$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Izolacja komórek monojądrowych krwi obwodowej (PBMC)
- Pobierz próbkę krwi – krew należy pobrać w strzykawkach lub probówkach i poddać przeciwzakrzepową heparyną (stosunek 1:50), aby zapobiec krzepaniu. Spodziewaj się wydajności około 1×106 PBMC na mL krwi – z czego około 40% to limfocyty T z wynikiem CD4 (CD4+).
- Należy zastosować krew do stożkowych probówek po 50 mL, po 25 ml w probówce. Jeśli krew się rozdzieliła, delikatnie wymieszaj przed alicytatem, aby rozprowadzić osocze
- Dodaj PBS, zwiększając całkowitą objętość do 40 mL i podkład, pobierając 11 ml Ficoll, wkładając do probówki z krwią i ostrożnie wyjmując pipet Aid z pipety. Ficoll powoli odpływa na dno rurki. Gdy poziom się wyrówna, powoli wyjmij pipetę z rurki i wyrzuć ją.
- Zatkaj rurki z krwią i przenieś się do pojemników z aerozolem. Mocno zamknij puszki i wiruj w 900×g przez 20 minut – bez hamulca. Kluczowe jest, aby na końcu tego obrotu nie było hamowania, ponieważ siła hamowania zakłóci warstwę komórek.
- Po obrotowaniu PBMC powinny utworzyć wyraźną białą warstwę pomiędzy żółtą plazmą (powyżej) a przezroczystą powłoką (poniżej). Delikatnie zdejmij warstwę białych krwinek za pomocą pipety transferowej i przenieś do nowej rurki. Część plazmy i Ficolla może być pobierana za pomocą PBMC, ale unikaj pobierania warstwy czerwonych krwinek. Zazwyczaj na tym etapie dwie probówki z krwią można połączyć w jedną rurkę komórkową, aby zwiększyć rozmiar pelletu.
- Dodaj PBS, co zwiększa całkowitą objętość do 50 mL i wiruj przy 500×g przez 15 minut – niskie hamowanie w pojemnikach aerozolowych.
- Wsysaj płyn pipetą Pasteura, uważając, aby nie zakłócić granulki
- Lecz buforem hemolitycznym, dodając 5-6 ml do każdej probówki i delikatnie mieszając, aby usunąć grudki. Inkubuj nie dłużej niż 5 minut.
- Dodaj PBS, co daje łączną objętość 50 mL i wiruj przy 230×g przez 10 minut – niski hamulec. Do tych wolniejszych obrotów nie są już potrzebne aerozolowe kanistry.
- Przemyj dwa razy: Aspiruj płyn pipetą Pasteura, napełnij probówkę PBS i wiruj w 230×g przez 10 minut.
- Przed ostatnim krokiem mycia usuń aliquot ponownie zawiesionych komórek, rozcieńcz go trypanowym niebieskim i polić za pomocą hemocytometru. Ta liczba komórek będzie decydować o objętościach odczynników używanych w etapie separacji limfocytów T.
2. Separacja komórek T CD4+
- Aspiruj ciecz i dodaj bufor pracujący, aby całkowita objętość wzrosła do 40 uL na 10 milionów ogniw. Zazwyczaj wymaga to 30 uL buforu plus resztkowa objętość granulek.
- Przelej tę objętość do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
- Dodaj koktajl przeciwciał z zestawu izolacyjnego CD4 – 10 uL na 10 milionów komórek, kapsułkę i umieść w lodzie na 10 minut
- Wyjmij rurkę z lodu, zdejmij pokrywkę i dodaj 30 uL buforu biegowego na każde 10 milionów komórek
- Dodaj magnetyczne kulki z zestawu izolacyjnego CD4 – 20 uL na 10 milionów ogniw, rurkę z kapslą i umieść na lodzie na 15 minut
- Dodaj dziesięć woluminów buforu do przemycia i wiruj w 230×g przez 10 minut.
- Podczas obracania ustaw magnes i rurkę polipropylenową 5 mL w swoim miejscu pracy
- Aspiruj płyn z pelletu komórkowego, dodaj 2 mL buforu i usuń grudki za pomocą pipety transferowej
- Używając tej samej pipety transferowej, przenieś ogniwa do rurki 5 mL i inkubuj w magnese przez 15 minut
- Ostrożnie przelej frakcję ogniwa CD4+ do oznaczonej rurki o pojemności 15 mL, odwracając magnes i opróżniając wszystkie oprócz ostatniej kropli
- Dodaj kolejne 2 mL bufora do rurki 5 mL i wyjmij z magnesu
- Delikatnie spłukaj komórki CD4 z boków probówki i przelej do oznaczonej probówki o pojemności 15 mL
- Dodaj 2 mL medium z ogniwem T do każdej probówki, usuń aliquoty do liczenia komórek i wiruj w 230×g przez 10 minut.
