Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 2 z 3.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
RodzinaPoxviridaeskłada się z wirusów zawierających duże dwuniciowe DNA, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Członkowie grupyorthopoxrodzaj obejmuje variola, czynnik etiologiczny ospy prawdziwej u ludzi, monkeypox oraz vaccinia (VAC), prototypowego przedstawiciela rodziny wirusów. W obrębie stosunkowo dużego (~ 200 kb) genomu vaccinia kodowane są trzy klasy genów: wczesne, pośrednie i późne. Choć wszystkie trzy klasy są transkrybowane przez wirusowe polimerazy RNA, każda z nich pełni inną funkcję w cyklu życiowym wirusa. Poxviruses wykorzystują wiele strategii modulacji środowiska komórkowego gospodarza podczas infekcji. Aby zrozumieć regulację ekspresji genów zarówno gospodarza, jak i wirusa, zastosowaliśmy podejścia genomowe do analizy liczebności transkryptów z komórek wirusowych i gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy przebieg infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz pobieranie RNA w kilku punktach czasowych po infekcji. Całkowite RNA gospodarza i wirusa jest izolowane i amplifikowane w celu hybrydyzacji z mikromacierzą do analizy ekspresji genów.
Protokół
Część 1: Synteza cDNA z RNA
- Przed użyciem zestawu Ambion Amino Allyl MessageAmp II należy dodać zalecaną objętość 100% etanolu do buforów do płukania.
- Do probówki do reakcji PCR należy dodać od 100ng do 5µg całkowitego RNA oraz 1µl primera T7 oligo (dT). Objętość należy uzupełnić do 12µl wodą wolną od nukleaz.
- Próbki należy inkubować w temperaturze 70°C przez 10 min w termocyklerze.
- Próbki RNA należy wyjąć z temperatury 70°C i krótko odwirować. Następnie umieścić na lodzie.
- Należy przygotować master mix do syntezy 1szej nici i przechowywać go w temperaturze pokojowej (z 10% nadwyżką na błędy pipetowania). (Tabela 1)
- Master Mix należy delikatnie wymieszać za pomocą pipety lub poprzez lekkie potrząśnięcie probówką, a następnie krótko odwirować.
- Do każdej próbki RNA należy przenieść 8µl Master Mixu. Wymieszać poprzez 3-4 krotne pipetowanie w górę i w dół.
- Inkubować w temperaturze 42°C przez 2 godziny w termocyklerze.
- Próbki należy krótko odwirować i umieścić na lodzie. Natychmiast przejść do następnego etapu syntezy dsDNA.
- Master mix do syntezy 2giej nici należy przygotować na lodzie (z 10% nadwyżką na błędy pipetowania). (Tabela 2)
- Master Mix należy delikatnie wymieszać za pomocą pipety lub poprzez lekkie potrząśnięcie probówką, a następnie krótko odwirować.
- Do każdej próbki należy przenieść 80µl i delikatnie wymieszać poprzez 3-4 krotne pipetowanie w górę i w dół.
- Inkubować w temperaturze 16°C przez 2 godziny w termocyklerze.
- Po 2-godzinnej inkubacji należy przejść do etapu oczyszczania cDNA lub natychmiast zamrozić próbki w temperaturze –20°C.
Część 2: Oczyszczanie dwuniciowego cDNA
- Wyjmij cDNA Pure z lodówki i pozostaw do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej na 30 minut przed użyciem. Przed użyciem wstrząśnij butelką, aby całkowicie resuspendować magnetyczne kulek wiążące cDNA.
- Odmień wodę wolną od nukleaz do probówki 1,5 mL i inkubuj w temperaturze 50-60°C przez co najmniej 10 minut w trakcie poprzedniej 2-godzinnej inkubacji.
- Dodaj 180µl cDNA Pure do każdej próbki i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Przenieś próbki do 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie.
- Kontynuuj mieszanie próbek, delikatnie wstrząsając płytką na wytrząsace orbitalnym przez co najmniej 2 minuty.
- Przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby wychwycić kuleczki magnetyczne. Pozostaw płytkę na statywie przez około 6 minut lub do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kuleczki wiążące utworzą osad.
- Ostrożnie odessij nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usuń nadsącz pipetą i go wylej.
- Zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego.
- Dodaj 150µl buforu do przemywania cDNA (cDNA Wash Buffer) do każdego dołka i wstrząśnij płytką przez 1 minutę na wytrząsace orbitalnym z umiarkowaną prędkością. Na tym etapie kuleczki NIE ulegną dyspersji ze względu na niskie napięcie powierzchniowe buforu do przemywania.
- Przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby wychwycić kuleczki magnetyczne.
- Ostrożnie odessij nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usuń nadsącz pipetą i go wylej.
- Zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego.
- Powtórz przemywanie po raz 2nd za pomocą 150µl buforu do przemywania cDNA.
- Po 2nd przemywaniu osusz kuleczki, wstrząsając płytką przez 2 minuty na wytrząsace orbitalnym z maksymalną prędkością. Nie przesuszyć!
- Eluuj cDNA z kuleczek, dodając 18µl podgrzanej wcześniej wody wolnej od nukleaz do każdej próbki.
- Intensywnie wstrząsaj płytką przez 3 minuty na wytrząsace orbitalnym, a następnie sprawdź, czy kuleczki magnetyczne są całkowicie zdyspergowane. Jeśli nie, kontynuuj wstrząsanie.
- Gdy kuleczki magnetyczne zostaną całkowicie zdyspergowane, przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby je wychwycić.
- Ostrożnie przenieś eluowane cDNA (~16µl) do nowej płytki PCR (lub probówek PCR).
- Przejdź bezpośrednio do następnego kroku lub zamroź cDNA w temperaturze -20°C.
Część 3: Transkrypcja in vitro (IVT)
- Przygotować mieszaninę główną (master mix) do IVT w temperaturze pokojowej. (Tabela 3)
- Delikatnie wymieszać mieszaninę główną za pomocą pipety lub poprzez lekkie potrząsanie probówką, a następnie krótko odwirować.
- Dodać 24µl mieszaniny do każdej próbki i delikatnie wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół 3-4 razy.
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 14 godzin w termocyklerze, a następnie przechowywać w 4°C do momentu przejścia do następnego etapu.
Część 4: Oczyszczanie aRNA po IVT
- Krótko wymieszać kuleczki do wiązania RNA w wstrząsarku vortex, aby uzyskać jednorodną zawiesinę przed użyciem.
- Przygotować mieszaninę wiążącą aRNA (aRNA Binding Mix) w temperaturze pokojowej. (Tabela 4) Można to zrobić z wyprzedzeniem – przygotowana mieszanina wiążąca może być przechowywana w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia.
- Dokładnie wymieszać za pomocą vortexa.
- Odnieść aRNA Elution Buffer do probówki 1,5 mL i inkubować w temperaturze 50-60°C przez co najmniej 10 minut.
- Dodać 70µl mieszaniny wiążącej aRNA do każdej próbki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Przenieść próbki z płytki PCR do płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym.
- Dodać 50µl 100% izopropanolu do każdej próbki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Delikatnie wstrząsać płytką na wstrząsarce orbitalnej przez co najmniej 2 minuty, aby dokładnie wymieszać próbki.
- Przenieść płytkę na statyw magnetyczny w celu wychwycenia kuleczek magnetycznych. Pozostawić płytkę na statywie do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kuleczki wiążące ulegną zbiciu w pellet.
- Ostrożnie odessać nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i go odrzucić.
- Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego.
- Dodać 100µl aRNA Wash Solution do każdego dołka i wstrząsać płytką przez 1 minutę na wstrząsarce orbitalnej z umiarkowaną prędkością. Na tym etapie kuleczki mogą nie rozprzestrzenić się całkowicie.
- Przenieść płytkę na statyw magnetyczny w celu wychwycenia kuleczek magnetycznych.
- Ostrożnie odessać nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i go odrzucić.
- Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego.
- Powtórzyć płukanie po raz 2nd przy użyciu 100µl aRNA Wash Solution.
