Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 3 opisuje proces znakowania fluorescencyjnego namnożonego RNA z próbek gospodarza i wirusa poprzez sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallilowych. Część 3 z 3.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusowych: Część 3
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
RodzinaPoxviridaeskłada się z wirusów zawierających duże dwuniciowe DNA, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Przedstawiciele tejorthopoxrodzaj obejmuje variolę, czynnik etiologiczny ospy prawdziwej u ludzi, ospę małpią oraz vaccinię (VAC), która jest prototypowym przedstawicielem rodziny wirusów. W stosunkowo dużym genomie vaccinii (~ 200 kb) zakodowane są trzy klasy genów: wczesne, pośrednie i późne. Choć wszystkie trzy klasy są transkrybowane przez wirusowe polimerazy RNA, każda z nich pełni inną funkcję w cyklu życiowym wirusa. Poxwirusy wykorzystują wiele strategii w celu modulacji środowiska komórkowego gospodarza podczas infekcji. Aby zrozumieć regulację ekspresji genów zarówno gospodarza, jak i wirusa, zastosowaliśmy podejścia genomowe do analizy obfitości transkrypcyjnej z komórek wirusa i gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy przebieg infekcji komórek HeLa wirusem vaccinii oraz pobieranie RNA w kilku punktach czasowych po infekcji. Całkowite RNA gospodarza i wirusa jest izolowane i amplifikowane w celu hybrydyzacji z mikromacierzami do analizy ekspresji genów.
Protokół
Część 1: znakowanie aRNA: sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallylowych
- Do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5mL przenieść 1µg próbek aRNA.
- Próbki wysuszyć w pompie próżniowej przy niskiej temperaturze lub bez podgrzewania, aż będą całkowicie suche. Każdą probówkę zakręcić niezwłocznie po wysuszeniu – nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia!
- Do każdej probówki dodać 9µl buforu sprzęgającego i resuspendować aRNA, delikatnie mieszając na wirówce typu vortex przez 1 minutę. Krótko odwirować, aby zebrać próbkę na dnie probówki, a następnie pozostawić próbkę na lodzie.
- Do każdej probówki z barwnikiem Cy3 lub Cy5 dodać 22µl wysokiej jakości DMSO. Jedna probówka barwnika wystarcza na 2 próbki. Barwnik Cy3 służy do znakowania próbek referencyjnych, a barwnik Cy5 do znakowania próbek testowych.
- Barwniki wymieszać dokładnie na wirówce typu vortex. Przechowywać barwniki w ciemności do momentu użycia. Nie przygotowywać barwnika wcześniej niż 1 godzinę przed zastosowaniem. Należy dopilnować, aby na żadnym etapie do mieszaniny barwnika/DMSO nie dostała się woda.
- Do każdej próbki dodać 11µl przygotowanego roztworu DMSO/barwnik Cy. Dobrze wymieszać, delikatnie wirując na vortexie.
- Inkubować przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej. Próbki przykryć folią aluminiową lub przechowywać w szufladzie, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
- Po inkubacji do każdej próbki dodać 4,5µl hydroksyloaminy w celu zatrzymania reakcji. Dobrze wymieszać, delikatnie wirując na vortexie.
- Inkubować przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej. Próbki przykryć folią aluminiową lub przechowywać w szufladzie, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
Część 2: Oczyszczanie znakowanego aRNA
- Krótko wymieszaj kulki do wiązania RNA za pomocą vortexa, aby przed użyciem uzyskać jednorodną zawiesinę.
- Przygotuj mieszaninę do wiązania aRNA (aRNA Binding Mix) w temperaturze pokojowej. (Tabela 1)
- Wymieszaj dokładnie za pomocą vortexa.
- Przenieś odpowiednią ilość buforu do eluowania aRNA (aRNA Elution Buffer) do probówki 1,5mL i inkubuj w temperaturze 50-60°C przez co najmniej 10 minut.
- Dodaj 70µl mieszaniny do wiązania aRNA do każdej próbki i wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Przenieś próbki z płytki PCR do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.
- Dodaj 50µl 100% izopropanolu do każdej próbki i wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Delikatnie wstrząśnij płytką na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 2 minuty, aby dokładnie wymieszać próbki.
