W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym filmie prezentujemy metodę opracowaną w naszym laboratorium w celu analizy zmian kształtu komórek oraz przemieszczeń niezbędnych do zgięcia i sfałdowania rozwijającego się mózgu danio pręgowanego (Gutzman et al, 2008). Taka analiza pozwala na nowe zrozumienie podstaw biologii komórki niezbędnej do rozwoju trójwymiarowej struktury mózgu kręgowców i znacząco zwiększa nasze możliwości badania morfogenezy rurki neuralnej. Kształtowanie się zarodkowego mózgu danio pręgowanego rozpoczyna się w 18. godzinie po zapłodnieniu (hpf), gdy pompują się komory wewnątrz neuroepitelium. Do 24. godziny hpf pierwsze etapy morfogenezy rurki neuralnej są zakończone. Stosując opisaną tutaj metodę, do zarodków w stadium jednej komórki wstrzykuje się mRNA kodujące skierowane do błony białko fluorescencyjne GFP (memGFP). Po wstrzyknięciu i inkubacji zarodek (obecnie między 18. a 24. godziną hpf) zostaje unieruchomiony w pozycji odwróconej w agarozie i poddany obrazowaniu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Warto zauważyć, że zarodek danio pręgowanego jest przezroczysty, co czyni go idealnym systemem do obrazowania fluorescencyjnego. Choć nasze analizy koncentrowały się na granicy śródmózgowia i rombencephalonu oraz na samym rombencephalonie, metodę tę można rozszerzyć na analizę dowolnego regionu danio pręgowanego do głębokości 80–100 $\mu$m.
Protokół
1. Przygotowanie mRNA do iniekcji
- mRNA użyte w tej procedurze jest transkrybowane z plazmidu kodującego mRNA CAAX-eGFP (memGFP). Najpierw należy zlinearyzować plazmid zgodnie z metodą Gutzman et al, 2008.
- Następnie przeprowadzić transkrypcję mRNA memGFP przy użyciu zestawu mMessage mMachine.
- Otrzymane mRNA rozcieńczyć do stężenia 1μg/μl, podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze -80°C.
- Przygotować formę do iniekcji z 1% agarozy z kanałami o szerokości odpowiadającej rozmiarowi embrionów w stadium jednej komórki.
- W dniu poprzedzającym iniekcję przygotować klatki do kojarzenia, oddzielając samca od samic.
- W dniu iniekcji wyciągnąć igły kapilarne za pomocą wyciągacza do mikropipet w celu przygotowania do iniekcji.
2. Wstrzykiwanie mRNA
- W dniu iniekcji rozmrozić na lodzie alikwot mRNA memGFP o stężeniu 1μg/μl.
- Rozcieńczyć mRNA w wodzie w stosunku 1:5 do końcowego stężenia 200ng/μl i przechowywać na lodzie.
- Napełnić igłę kapilarną 1μl przygotowanego mRNA memGFP o stężeniu 200ng/μl.
- Umieścić napełnioną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikroinjektora pneumatycznego.
- Ustawić objętość iniekcji na 1nl.
- Usunąć przegrody z klatek do rozrodu, w których od poprzedniego dnia znajdowały się ryby typu dzikiego.
- Zebrać embriony natychmiast po ich złożeniu. Umieścić je w agarowej formie do iniekcji, przykrytej medium dla embrionów (Westerfield, 1995), tak aby jednokomórkowy embrion był skierowany stroną od mikromanipulatora.
- Wykonać iniekcję przez chorion i żółtko w taki sposób, aby mRNA zostało wprowadzone bezpośrednio do jednej komórki. W każdym doświadczeniu zainiekować około 50 embrionów. Nie przeprowadzać iniekcji, jeśli komórka uległa już podziałowi.
- Inkubować embriony przez noc w temperaturze 28°C w medium dla embrionów.
3. Montowanie i obrazowanie embrionów
- Aby zamontować i zobrazować zarodki, należy usunąć chorion z zarodków za pomocą pęsety pod stereomikroskopem na godzinę przed interesowanym punktem czasowym.
- Przygotować preparat do zamontowania do 4 zarodków.
