Artykuł metodologiczny

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Homarus Americanus

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1171

⸱

28 maja 2009

 , 
1Volen Center for Complex Systems, Brandeis

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy precyzyjną dyssekcję układu nerwowego stomatogastrycznego z żołądka homara amerykańskiego (Homarus americanus).

Streszczenie

W celu zrozumienia, w jaki sposób układy nerwowe generują aktywność i reagują na środowisko, neuronaukowcy korzystają z systemów modelowych, które wykazują interesującą ich aktywność oraz są dostępne i podatne na metody eksperymentalne. Układ nerwowy stomatogastryczny (STNS) homara amerykańskiego (Homarus americanus(znany również jako homar amerykański lub homar z Maine) został ustanowiony jako modelowy układ do badania sieci generujących rytm oraz neuromodulacji sieci. STNS składa się z 3 zwojów przednich (2 zwojów komisuralnych i zwoju przełykowego), zawierających neurony modulujące, które rzutują centralnie do zwoju stomatogastrycznego (STG). STG zawiera około 30 neuronów, które tworzą dwie sieci generujące centralne wzorce: sieć pyloryczną i sieć żołądkową, które leżą u podstaw zachowań żywieniowych skorupiaków1,2Choć możliwe jest badanie tego układuin vivo3STNS nadal wykazuje rytmiczną aktywność po izolacjiin vitroFizyczna izolacja STNS w szalce umożliwia łatwy dostęp do somatów w zwojach w celu przeprowadzenia wewnątrzkomórkowych pomiarów elektrofizjologicznych oraz do nerwów STNS w celu przeprowadzenia pomiarów zewnątrzkomórkowych. Izolacja STNS jest procesem dwuetapowym. Pierwszy etap, polegający na wypreparowaniu żołądka z organizmu zwierzęcia, opisany jest w towarzyszącym artykule wideo4W tym artykule wideo zastosowano precyzyjne techniki sekcji w celu wyizolowania STNS z żołądka. Procedura ta pozwala na uzyskanie preparatu układu nerwowego przeznaczonego do rejestracji elektrofizjologicznych.

Protokół

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy usunąć żołądek homara z organizmu i przygotować go zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule JoVE (Bierman & Tobin, 2009). Większość opisanych poniżej kroków powinna być wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym.

Część I – Izolacja zwojów komisuralnych

  1. Ustaw szalkę tak, aby koniec przedni (przy wargach) był oddalony od Ciebie, a koniec tylny (przy odźwierniku) znajdował się najbliżej Ciebie.

  2. Upewnij się, że żołądek jest przypięty w taki sposób, aby leżał na szalce jak najpłaskiej.
    1. Przypnij przełyk po obu stronach warg.
    2. W razie potrzeby przesuń pozostałe szpilki umieszczone podczas sekcji ogólnej.
  3. Usuń skórę podskórną.
    1. Chwyć skórę podskórną w pobliżu mięśni gm2/gm3, oddziel ją od tych mięśni i delikatnie pociągnij w kierunku przednim.
    2. Oddziel skórę podskórną od leżącego pod nią tłuszczu, przecinając wszelkie połączenia. Zachowaj szczególną ostrożność w okolicy tętnicy centralnej, która otacza kluczową część układu nerwowego żołądkowo-jamowego. Pozostaw skórę podskórną nienaruszoną w promieniu około 0.5 cm od zwoju żołądkowo-jamowego, który znajduje się pomiędzy mięśniami gm1b.
    3. Odetnij oddzieloną skórę podskórną.
  4. Oddziel mózg od tkanki podłoża.
    1. Zidentyfikuj dwa duże nerwy komisuralne, które biegną obustronnie z przedniej części mózgu do zwojów komisuralnych w przedniej części żołądka.
    2. Pozostawiając te nerwy nienaruszone, delikatnie unieś mózg pęsetą i przetnij go, aby oddzielić od reszty tkanki. Zachowaj ostrożność podczas tej czynności, ponieważ pod mózgiem znajduje się nerw żołądkowo-jamowy, który musi pozostać nienaruszony.
  5. Oddziel zwoje komisuralne od otaczającej tkanki.
    1. Śledź jeden z nerwów komisuralnych aż do jednego ze zwojów komisuralnych.
    2. Zidentyfikuj ion oraz son – nerwy te muszą pozostać nienaruszone. Zwojów komisuralnych będzie odchodzić wiele nerwów. Przetnij większość z nich (z wyjątkiem ion i son), pozostawiając jeden dodatkowy nerw przymocowany, aby utrzymać zwój komisuralny na miejscu do czasu zakończenia sekcji.
    3. Powtórz czynność z drugim zwojem komisuralnym.
  6. Oczyść ion i son od strony bocznej do przyśrodkowej. Pozostaw nienaruszony nerw wargowy, aby zakotwiczyć układ nerwowy do żołądka. Zwój przełykowy znajduje się w miejscu przecięcia się nerwów ion. Możesz oczyścić obszar pod nim, chwytając dolny nerw komorowy i pociągając go do góry, aby przeciąć tkankę poniżej.

