Makro- i mikrosekcja nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych (Danio rerio)

Podsumowanie

Nabłonek sensoryczny ucha wewnętrznego dorosłych danio przebraniego stanowi dobry model badawczy do zrozumienia mechanizmów regeneracji komórek rzęskowych u dorosłych kręgowców. Niniejszy protokół prezentuje precyzyjną dyssekcję nabłonków, która pozwala na pobranie próbek tkanek do badania procesów regeneracyjnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym.

Streszczenie

Nabłonki neurosensoryczne w uchu wewnętrznym są kluczowymi strukturami dla funkcji słuchu i równowagi. Dlatego ważne jest zrozumienie cech komórkowych i molekularnych tych nabłonków, które składają się głównie z dwóch typów komórek: komórek rzęskowych (HCs) oraz komórek podporowych (SCs). W niniejszej pracy zdecydowaliśmy się badać nabłonki sensoryczne ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych nie tylko dlatego, że struktury nabłonkowe są wysoce konserwatywne u wszystkich badanych kręgowców, ale także dlatego, że dorosłe danio pręgowane potrafią regenerować HCs – zdolność, którą ssaki tracą krótko po narodzinach. Wykorzystujemy ucho wewnętrzne dorosłych danio pręgowanych jako system modelowy do badania mechanizmów regeneracji HCs ucha wewnętrznego u dorosłych kręgowców, co może być pomocne w terapii klinicznej deficytów słuchu i równowagi u ludzi wynikających z utraty HCs.

W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić preparację wstępną i precyzyjną nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio prążkowanych. Preparacja wstępna polega na usunięciu tkanek otaczających ucho wewnętrzne i jest pomocna przy przygotowywaniu przekrojów tkankowych, co pozwala nam zbadać szczegółową strukturę nabłonków sensorycznych. Preparacja precyzyjna polega na oczyszczeniu każdego z poszczególnych nabłonków z tkanek niebędących nabłonkiem sensorycznym i umożliwia nam łatwe badanie heterogeniczności całego nabłonka w próbkach przygotowanych metodą whole-mount.

Protokół

Część 1: Przygotowanie tkanki

1. Uśmierć dorosłe danio pręgowane, używając buforowanego MS-222 (methanesulfonate salt ethyl 3-aminobenzoate, 0,03%).
2. Wykonaj dekapitację ryby. Odetnij dolną szczękę, umieść głowę na podkładce sekcyjnej stroną brzuszną do góry i unieruchom tkankę za pomocą szpilek entomologicznych. Usuń tkankę miękką znajdującą się brzusznie od czaszki, a następnie pod mikroskopem sekcyjnym rozważ szeroko brzuszna część torebki czaszkowej za pomocą pęsety precyzyjnej.
3. Utrwal głowę ryby w paraformaldehydzie (4%) w temperaturze 4°C przez noc.
4. Przepłucz utrwaloną głowę ryby w PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) trzykrotnie, każdorazowo przez 5 minut.

Część 2: Makroskopowa sekcja ucha wewnętrznego

1. Umieść głowę ryby na podkładce do sekcji stroną brzuszną do góry. Unieruchom ją za pomocą szpilek entomologicznych. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać pod mikroskopem sekcyjnym.
2. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń kość czaszki nad uchem wewnętrznym, a następnie ostrożnie wyciągnij tkanki ucha wewnętrznego: woreczki (saccules), lagenae oraz utriculae. Woreczek i lagena są ściśle ze sobą połączone i tym samym są wyciągane razem, podczas gdy utricula (znajdująca się przed woreczkiem i lageną) prawdopodobnie oddzieli się od pozostałych organów końcowych podczas sekcji.
3. Umieść tkanki ucha wewnętrznego w PBS (1X). Jeśli nie jest wymagana dalsza precyzyjna sekcja, przepłucz tkankę 2-3 razy w PBS (1X); można ją następnie wykorzystać do innych doświadczeń, np. do cięć mrożonych.

Część 3: Precyzyjna mikrodysekcja nabłonka sensorycznego ucha wewnętrznego

1. Precyzyjną dysekcję można przeprowadzić w kropli PBS (1X) na czystym szkiełku przedmiotowym.
2. Za pomocą dwóch par precyzyjnych pęset wyjmij otolit utriculi z utriculi, a następnie, w razie potrzeby, odetnij nieczuciową tkankę nabłonkową oraz unerwienie nabłonków, używając precyzyjnej pęsety i ostrza igły.
3. Przed oddzieleniem nabłonków sakkulum i lagena usuń otolit lagena, starając się zachować sakkulum w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Umieść tkankę w kropli PBS stroną brzuszną do góry. Używając ostrza igły, ostrożnie przetnij tkankę pomiędzy sakkulum a lagena. W razie potrzeby odetnij nadmiar nieczuciowej tkanki nabłonkowej oraz unerwienie, używając precyzyjnych pęset i ostrza igły.

Część 4: Barwienie fluorescencyjne komórek rzęskowych w nabłonkach sensorycznych

1. Przepłucz nabłonki sensoryczne roztworem PBT (1XPBS i 1% Triton X-100) 3 razy, przez 5 min każdego razu.
2. Inkubuj nabłonki z faloidyną znakowaną fluorochromem (np. Alexa Flour 488 Phalloidin, rozcieńczenie 1:1 000) przez 30 min w temperaturze pokojowej.
3. Przepłucz nabłonki sensoryczne roztworem PBT 3 razy, przez 10 min każdego razu.
4. Zamocuj nabłonki na szkiełku za pomocą medium montażowego i sprawdź zabarwioną tkankę pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrami o odpowiedniej długości fali.
5. Po prawidłowej dysekcji i barwieniu, pod mikroskopem można zaobserwować nieuszkodzone nabłonki z silnym barwieniem pęczków stereotypowych komórek rzęsatych (Rys. 1).

Rysunek 1. Komórki rzęsate nabłonka sensorycznego woreczka zostały zabarwione Alexa Flour 488 Phalloidin (zielony). Próbka tkanki została wypreparowana i zabarwiona zgodnie z opisem w artykule. Wykonano kilka zdjęć w różnych miejscach próbki, a następnie połączono je w mozaikę za pomocą programu Adobe Photoshop 7.0.
Pasek skali = 150µm.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano metodę preparacji makroskopowej i mikroskopowej nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, co umożliwia przygotowanie próbek tkanki do badania cech komórkowych i subkomórkowych nabłonków sensorycznych.

Aby przeprowadzić udaną sekcję, kluczowy jest pierwszy etap, czyli fiksacja. Należy zawsze używać świeżo przygotowanego roztworu paraformaldehydu, ponieważ stary roztwór doprowadzi do niedostatecznej fiksacji tkanek, co utrudni manipulac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MS222 (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanianu)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (bufor fosforanowy, 10X)	Odczynnik	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyd	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T8787
Faloidyna Alexa Fluor 488	Odczynnik	Invitrogen	A12379
Medium montażowe VECTASHIELD Hard Set z DAPI	Odczynnik	Vector Laboratories	H-1500
Mikroskop sekcyjny	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ1000
Szpilki entomologiczne	Narzędzie	Fine Science Tools	26000-40
Nożyczki	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Pinceta	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Ostrze igłowe	Narzędzie	Sharpoint	78-6810
Mikroskop fluorescencyjny	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Podkładka do sekcji	Narzędzie	eNasco	SB07840M
Danio pręgowany	Zwierzę	Różne	n/a