- Po 2nd płukaniu osuszyć kuleczki, wstrząsając płytką przez 1 minutę na wstrząsarce orbitalnej z maksymalną prędkością. Nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia próbek!
- Eluować aRNA z kuleczek, dodając 40µl podgrzanego aRNA Elution Buffer do każdej próbki.
- Intensywnie wstrząsać płytką na wstrząsarce orbitalnej przez 3 minuty, a następnie sprawdzić, czy kuleczki magnetyczne są całkowicie rozproszone. Jeśli nie, kontynuować wstrząsanie.
- Po całkowitym rozproszeniu kuleczek magnetycznych przenieść płytkę na statyw magnetyczny w celu ich wychwycenia. Nadsącz zawiera oczyszczone aRNA z wbudowanym aminoallylem.
- Ostrożnie przenieść eluowane aRNA do nowej płytki PCR (lub probówek PCR).
- (Krok opcjonalny) Sprawdzić stężenie RNA w próbkach, mierząc 1,5µl na spektrofotometrze NanoDrop.
- Bezzwłocznie przejść do następnego kroku lub przechowywać aRNA w temperaturze –80°C.
Tabela 1: cDNA 1st Mieszanina Master Mix do syntezy nici
| Odczynnik | Ilość na 1 reakcję |
| 10X bufor do syntezy pierwszej nici | 2 µl |
| Mieszanina dNTP | 4 µl |
| Inhibitor rybonukleazy | 1 µl |
| Array Script | 1 µl |
Tabela 2: cDNA 2nd Mieszanina Master Mix do syntezy nici
| Odczynnik | Ilość na 1 reakcję |
| Woda wolna od nukleaz | 63 µl |
| 10X bufor do syntezy drugiej nici | 10 µl |
| Mieszanina dNTP | 4 µl |
| Polimeraza DNA | 2 µl |
| RNaza H | 1 µl |
Tabela 3: Mieszanina główna IVT
| Odczynnik | Ilość na 1 reakcję |
| roztwór aaUTP (75 mM) | 2 µl |
| mieszanina ATP, CTP, GTP (25 mM) | 12 µl |
| roztwór T7 UTP (75 mM) | 2 µl |
| 10X bufor reakcyjny T7 | 4 µl |
| mieszanina enzymów T7 | 4 µl |
Tabela 4: Mieszanina wiążąca aRNA
| Odczynnik | Ilość na 1 reakcję |
| Kulek wiążących RNA* | 10 µl |
| Roztwór do resuspensji kulek* | 4 µl |
| 100% izopropanol** | 6 µl |
| Koncentrat buforu wiążącego aRNA | 50 µl |
* Najpierw wymieszaj kulki do wiązania RNA z roztworem do resuspensji kulek.
** Dodaj izopropanol i dokładnie wymieszaj przed dodaniem koncentratu buforu do wiązania aRNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe etapy
Nie zaleca się drugiej rundy amplifikacji, ponieważ zaobserwowano błędy w danych z macierzy. Staranne mieszanie na każdym etapie enzymatycznym (synteza 1st i 2nd nici cDNA, IVT) jest krytyczne dla uzyskania dobrych wydajności amplifikacji, podobnie jak inkubacja każdego etapu enzymatycznego w odpowiedniej temperaturze. Preferowany jest termocykler PCR z regulowaną podgrzewaną pokrywą – nawet niewielkie odchylenia rzędu 2-3 stopni podczas IVT w piecu do hybry...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Fundusze dla stypendystów Whitehead Institute
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Zestaw do amplifikacji aRNA Amino Allyl MessageAmp II | Odczynnik | Applied Biosystems | AM1753 | Na 20 reakcji |
| Zestaw do amplifikacji aRNA Amino Allyl MessageAmp II | Odczynnik | Applied Biosystems | AM1821 | Na 100 reakcji, w formacie 96-dołkowym |
| Spektrofotometr UV-VIS NanoDrop ND-1000 | Inne | NanoDrop | ND-1000 | Lub równoważny spektrofotometr |
Bibliografia
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