- Użyć silikonowego smaru próżniowego do uszczelnienia szkiełka nakrywki na spodzie specjalnie zaprojektowanego plastikowego preparatu o grubości 2mm z otworem o średnicy około 1cm.
- Wypełnić otwór w preparacie 0,7% agarozą i odstawić na około 20 minut lub do czasu stwardnienia.
- Po zestaleniu się agarozy usunąć mały korek za pomocą końcówek pipety 200μl, aby utworzyć cylindryczne otwory, w których zostaną zamontowane poszczególne zarodki.
- Umieścić zarodki na wypełnionym agarozą preparacie pod mikroskopem sekcyjnym. Dodać 50μl tricainy (Westerfield, 1995), aby znieczulić zarodki.
- Za pomocą pęsety ustawić zarodki w cylindrycznych otworach w agarozie tak, aby mózg lub interesujący region przylegały do znajdującego się poniżej szkiełka nakrywki.
- Przykryć zarodki w agarozie kolejną szklaną nakrywką zabezpieczoną silikonowym smarem próżniowym.
- Wyonać obrazowanie zarodka przy użyciu odwróconego, fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem lub dyskiem wirującym. Obrazować przy powiększeniu 63x lub wyższym, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości pojedynczych komórek w obrębie neuroepitelium.
- Obrazy są eksportowane jako pliki TIFF z oprogramowania LSM i analizowane za pomocą programu Photoshop.
4. Reprezentatywne wyniki/rezultaty
Na Rysunku 1 przedstawiono reprezentatywny obraz konfokalny neuroepithelium zarodka rybki danio w 24 hpf, w obszarze pomiędzy komorami mózgu środkowego i tylnego. Każda komórka została oznakowana GFP związanym z błoną.
Rycina 1. Obrazowanie konfokalne na żywo zarodka danio pręgowanego w 24 hpf po wstrzyknięciu memGFP.
(A) Neuroepithelium zarodka w 24 hpf, w którym każda komórka jest obrysowana przez GFP. Obrazowany obszar oddziela komory śródmózgowia i ruda mózgu (odpowiednio M i H), tworząc granicę między śródmózgiem a ruda mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym filmie prezentujemy metodę wstrzykiwania mRNA do pojedynczych komórek embrionów ryby danio-ostrobramy. Wykorzystujemy tutaj mRNA kodujące GFP skierowane do błony komórkowej w celu oznakowania każdej komórki. Następnie demonstrujemy, jak zamocować i obrazować rozwijający się mózg z rozdzielczością pojedynczej komórki. Technika ta pozwoliła nam zbadać nowy rodzaj zmiany kształtu komórek – konstrikcję podstawną, która jest niezbędna do utworzenia granicy śródmózgowia i rąbka mózgu (Gutzman et al, 2008). Podobna analiz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Serdeczne podziękowania kierujemy do dr Jennifer Gutzman, która jako pierwsza opracowała tę technikę w laboratorium Sive. Dziękujemy również J. B. Greenowi z Dana-Farber Cancer Institute w Bostonie, MA, za uprzejme udostępnienie plazmidu kodującego mRNA CAAX-GFP. Obrazowanie konfokalne zostało przeprowadzone w W. M. Keck Foundation Biological Imaging Facility w Whitehead. HS jest wspierany przez NIHMH70926. EG jest wspierany przez stypendium przeddoktorskie NSF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Agaroza SeaKem GTG | Odczynnik | Lonza Inc. | 50027 | |
| Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoowego (Trykaina) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Rurka kapilarna | Narzędzie | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1,0mmOD x 0,5mm ID/włókno 100mm |
| Silikonowy smar próżniowy | Odczynnik | VWR international | W0S717 | |
| Pinceta | Narzędzie | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| końcówki do pipety 1-200 μl | Narzędzie | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | Są one odpowiedniej wielkości dla zarodków w wieku 24 hpf. |
| zestaw do transkrypcji mMessage mMachine | Odczynnik | Ambion | AM1340 | Polimeraza RNA SP6 |
| Skanujący konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510 | Mikroskop | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Mikromanipulator | Narzędzie | Narishige International | ||
| Mikrowstrzykiwacz | Narzędzie | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Wytwornik mikropipet | Narzędzie | Sutter Instrument Co. |
Bibliografia
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
