. Zazwyczaj populacja ograniczająca stanowią komórki CD4+
2. W razie potrzeby naświetlić komórki CD4- (5000 Rad). Rozdzielić komórki CD4- do odpowiedniej liczby studzienek na płytce 48-studzienkowej, dodając po 300–500 μL do każdej z nich. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 1 godzinę. Adherentne komórki CD4- będą pełnić rolę komórek prezentujących antygen w hodowli ekspansyjnej.
3. Wyjąć płytkę z inkubatora.
4. Przemyć studzienki, dodając 500 uL świeżej pożywki, delikatnie pipetując w górę i w dół 12–20 razy za pomocą pipety transferowej, a następnie usuwając całą ciecz. Płukanie to pozostawi warstwę adherentnych komórek prezentujących antygen.
5. Po zakończeniu płukania dodać tyle pożywki, aby zwilżyć dno każdej studzienki (około 100 uL) – w przeciwnym razie adherentne komórki wyschną.
6. Dodać 2–3 miliony komórek CD4+ do każdej studzienki. W razie potrzeby dodać dodatkową pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość w każdej studzience do 1 mL.
7. Dodać wybrany peptyd do każdej studzienki. Typowe stężenie stymulujące to 10 ug/mL w stężeniu końcowym.
8. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 7 dni.
9. Po 7 dniach dodać 50 uL Hemogen IL-2 (lub odpowiednika, np. rekombinowanego IL-2, 10 IU/mL) do każdej studzienki.
10. W każdym kolejnym dniu monitorować wzrost komórek za pomocą mikroskopu. Studzienki, w których nie osiągnięto jeszcze konfluencji, dokarmiać poprzez usunięcie połowy pożywki, dodanie świeżej pożywki oraz 50 uL IL-2. Studzienki konfluentne rozdzielić poprzez resuspensję komórek, przeniesienie połowy z nich do pustej studzienki oraz dodanie świeżej pożywki i 50 uL IL-2. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora.
11. Komórki w fazie ekspansji będą gotowe do analizy tetramerem po 13–15 dniach hodowli.

4. Wizualizacja limfocytów T za pomocą barwienia tetramerami

1. Należy zakupić lub przygotować tetramery odpowiadające kombinacjom peptyd/MHC, które pasują do stymulowanych komórek T CD4+ (źródła odczynników tetramerycznych opisano w dyskusji). Tetramery powinny znajdować się w roztworze o stężeniu ~0,5 mg/mL.
2. Wyjmij płytkę z inkubatora
3. Ostrożnie odessij połowę pożywki z każdej studni
4. Przenieś alikwot komórek z każdej studni – zazwyczaj 75 μL lub około 50 000 komórek – do polistyrenowej probówki FACS o pojemności 5 mL
5. Dodaj tetramer – zazwyczaj 1 μL na 50 μL całkowitej objętości – i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny. Zaleca się również zabarwienie drugiej alikwoty komórek z każdej studni nietrafionym tetramerem w celu uzyskania kontroli negatywnej.
6. Oznacz komórki przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4 i anty-CD25, dodając 3-10 μL każdego przeciwciała. Można zastosować dodatkowe lub alternatywne markery przeciwciał. Należy jednak unikać przeciwciał znakowanych PE, ponieważ kanał ten musi być zarezerwowany dla tetramerów. W tym samym czasie oznacz kontrole jednobarwne lub izotypowe, wykorzystując dodatkowe komórki.
7. Inkubuj komórki oznakowane przeciwciałami przez 15-30 minut w lodzie lub w temperaturze 4°C.
8. Przemyj każdą probówkę 0,5 do 2 mL buforu płukającego i wiruj przy 230×g przez 10 minut.
9. Ostrożnie odlej ciecz z probówek FACS. Przechowuj wszystkie probówki w zamkniętym pojemniku (najlepiej w lodzie) do czasu przeprowadzenia analizy FACS.