Część II – Izolacja zwoju stomatogastrycznego (STG) i pozostałych nerwów.

  1. Oddziel STG od otaczającej go tkanki.
    1. STG znajduje się wewnątrz tętnicy przebiegającej pomiędzy mięśniami gm1b a mięśniami gm2a i b. Należy zlokalizować odcięty koniec tętnicy w pobliżu mięśni gm2a i b.
    2. Przeciągnij odcięty koniec tętnicy do góry i przednio, aby odsłonić dvnKontynuuj podciąganie, aż osiągniesz poziom pozostałej tkanki podskórnej. Po oddzieleniu tętnicę można przyciąć do poziomu, w którym styka się ona z pozostałą tkanką podskórną.
    3. Odciąć płat mięśniowy znajdujący się w rostrum homara.
    4. Unieś skórę właściwą wraz z tkanką podskórną nad tętnicą, zwracając uwagę, że tętnica tworzy tunel w tkance tłuszczowej powyżej zwoju trójdzielnego (STG). Wsuń jedno ramię nożyczek wewnątrz tętnicy i przetnij mięsień znajdujący się nad nią. Sprawdź, czy widzisz dvn podczas cięcia należy upewnić się, że znajduje się bezpiecznie powyżej STG. Kontynuuj cięcie w kierunku przednim, prowadząc je wzdłuż tętnicy. Przecinając tkanki powyżej STG, będziesz w stanie zobaczyć stn biegnące przednio z STG i zagłębiające się w mięsień. Kontynuuj cięcie w kierunku przednim, aby całkowicie oddzielić mięsień powyżej STG.
    5. Usuń wszelkie tkanki z obszaru stn.
  2. Oddzielić agnz otaczającej tkanki. (Nawet jeśli nie planujesz rejestrować sygnałów z) agn(będziesz potrzebować fragmentu nienaruszonego nerwu, aby unieruchomić zwoj w celu przeprowadzenia rejestracji wewnątrzkomórkowych.)
    1. Aby lepiej zobaczyć agnusunąć pozostałą skórę właściwą oraz cienką warstwę leżącego pod nią mięśnia.
    2. Tuż za górnym zakrętem skroniowym (STG) należy zidentyfikować ciemny tunel w tkance tłuszczowej i mięśniach po obu stronach dvn.
    3. Wprowadź jedno ostrze nożyczek do wnętrza tunelu i przetnij tkankę powyżej nerwu. Kontynuuj cięcie bocznie, prowadząc je wzdłuż nerwu, aby go wyizolować. (Kilka milimetrów wystarczy do przytwierdzenia zwoju szpilkami, jednak należy odsłonić co najmniej 5 mm AGN jeśli planują Państwo z niego rejestrować sygnały).
    4. Odłącz agn z mięśnia, który unerwia, poprzez przecięcie połączeń.
    5. Powtórz czynność po drugiej stronie, aby wyizolować drugą stronę agn.
    6. Gdy obie AGNPo przeprowadzeniu sekcji należy przeciąć wszystkie mięśnie i tkanki łączące STG z żołądkiem.