- Rozcieńcz alikwoty komórek trypanowym niebieskim i licz za pomocą hemocytometru. Te liczby komórek będą decydować o liczbie studni użytych do etapu hodowli ekspansji.
* Alternatywnie, kolumny i kulki MACS (Miltenyi Biotec), separator komórek AutoMACS (Miltenyi Biotec) lub separator komórek Robosep (Stem Cell Technologies) mogą być stosowane zgodnie z instrukcjami producenta zamiast kroków 2.2–2.11.
3. Kultura ekspansji in vitro
- Aspiruj płyn z granulek komórek CD4+ i CD4 i, na podstawie liczby komórek, dodaj pożywkę hodowlową (zazwyczaj 3 miliony komórek CD4+ na mL i 10 milionów komórek CD4- na mL dobrze sprawdzają się przy ustawianiu hodowli). Hodowla ekspansji wymaga 3-5 milionów komórek CD4- na dołek oraz 2-3 milionów komórek CD4+ na dołek w całkowitej objętości 1 mL podłoża hodowlanego na płytce hodowlowej 48 dołków. Zazwyczaj komórki CD4+ są populacją ograniczającą
- Jeśli chcesz, napromieniuj komórki CD4 (5000 Radów). Aliquot CD4- do odpowiedniej liczby dołków na płycie 48-dołkowej dodaj 300-500 μL do każdej. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37°C na 1 godzinę. Przylegające komórki CD4 będą pełnić rolę komórek prezentujących antygen w hodowli ekspansyjnej.
- Wyjmij talerz z inkubatora.
- Myj studnie, dodając 500 uL świeżego medium i delikatnie pipetując 12-20 razy w górę i w dół, używając pipety transferowej, usuwając cały płyn. To płukanie pozostawi warstwę przylegających komórek prezentujących antygen.
- Po zakończeniu płukania dodaj tylko tyle medium, by zwilżyło dno każdego dołka (około 100 uL) – w przeciwnym razie komórki przylegające wyschną
- Dodaj 2-3 miliony komórek CD4+ do każdego dołku. W razie potrzeby dodaj dodatkowe media, aby całkowita objętość w każdym odwiercie wzrosła do 1 mL.
- Dodaj pożądany peptyd do każdego dołka. Typowe stężenie stymulacji to 10 ug/mL końcowa.
- Włóż talerz do inkubatora 37°C na 7 dni.
- Po 7 dniach dodaj 50 uL Hemogen IL-2 (lub równoważnego, np. rekombinowanego IL-2, 10 IU/mL) do każdego dołku.
- Każdego kolejnego dnia monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopu. Studnie, które jeszcze nie są połączone, należy zasilić przez usunięcie połowy medium, dodanie świeżego medium i 50 uL IL-2. Dziel studnie konfluentne poprzez ponowne zawieszenie komórek, przenoszenie połowy komórek do pustej studni, dodanie świeżego medium i 50 uL IL-2. Wróć komórki do inkubatora.
- Rozrastające się komórki będą gotowe do podawania tetrameru po 13-15 dniach hodowli.
4. Wizualizacja limfocytów T za pomocą barwienia tetramerem
- Kup lub złóż tetramery, aby pasowały do kombinacji peptyd/MHC odpowiadające stymulowanym komórkom T CD4+ (patrz dyskusja o źródłach odczynników tetramerowych). Tetramery powinny mieć roztwór o stężeniu ~0,5 mg/ml.
- Wyjmij płytę z inkubatora
- Ostrożnie odbierz połowę podłoża z każdego dołka
- Przenieś aliquot komórek z każdego dołku – zazwyczaj 75 μL lub około 50 000 komórek – do rurki FACS z polistyrenu o pojemności 5 mL
- Dodaj tetramer – zazwyczaj 1 μL na objętość 50 μL – i umieść w inkubatorze 37°C na 1-2 godziny. Zaleca się również barwienie drugiej aliquoty komórek z każdego dołku niedopasowanym tetramerem jako negatywną kontrolę.
- Oznaczaj komórki przeciwciałami anty-CD3, CD4 i CD25, dodając 3-10 μL każdego przeciwciała. Można stosować dodatkowe lub alternatywne markery przeciwciał. Jednak nie używaj przeciwciał oznaczonych PE, ponieważ ten kanał musi być zarezerwowany dla tetramerów. Obecnie należy również oznaczać kontrolki pojedynczego koloru lub izotypu za pomocą dodatkowych komórek.
- Inkubuj komórki oznaczone przeciwciałami przez 15-30 minut na lodzie lub w temperaturze 4°C.
- Przemyj każdą probówkę buforem o stężeniu 0,5 do 2 ml i wiruj w 230×g przez 10 minut.