5. Akwizycja i analiza za pomocą cytometrii przepływowej

1. Kalibruj cytometr przepływowy za pomocą kulek referencyjnych.
2. Zweryfikuj ustawienia instrumentu:
   1. Używając niebarwionych komórek kontrolnych lub kontroli izotypowych, dostosuj położenie bramki dla żywych limfocytów (FSC vs. SSC). Usuń autofluorescencję ze wszystkich kanałów poprzez wycentrowanie populacji (poprzez zmianę ustawień wzmocnienia) poniżej pierwszej dekady na każdej osi.
   2. Używając probówek z kontrolami jednobarwnymi, wycentruj zdarzenia w odpowiednich kwadrantach dla każdego pojedynczego koloru (poprzez zmianę ustawień kompensacji).
   3. Dokonaj precyzyjnej regulacji ustawień instrumentu, używając probówki barwionej nieistotnym tetramerem. W szczególności ustawienia dla kanału PE mogą wymagać korekty, ponieważ tetramery często barwią intensywniej niż kontrola przeciwciał. Nieistotny tetramer powinien barwić <0,5% komórek CD4+.
3. Nabywaj dane dla każdej probówki
   1. Zbierz zdarzenia dla każdej probówki z próbką oraz probówki z kontrolą negatywną.
   2. Nabyj i zapisz co najmniej 20 000 zdarzeń do analizy.
4. Analizuj dane
   1. Zaimportuj pliki danych do oprogramowania do analizy FACS (np. oprogramowania CellQuest, WinMDI lub FlowJo). Rozpocznij analizę od probówki barwionej nieistotnym tetramerem.
   2. Wygeneruj wykres FSC vs. SSC i wyznacz bramkę wokół żywych limfocytów (Rysunek 1, górny lewy panel).
   3. Wygeneruj wykres CD4 vs. CD3 (z bramkowaniem ograniczonym tylko do żywych limfocytów) i wyznacz bramki wokół populacji CD3+ oraz CD4+ (Rysunek 1, górny prawy panel).
   4. Wygeneruj wykres CD4 vs. Tetramer (z bramkowaniem ograniczonym tylko do limfocytów CD3+) i ustaw granice kwadrantów tak, aby populacja CD4+Tetramer+ stanowiła mniej niż 0,5% (Rysunek 1, dolny lewy panel).
   5. Wygeneruj wykres CD25 vs. Tetramer (z bramkowaniem ograniczonym tylko do limfocytów CD4+) i ustaw granice kwadrantów tak, aby populacja CD25+Tetramer+ stanowiła mniej niż 0,5% (Rysunek 1, dolny prawy panel).
   6. Przeanalizuj wszystkie probówki z próbkami bez zmiany bramek.

Rycina 1. Reprezentatywne wyniki barwienia tetramerem dla kontroli negatywnej. Panel w lewym górnym rogu przedstawia rozproszenie przednie (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter) oraz bramkę wielkości limfocytów (R1). Panel w prawym górnym rogu jest ograniczony do bramki R1 i przedstawia przeciwciało anty-CD4 względem anty-CD3 oraz bramki CD3+ (R2) i CD4+ (R3). Panel w lewym dolnym rogu jest ograniczony do bramki R2 i przedstawia przeciwciało anty-CD4 względem tetrameru. Panel w prawym dolnym rogu jest ograniczony do bramki R3 i przedstawia przeciwciało anty-CD25 względem tetrameru. Kwadranty dla obu wykresów tetramerów zostały ustawione na 0,5%.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Komórki tetramer-dodatnie powinny stanowić wyraźną populację wśród wyekspandowanych komórek CD4+ (Rycina 2).
2. Komórki tetramer-dodatnie są zazwyczaj CD25+ i często charakteryzują się wysoką ekspresją CD4.
3. W niektórych przypadkach kombinacja MHC/peptyd może powodować barwienie tła (często spowodowane słabą rozpuszczalnością peptydu). Takie barwienie tła można odróżnić od prawdziwego wyniku dodatniego, ponieważ komórki „fałszywie dodatnie” nie tworzą pojedynczej, wyraźnej populacji ani na wykresach CD4 vs. Tetramer, ani na wykresach CD25 vs. Tetramer (Rycina 3).

