Artykuł metodologiczny

ES pochodzące z komórek nabłonka Cell Cultures

DOI:

10.3791/118

⸱

30 listopada 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyprowadzenie nabłonka prekursorów z zarodkowych komórek macierzystych (ES) komórki za pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórek ES mają możliwość różnicowania się komórek ze wszystkich listków zarodkowych, co czyni je atrakcyjnym narzędziem do rozwoju nowych terapii. Ogólnie rzecz biorąc, różnicowania komórek ES następujące pojęcia najpierw wygenerować niedojrzałe komórki progenitorowe, które następnie mogą być propagowane i zróżnicowane w dojrzałych komórek fenotypy. Dotyczy to również ES pochodzące z komórek nerwowych, w którym rozwój komórek nerwowych na dwa główne etapy: po pierwsze, pochodzenie i rozwój niedojrzałych prekursorów nabłonka i drugim, ich różnicowanie się w dojrzałe komórki nerwowe. Powszechną metodą produkcji nerwowych komórek progenitorowych z komórek ES jest oparta na embryoid ciała (EB) formacja, która ujawnia różnicowanie komórek ze wszystkich listków zarodkowych w tym neuroectoderm. Alternatywnych i bardziej efektywna metoda rozwoju komórek nabłonka wywoływać wykorzystuje pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA), które można osiągnąć przez wspólne hodowanie komórek ES z kości czaszki pochodzące ze szpiku komórki podścieliska (1). Zarówno tworzenie EB i SDIA, ujawniają rozwoju struktur rozeta-podobne, które są uważane przypominają cewy nerwowej i / lub grzebienia nerwowego-jak przodkowie. Prekursorów komórek nerwowych mogą być izolowane, rozszerzone i dalsze zróżnicowane w specyficzne neurony i komórki gleju za pomocą określonych warunkach hodowli. Poniżej opiszemy w zakresie wytwarzania i izolacji takich rozet współpracy kultury eksperymenty z linii komórek podścieliska MS5 (2-5).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krok 1

  1. Płyta mitomycyna-C ggrowth hamowanej (10 mg / ml do 2,5 godziny) MS5 komórek przy gęstości 70000 / cm2 żelatyna powlekane (0,01% przez 30 minut) 6 płyt oraz w α-MEM mediów.
  2. Gdy komórki są związane i tworzą monowarstwy (ponad wzrostu noc), przejdź do SRM.
  3. Ręcznie izolować kolonie komórek ES z hodowli komórek ES za pomocą strzykawki z igłą 27 G ½.
  4. Tritrurate kolonii dokładnie z 1 ml końcówka niebieski i płytki w niskiej gęstości na MS5 komórek (zwykle 2-3 kolonie na 6 i płyty).

Uwaga: Komórki ES mogą być również pobrane od enzymatycznej propagacji za pomocą kolagenazy lub trypsyny.

Krok 2

  1. Wzrost komórek ES na MS5 podajniki do 14-21 dni do rozety zawierających tworzyć kolonie.


Uwaga: media często się zmieniają. Rozety są zazwyczaj na zewnętrznych krawędziach kolonii i ich tworzenie może być znacznie większe, gdyby 300-500 ng / ml kubek jest dodawany do SRM (3). W niektórych protokołów zróżnicowanie, SRM mogą być wymieniane z N2-mediów i uzupełnione wzrostu lub innych czynników promowanie specyfikacji komórki (2-5).

Krok 3

  1. Wyizolować i wybrać rozety z 27 ½ igły G pod mikroskopem.

Uwaga: Należy unikać cięcia i zbieranie MS5 komórki podścieliska. Jeśli kolonie są pakowane z rozetami, można również izolować całej kolonii.


Krok 4

  1. Zaaspiruj grup rozety, tritrurate ostrożnie z 1 niebieski ml końcówki, a płyta je poli-L-ornityny (0,001%) i fibronektyny (1 mg / ml) lub lamininy (1 mg / ml) powlekane 6 studni w N2-media zwykle uzupełnione bFGF (20 ng / ml). Rozety będzie reform i rozszerzenia.

Uwaga: Aby zwiększyć przeżywalność komórek, można płyty małych klastrów w kropelki w celu zwiększenia gęstości komórek. Ten krok może być modyfikowane poprzez dodanie N2-mediów, dodatkowy wzrost lub inne czynniki promowanie specyfikacji komórki (2-5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten pokazuje różne etapy w tworzeniu i izolowanie komórki nabłonka nerwowego z ludzkich komórek ES pomocą SDIA. Zastosowanie tej metody jest wieloraki i jest stosowany w wielu protokołów do produkcji określonych neuronów (np. 1, 2, 5-9). Uważa się, że rozety przypominają komórki nerwowe rury z przednim fenotyp (2, 5, 10), a także zawierać neuronowych przodków szczytu (11, 12). Ponadto, zachowują pewien stopień plastyczności, ponieważ mogą one być wzorowane przez szczególne czynniki w określonych warunkach hodowli. Tak więc, SDIA po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
L-glutaminaGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicylina/streptomycynaGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Knockout serum replacementGIBCO, by Life Technologies10828
MEM nieessentialny roztwór aminokwasówGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
Suplement N2-AStem Cell Technologies07152
Mitomycyna-CSigma-AldrichM0503
Żelatyna typu ASigma-AldrichG1890
poly-L-ornitynaSigma-AldrichP4957roztwór 0,01%
LamininaSigma-AldrichL-2020
FibronaiektynaSigma-AldrichF2006
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)Invitrogen13256
Strzykawka 1 mL z igłą 27 1/2 GBD Biosciences309623
Pożywka N2-ApożywkaDMEM/F12 + 1% suplementu N2-A
Pożywka z zamiennikiem surowicy (SRM)pożywkaKnockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement + 1% MEM nieessentialnego roztworu aminokwasów + 2 mM L-glutaminy
Pożywka α-MEMpożywkaα-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutaminy + 1% penicyliny/streptomycyny
MS5linia komórkowakomórki zrębu
Mikroskop
Płytki 6-dołkowedo hodowli tkanek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek ESkom rki neuroepithelialnetworzenie cia embrionoidalnychaktywno indukuj ca pochodz ca z kom rek stromystruktury przypominaj ce rozetyizolacja progenitor w neuronalnycheksperymenty z kokulturkom rki stromy MS5progenitorzy cewy nerwowejprogenitorzy grzebienia neuronalnego

Powiązane artykuły