  3. Wyizoluj mvnSą to bilateralna para niewielkich nerwów odgałęziających się od lvN i przechodząc bocznie pod tkanką tłuszczową.
    1. Użyj nożyczek lub dwóch pęset, aby przeciąć tkankę tłuszczową po jednej stronie dvn, w pobliżu miejsca, w którym rozgałęzia się na dwa lvns. Znajdują się Państwo daleko od mvni nie zaryzykują ich przecięcia.
    2. Podnieś warstwę tłuszczową i zidentyfikuj małe mvn poniżej. Nerwy te przebiegają przyśrodkowo do bocznie, tuż za poziomem mięśni gm1b.
    3. Usuń warstwę tłuszczu znajdującą się nad mvnpozostawiając nerw nienaruszony, aby nie splątał się z innymi tkankami. Jego boczny koniec odetnie się od żołądka na zakończenie sekcji.
    4. Powtórz ten proces po drugiej stronie, aby wyizolować pozostały element mvn.
  4. Wyizoluj Lvnnerwy przednie i tylne.
    1. Zaczynając od miejsca, w którym lvnodgałęzia się bocznie od dvn, postępuj zgodnie z lvn poprzez wycięcie tkanki tłuszczowej znajdującej się nad nim. W zależności od preparacji czasami można usunąć całą warstwę tłuszczu nad nerwem.
    2. Kontynuuj ujawnianie Lvn do momentu, w którym psn odgałęzia się.
  5. Wyizoluj pyn.
    1. Zlokalizuj pynjest to nerw przebiegający tylnie nad odźwiernikiem.
    2. Usuń cienką błonę pokrywającą ten obszar.
    3. Wyizoluj pyn poprzez wycięcie niewielkiego fragmentu odźwiernika, przymocowanego do pyn.
    4. Ostrożnie unieś odcinek odźwiernika i odetnij tkankę po obu stronach pyn aż do momentu dotarcia do odgałęzienia, które przytwierdza się do pdn.
  6. Wyizoluj pdn.
    1. Zlokalizuj pdnjest to nerw przebiegający tylnie w stosunku do mięśnia rozszerzacza odźwiernika.
    2. Wyciąć niewielki fragment mięśnia rozszerzacza odźwiernika, przymocowany do pdn.
    3. Ostrożnie unieś wycinek mięśnia rozszerzacza odźwiernika i odetnij tkankę po obu stronach pdn aż do osiągnięcia odgałęzienia, które przytwierdza się do pyn.
  7. Wyizoluj część brzuszna Lvn, który łączy pyn i pdn do lvN.
    1. W trójkątnym punkcie rozgałęzienia, w którym pyn i pdn połącz z brzuszną lvnwyizoluj dowolny niewielki odcinek nerwu odgałęziającego się od brzusznej lvn, takich jak vplnSłużyć to będzie jako uchwyt do pociągnięcia strony brzusznej lvn.
    2. Podnieś uchwyt i odetnij tkankę po obu stronach strony brzusznej lvnpracując w kierunku przednim, aż do momentu, w którym psn odgałęzia się.
  8. Powtórz kroki 10–13, aby wyizolować lvn oraz nerwy tylne po przeciwnej stronie.