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki pozytywnego barwienia tetramerem. Układ paneli i strategia bramkowania są identyczne jak na Rysunku 1. Komórki pozytywne pod kątem tetrameru pojawiają się jako wyraźna populacja CD4 high na panelu anty-CD4 względem tetrameru oraz jako wyraźna populacja CD25+ na panelu anty-CD25 względem tetrameru.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki barwienia tetramerem dające „fałszywie dodatnie” rezultaty. Układ paneli oraz strategia bramkowania są identyczne jak na Rysunku 1. Panel przeciw-CD4 względem tetrameru wykazuje niewyraźne, „kopulaste” barwienie. Panel przeciw-CD25 względem tetrameru również wykazuje barwienie „kopulaste”, bez wyraźnej tendencji do bycia CD25+.

Dyskusja

Zrozumienie roli limfocytów T CD4+ w odporności jest fundamentalnie ważne. Jednakże detekcja i izolacja swoistych dla antygenu limfocytów T CD4+ za pomocą tradycyjnych metod może być trudna. W przeciwieństwie do nich, tetramery MHC klasy II umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T CD4+ o pożądanej specyficzności antygenowej. Niniejszy film demonstruje izolację, puryfikację i amplifikację in vitro limfocytów T CD4+ oraz ich późniejszą wizualizację przy użyciu tetramerów. Tetramery klasy II są fluorescencyjnymi k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora z laminarnym przepływem powietrza klasy 2	sprzęt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Lub równoważna
Probówka stożkowa 50 mL	sprzęt	VWR international	47747-182	Lub równoważna
1X PBS (bez Ca/Mg)	odczynnik	Hyclone	SH30028.02	Lub równoważny
Ficoll-paque PLUS	odczynnik	GE Healthcare	17-1440-03	owinięty w folię w celu ochrony przed światłem
Pipet Aid XP	sprzęt	Drummond Scientific	4-000-101	Lub równoważny
Pipeta 10 mL	sprzęt	Corning	CLS4492	Lub równoważna
Kanistry Aerosolve	sprzęt	Beckman Coulter Inc.	359481	z wkładkami 50 mL
Wirówka	sprzęt	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Lub równoważna
Pipety transferowe	sprzęt	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Lub równoważne
Pipety Pasteura	sprzęt	VWR international	14672-200	Lub równoważne
Bufor hemolityczny	odczynnik	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L EDTA dwusodowy
Błękit trypanu	odczynnik	Sigma-Aldrich	T6146	0.2% w PBS
Hemocytometr	sprzęt	VWR international	15170-208
Probówka stożkowa 15 mL	sprzęt	VWR international	05-527-90	Lub równoważna
Bufor do elektroforezy	odczynnik	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+ MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	odczynnik	Miltenyi Biotec	130-091-155	Lub równoważny
Magnes EasySep®	sprzęt	Stem Cell Technologies	18000
Probówka polipropylenowa 5 mL	sprzęt	Falcon BD	352063
RPMI 1640	odczynnik	Invitrogen	22400-089	z 25 mM HEPES
Zbiór ludzkiej surowicy	odczynnik	N/A	N/A	pobrana od zdrowych dawców, inaktywowana ciepłem i filtrowana
Pen Strep	odczynnik	Invitrogen	1570-063	Lub równoważny
Filtr nakrętkowy 500mL 0.22 mikrona	sprzęt	Nalge Nunc international	595-3320	Lub równoważny
Płytka 48-dołkowa	sprzęt	Costar	3548	Lub równoważna
Inkubator 37°C CO2	sprzęt	Sanyo	MCO-18AIC	Lub równoważny
20 mg/mL syntetycznego peptydu	odczynnik	N/A	N/A	Synteza na zamówienie u dowolnego dostawcy peptydów
Probówka FACS 5 mL	sprzęt	Falcon BD	352008	Polistyren
Tetramer klasy II obciążony peptydem (zgodnie z opisem)	odczynnik	N/A	N/A	Przygotowany przez BRI tetramer core
Anti-CD3	odczynnik	BD Biosciences	347344	Lub równoważny
Anti-CD4	odczynnik	eBioscience	17-0049-73	Lub równoważny
Anti-CD25	odczynnik	eBioscience	11-0259-73	Lub równoważny
Cytometr przepływowy Facs Calibur	sprzęt	BD Biosciences	342975	Lub równoważny