Przetwarzanie mikromacierzy cDNA sosny Loblolly PtGen2

Summary

Mikromacierz cDNA PtGen2 została opracowana do badań ekspresji genów u sosny pospolitej (P. taeda) i innych gatunków drzew iglastych. Tutaj pokazujemy techniki obsługi i mycia przed i po hybrydyzacji, które można zastosować z tą matrycą, aby uzyskać lepszą konsystencję, zredukowane artefakty i niższe tło.

Abstract

PtGen2 to mikromacierz cDNA o cechach 26 496 zawierająca amplifikowane EST z sosny loblolly. Macierz jest produkowana w naszym laboratorium do użytku przez naukowców badających ekspresję genów w sosnie i innych gatunkach drzew iglastych. PtGen2 został opracowany w wyniku naszych wysiłków związanych z odkryciem genów u sosny loblolly i składa się z sekwencji zidentyfikowanych głównie z tkanek korzenia, ale także z igły i łodygi. ^1,2 PtGen2 został przetestowany przez hybrydyzację różnych docelowych cDNA drzew iglastych znakowanych barwnikiem Cy-dye, przy użyciu zarówno amplifikowanych, jak i nieamplifikowanych metod znakowania pośredniego, a także testowany w wielu warunkach hybrydyzacji i mycia. Ten film koncentruje się na obsłudze i przetwarzaniu szkiełek przed i po hybrydyzacji, a także po hybrydyzacji, przy użyciu pewnych modyfikacji opracowanych wcześniej procedur. ^3,4 Dołączono również, wyłącznie w formie tekstowej, protokoły wykorzystywane do generowania, znakowania i oczyszczania docelowych cDNA, a także informacje o oprogramowaniu wykorzystywanym do dalszego przetwarzania danych.

PtGen2 jest drukowany z zastrzeżonym buforem druku, który zawiera wysokie stężenia soli, które mogą być trudne do całkowitego usunięcia. Szkiełka są najpierw myte w ciepłym roztworze SDS przed wstępną hybrydyzacją. Po wstępnej hybrydyzacji szkiełka są energicznie myte w kilku zmianach wody, aby całkowicie usunąć pozostałe sole. LifterSlips™ są następnie czyszczone i umieszczane na szkiełkach, a znakowane cDNA jest ostrożnie ładowane do mikromacierzy za pomocą działania kapilarnego, co zapewnia równomierne rozprowadzenie próbki na szkiełku i zmniejsza ryzyko włączenia pęcherzyków. Hybrydyzacja celów do macierzy odbywa się w temperaturze 48°C w warunkach wysokiej wilgotności. Po hybrydyzacji wykonuje się serię standardowych prań w temperaturze 53°C i temperaturze pokojowej przez dłuższy czas. Przetwarzanie slajdów PtGen2 przy użyciu tej techniki zmniejsza artefakty pochodzące z soli i SDS, które często występują, gdy tablica jest przetwarzana mniej rygorystycznie. Hybrydyzacja celów pochodzących z kilku różnych źródeł RNA drzew iglastych, ten protokół przetwarzania przyniósł mniej artefaktów, zredukował tło i zapewnił lepszą spójność między różnymi eksperymentalnymi grupami macierzy.

Protocol

(Uwaga: sekcje 1 - 4 nie zostały pokazane w filmie)

Przygotowanie docelowego cDNA znakowanego Cy

Poniżej znajduje się protokół, którego używamy do syntezy cDNA z całkowitego RNA sosny loblolly i pośredniego znakowania cDNA przed hybrydyzacją mikromacierzy. Chociaż wprowadzono kilka nietrywialnych modyfikacji, poniższy protokół jest podobny do tego w instrukcji obsługi dostarczonej z zestawem do pośredniego znakowania cDNA SuperScript firmy Invitrogen.

Część 1: Reakcja syntezy pierwszej nici cDNA

1. Wymieszaj i krótko odkręć każdy element zestawu przed użyciem.
2. Przygotu....

Discussion

PtGen2 to niedawno opracowana, niestandardowa mikromacierz cDNA, która została zaprojektowana do użytku głównie przez społeczność badawczą sosny loblolly. Wstępne wyniki uzyskane do tej pory wykazały, że matryca jest cennym narzędziem w ocenie zdarzeń transkrypcyjnych, które zachodzą w odpowiedzi na stres związany z suszą, a także w monitorowaniu zmian zachodzących podczas rozwoju zarodka u sosny morskiej, Pinus pinaster ^5,6 Niedawno wykazaliśmy również, że PtGen2 działa dobrze w hybrydyzacjach międz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bufor			buforowy przed hybrydyzacją	5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA
Bufor buforowy				30% formamidu, 5X SSC, 5X Denhardt' s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA. GF), 0,1% roztwór do
płukania SDS #1	Bufor			1X SSC, 0,2% SDS, podgrzać do 43° C
Roztwór do płukania #2	Bufor			0,1X SSC, 0,2% SDS
Roztwór do przemywania #3	Bufor			0,1X SSC
Odczynnik stożkowy do alkoholu izopropylowego		Sigma-Aldrich	34959-2,5L
50 ml Pozostałe		Falcon BD	352070
15 ml Probówki stożkowe	Inne	Falcon BD	352196	Użyj tej lub podobnej nasadki umieszczonej na dnie każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml podczas wirowania
Coplin Jar		Wheaton	900520
Naczynie do barwienia i Stojak	Inne	Wheaton	900200
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)	Inne	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.
SuperScriptTM Zestaw do pośredniego znakowania cDNA		Invitrogen	L1014-02
Zestaw Turbo DNazy		System Ambion	AM1907
Odczynnik barwnikowy Cy-5		GE Healthcare	PA25001
Odczynnik barwnikowy Cy-3		GE Healthcare	PA23001
PodnośnikSlipy™	Inne	Erie Scientific	25X601
HybChambers	GeneMachines		JHYB200003