- Ostrożnie przelewaj płyn z rurek FACS. Wszystkie rurki przechowuj w przykrytym pojemniku (najlepiej na lodzie) do dalszej analizy FACS.
5. Pozyskiwanie i analiza przepływu cytometru
- Skalibruj cytometr przepływowy za pomocą kulek referencyjnych.
- Sprawdź ustawienia instrumentów:
- Używając komórek kontrolnych bez barwienia lub kontroli izotypowej, dostosuj lokalizację żywotnej bramki limfocytowej (FSC vs. SSC). Usuń autofluorescencję ze wszystkich kanałów, wycentrowując populację (zmieniając ustawienia wzmocnienia) poniżej pierwszej dekady na każdej osi.
- Używając pojedynczych lamp sterujących kolorem, centruj zdarzenia w odpowiednich kwadrantach dla każdego koloru (zmieniając ustawienia kompensacji).
- Wykonaj precyzyjną regulację ustawień instrumentów, używając rury barwionej nieistotnym tetramerem. Szczególnie ustawienia kanału PE mogą wymagać regulacji, ponieważ tetramery często barwią się jaśniejsze niż kontrola przeciwciał. Nieistotny tetramer powinien barwić <0,5% komórek CD4+.
- Zbieraj dane dla każdej lampy
- Zbieraj zdarzenia dla każdej probówki i probówki kontroli ujemnej
- Zdobyć i zapisać co najmniej 20 000 zdarzeń do analizy
- Analizuj dane
- Importuj pliki danych do oprogramowania do analizy FACS (np. CellQuest, WinMDI lub FlowJo). Rozpocznij analizę od rurki barwionej nieistotnym tetramerem.
- Narysuj FSC vs. SSC i narysuj bramkę wokół żywych limfocytów (rysunek 1, panel w lewym górnym rogu).
- Rysuj CD4 vs. CD3 (z bramką, aby pokazać tylko żywe limfocyty) i rysuj bramki wokół populacji CD3+ i CD4+ (Rysunek 1, panel w prawym górnym rogu).
- Narysuj CD4 vs. Tetramer (zamknięty, aby pokazać tylko limfocyty CD3+) i ustaw granice kwadrantów tak, aby populacja CD4+Tetramer+ była mniejsza niż 0,5% (Rysunek 1, panel w lewym dolnym rogu).
- Narysuj CD25 vs. Tetramer (zamknięty, aby pokazać tylko limfocyty CD4+) i ustaw granice kwadrantów tak, aby populacja CD25+Tetramer+ była mniejsza niż 0,5% (Rysunek 1, dolny prawy panel).
- Przeanalizuj wszystkie probówki bez zmiany bramek.
Rysunek 1. Wyniki negatywnej kontroli tetrameru są reprezentatywne. Lewy górny panel pokazuje rozpraszanie w kierunku przednim względem bocznego oraz bramkę wielkości limfocytów (R1). Prawy górny panel jest zamknięty dla R1 i pokazuje ant-CD4 kontra anty-CD3 oraz bramki CD3+ (R2) i CD4+ (R3). Dolny lewy panel jest zasłonięty dla R2 i pokazuje anty-CD4 w porównaniu do tetrameru. Dolny prawy panel jest osłonięty dla R3 i pokazuje anty-CD25 w porównaniu z tetramerem. Kwadranty dla obu wykresów tetramerowych zostały ustawione na 0,5%.
6. Wyniki reprezentatywne
- Komórki tetramery powinny stanowić odrębną populację spośród rozszerzonych komórek CD4+ (Rysunek 2).
- Komórki tetramery mają zwykle poziom CD25+ i często CD4.
- W niektórych przypadkach kombinacja MHC/peptyd może powodować barwienie tła (często spowodowane przez peptyd o słabej rozpuszczalności). Takie barwienia tła można odróżnić od prawdziwie pozytywnego, ponieważ komórki "fałszywie pozytywne" nie stanowią jednej odrębnej populacji ani na wykresach CD4 vs. Tetramer, ani CD25 vs. Tetramer (Rysunek 3).
Rysunek 2. Reprezentatywne pozytywne wyniki barwienia tetramerowego. Układ paneli i strategia bram są identyczne jak na Rysunku 1. Komórki pozytywne z tetramerami występują jako odrębna populacja o wysokiej liczbie CD4 w panelu anty-CD4 kontra tetramery oraz odrębna populacja CD25+ w panelu anty-CD25 kontra tetramer.
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki barwienia tetramerem w postaci "fałszywie pozytywnego". Układ paneli i strategia bram są identyczne jak na Rysunku 1. Panel anty-CD4 kontra tetramer wykazuje niewyraźne "nagromadzone" barwienie. Anty-CD25 w porównaniu z tetramerem również wykazuje "wzgórkowe" przebarwienia, bez wyraźnego trendu w kierunku CD25+.