- Umieść płytkę na statywie magnetycznym w celu wychwycenia kulek magnetycznych. Pozostaw płytkę na statywie do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kulki wiążące osiądą na dnie.
- Ostrożnie odessij nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kulek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usuń nadsącz pipetą i go wylej. Na tym etapie nadsącz powinien mieć jaskraworóżowy lub jaskrawoniebieski kolor ze względu na nieprzyłączone cząsteczki barwnika.
- Zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego.
- Dodaj 100µl roztworu do przemywania aRNA (aRNA Wash Solution) do każdego dołka i wstrząśnij płytką przez 1 minutę na wytrząsarce orbitalnej z umiarkowaną prędkością. Na tym etapie kulki mogą nie ulec całkowitemu rozproszeniu.
- Umieść płytkę na statywie magnetycznym w celu wychwycenia kulek magnetycznych.
- Ostrożnie odessij nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kulek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usuń nadsącz pipetą i go wylej.
- Zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego.
- Powtórz przemywanie po raz 2nd z użyciem 100µl roztworu do przemywania aRNA.
- Po 2nd przemywaniu osusz kulki, wstrząsając płytką przez 1 minutę na wytrząsarce orbitalnej z maksymalną prędkością. Nie doprowadź do nadmiernego wysuszenia próbek!
- Eluuj aRNA z kulek, dodając 20µl podgrzanego buforu do eluowania aRNA do każdej próbki.
- Intensywnie wstrząśnij płytką na wytrząsarce orbitalnej przez 3 minuty, a następnie sprawdź, czy kulki magnetyczne są całkowicie rozproszone. Jeśli nie, kontynuuj wstrząsanie.
- Gdy kulki magnetyczne zostaną całkowicie rozproszone, umieść płytkę na statywie magnetycznym w celu ich wychwycenia. Nadsącz zawiera oczyszczone i znakowane próbki aRNA i powinien mieć kolor bladoróżowy lub bladoniebieski.
- Ostrożnie przenieś eluat aRNA do nowej płytki PCR (lub probówek PCR).
- (Krok opcjonalny) Sprawdź stężenie RNA oraz ilość barwnika w próbkach, mierząc 1,5µl na spektrofotometrze NanoDrop z wykorzystaniem modułu Microarray.
- Natychmiast przeprowadź hybrydyzację znakowanego aRNA na wybranej platformie mikromacierzy lub alternatywnie przechowuj znakowane aRNA w temperaturze –80°C do czasu rozpoczęcia hybrydyzacji.
Tabela 1 Mieszanina wiążąca aRNA
| Odczynnik | Ilość na 1 reakcję |
| Kuleczki do wiązania RNA* | 10µl |
| Roztwór do resuspensji kuleczek* | 4µl |
| 100% izopropanol** | 6µl |
| Koncentrat buforu do wiązania aRNA | 50µl |
*Najpierw wymieszać koraliki do wiązania RNA z roztworem do resuspensji koralików
**Dodać izopropanol i dobrze wymieszać przed dodaniem koncentratu buforu do wiązania aRNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe etapy
Podczas przeprowadzania sprzęgania aminowego z allylem kluczowe jest ponowne rozpuszczenie barwnika w DMSO krótko (mniej niż 1 godzinę) przed sprzęganiem oraz upewnienie się, że do mieszaniny barwnika i DMSO nie dostanie się woda, ponieważ weszłaby ona w reakcję z grupą aktywną barwnika. Nie należy nadmiernie wysuszać RNA (można je zredukować do 1-2uL zamiast całkowitego wysuszenia) i należy je dokładnie rozpuścić w buforze do sprzęgania. Podczas reakcji sprzęgania należy przecho...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Fundusze dla stypendystów Whitehead Institute
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Zestaw reaktywnych barwników CyDye do znakowania post-hoc | Odczynnik | GE Healthcare | RPN5661 | Zawiera barwniki Cy3 i Cy5 |
| Spektrofotometr UV-VIS NanoDrop ND-1000 | Inne | NanoDrop | ND-1000 | Lub równoważny spektrofotometr |
Bibliografia
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