  9. Oddziel układ nerwowy żołądkowo-przełykowy od żołądka.
    1. Aby całkowicie oddzielić Lvn wyciągnij z żołądka, pociągnij za psn i odciąć wszystkie tkanki oraz nerwy przytwierdzone do lvn i brzuszny lvnz wyjątkiem pdn i pynPowtórz tę procedurę po drugiej stronie.
    2. Odetnij boczny koniec każdego z nich mvnUnieś koniec boczny i odetnij wszelkie zbędne przyczepy między nerwem a leżącą pod nim tkanką żołądka.
    3. Na przednim końcu odetnij wszelkie zbędne połączenia z zwojami komisuralnymi oraz przetnij nerw wargowy po każdej stronie.
    4. Wizualnie obejrzyj układ nerwowy stomatogastryczny, aby zidentyfikować, a następnie odciąć wszelkie dodatkowe połączenia z tkanką żołądka.
    5. Chwyć przednie końce obu nerwów komisuralnych, powyżej zwojów komisuralnych, a następnie odseparuj stomatogastryczny układ nerwowy od żołądka i przesuń go na bok naczynia. Podczas tej czynności przetnij wszelkie pozostałe połączenia, aby całkowicie uwolnić układ nerwowy.
  10. Przygotuj małą szalkę z Sylgardu.
    1. Dokładnie potrzyj powierzchnię Sylgardu w małej szalce tkanką żołądka. Zmniejszy to hydrofobowość Sylgardu, dzięki czemu sól fizjologiczna rozprzestrzeni się równomiernie po całej powierzchni szalce.
    2. Opłukać i napełnić naczynie Sylgard schłodzoną solą fizjologiczną.
  11. Przenieś układ nerwowy do przygotowanej szalki z Sylgardu, chwytając przednie końce obu nerwów komisuralnych, wyjmując układ nerwowy z dużej szalki i kładąc go w małej szalce.

  12. Ustabilizuj STNS w małym naczyniu, używając kombinacji pinów minuten oraz cieńszych pinów wyciętych z drutu wolframowego.
    1. Należy upewnić się, że preparat jest ułożony grzbietem do góry, sprawdzając, czy dolny nerw komorowy jest skierowany w stronę przeciwną do Sylgardu.
    2. Usuń mózg i przypnij nerwy komisuralne.
    3. Delikatnie naciągnij układ nerwowy, aby był napięty i płaski, chwytając za każdy z psnod tyłu i z boku, a następnie przypinając je.
    4. Usunąć mięsień rozszerzacza odźwiernika z pdns, a następnie przypnij pdns.
    5. Usunąć segment odźwiernika z pyns, i przypnij pyns.
    6. Ustabilizuj pozostałe odizolowane nerwy, takie jak nerwy wargowe, mvni AGNs.
  13. Zdejmij osłonkę z STG.
    1. Należy upewnić się, że STG przylega płasko do Sylgardu i jest napięte przez stabilizatory boczne. AGNs, przedni stn or tylną dvn.
    2. Ustaw oświetlenie w taki sposób, aby umożliwić wizualizację aksonów wewnątrz dvn.
    3. Za pomocą małej szpilki lub cienkiej igły wolframowej wykonaj mały, płytki otwór w osłonce otaczającej dvn, bezpośrednio za zakrętem skroniowym górnym (STG).
    4. Przeciągnij igłę w poprzek dvn, grzbietowo względem aksonów, aby utworzyć poziome nacięcie w osłonce nerwu.
    5. Chwyć płat osłonki nerwu znajdujący się za STG i pociągnij go w kierunku przednim, aby usunąć osłonkę z grzbietowej strony STG.
Skróty:
STNSUkład nerwowy stomatogastryczny
STGZwoj stomatogastryczny
CoGZwoj komisuralny
stnnerw stomatogastryczny
mvnnerw komory przyśrodkowy
ionnerw przełykowy dolny
sonnerw przełykowy górny
agnnerw żołądkowy przedni
dvnnerw komory grzbietowy
lvnnerw komory boczny
psnnerw żołądka tylny
vplnnerw boczno-tylny brzuszny
pynnerw odźwiernika
pdnnerw rozkurczowy odźwiernika

Dyskusja

Anatomia żołądka homara oraz STNS została wcześniej szczegółowo opisana5,6, a warianty tej procedury sekcyjnej były wykorzystywane w licznych badaniach. Zalecamy zapoznanie się z anatomią żołądka5-7 oraz STNS5,8 przed rozpoczęciem sekcji. Taka znajomość zmniejszy ryzyko przypadkowego uszkodzenia nerwów i tkanek.

Aby zachować żywotność preparatu, kluczowe jest utrzymywanie go w niskiej temperaturze. Można to łatwo osiągnąć, wymieniając sól fizjologiczną co 30 min na sól fizjologiczną o temperaturze 4˚C przechowywaną w lodówce. Po zanurzeniu w zimnej soli fizjologicznej izolowany preparat STNS pozostaje żywotny przez wiele godzin. Rejestracje przeprowadzone u pokrewnych Homarus gammarus wykazały stabilną aktywność rytmiczną STG przez 5 dni in vitro9; podobna wytrzymałość została zaobserwowana u H. americanus (pers. obs.).

Do zachowania trwających wzorców ruchowych niezbędny jest sygnał modulujący przekazywany do STG z zwojów komisuralnych. W związku z tym, aby utrzymać prawidłową aktywność rytmiczną, zwoje te oraz nerwy ion, son i stn muszą pozostać nienaruszone. Opisana przez nas dyssekcja zachowuje kilka nerwów ruchowych (zawierających aksony neuronów ruchowych): agn (zawierające aksony żołądkowego młyna (GM)), mvn (zawierające aksony bocznego żołądka (LG) i dolnego serca (IC)), pyn (zawierające aksony neuronów pylorycznych (PY)), pdn (zawierające aksony rozkurczowe pyloryka (PD)) oraz lvn (zawierające aksony bocznego pyloryka (LP), środkowego żołądka (MG), LPG, a także aksony z GM, PD i PY). Poprzez dyssekcję dodatkowych (lub innych) nerwów można rejestrować aksony innych neuronów ruchowych. Każdy indywidualny typ aksonu neuronu ruchowego można zarejestrować osobno, przeprowadzając dyssekcję i rejestrację z nerwu unerwiającego mięsień, do którego rzutuje dany typ neuronu.

Niniejszy preparat może być wykorzystany w różnych badaniach koncentrujących się na funkcjonowaniu układu nerwowego. Aktywność neuronów można rejestrować za pomocą wewnątrzkomórkowych rejestracji elektrodami ostrymi z ciał komórek lub aksonów, bądź poprzez pozakomórkową rejestrację impulsów elektrycznych z nerwów. Wiele kanałów jonowych w neuronach STG zostało częściowo sklonowanych, a poziom mRNA można zmierzyć w ręcznie wyizolowanych ciałach komórek10,11.

Podziękowania

Pragniemy podziękować naszej opiekunce naukowej, dr Eve Marder. Badania te były wspierane przez granty National Institute of Health NS17813 dla Eve Marder oraz NS059255 dla A-E T.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cienki drut wolframowy (średnica 0.001 in.)NarzędzieCalifornia Fine Wire CompanyPociąć na kawałki 1-2mm do wykorzystania jako cienkie piny.
Pinceta nr 5NarzędzieFine Science Tools91150-20
Piny MinutenNarzędzieFine Science Tools26002-10
Nożyczki sprężynowe Moria (ostrza 7mm)NarzędzieFine Science Tools15370-52Są to narzędzia najwyższej klasy. Od tego samego producenta dostępne są bardziej ekonomiczne nożyczki sprężynowe.
Szalka Petriego (100x15mm)NarzędzieFisher Scientific08-757-12Wypełnić warstwą Sylgard 182 o grubości 2-4mm.
Sylgard 182InneDow Corning182
Uchwyt do pinówNarzędzieFine Science Tools26018-17Opcjonalnie. Usuwanie osłonki można przeprowadzić przy użyciu samych nożyczek i cienkiej pincety.
Super cienka pinceta nr 5SFNarzędzieFine Science Tools11252-00
Igły wolframoweNarzędzieFine Science Tools10130-05Opcjonalnie. Usuwanie osłonki można przeprowadzić nożyczkami lub pinami wyciętymi z cienkiego drutu wolframowego.
Mikroskop sekcyjny

Bibliografia

  1. Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
  2. Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
  3. Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
  4. Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
  5. Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
  6. Herrick, F. H. Natural history of the American lobster. Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).
  7. Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
  8. Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion. J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).
  9. Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
  10. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
  11. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja homaraizolacja zwoju o dkowegoseparacja zwoj w komisuralnychprzygotowanie tkanki nerwowejrejestracja elektrofizjologicznatechnika mikrodissekcjiusuwanie tkanki o dkaunieruchamianie uk adu nerwowegoprzygotowanie naczynia z sol fizjologiczn
Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Homarus Americanus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.