W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Lipidy są budulcem błon komórkowych, które pełnią funkcje barierowe oraz umożliwiają kompartymentację procesów komórkowych, a ostatnio uznano je również za istotne wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe. Jednak w przeciwieństwie do białek, lipidy są małymi cząsteczkami hydrofobowymi, które transportowane są głównie słabo opisanymi drogami niepęcherzykowymi, których występowania przypuszcza się w miejscach kontaktu błon (MCS). MCS to obszary, w których siateczka śródplazmatyczna (ER) nawiązuje bezpośredni kontakt fizyczny z organellum partnerskim, np. błoną plazmatyczną (PM). Fragment ER w miejscach kontaktu ER-PM jest wzbogacony w enzymy syntetyzujące lipidy, co sugeruje, że synteza lipidów jest kierowana do tych miejsc i wskazuje, że MCS są istotne dla transportu lipidów. Drożdże stanowią idealny model do badania MCS typu ER-PM ze względu na ich liczne występowanie (ponad 1000 kontaktów na komórkę) oraz konserwatywną naturę we wszystkich eukariotach. Identyfikacja białek tworzących MCS jest kluczowa dla zrozumienia, w jaki sposób odbywa się transport lipidów w komórkach oraz jak pełnią one rolę cząsteczek sygnałowych. Odkryliśmy, że białko ER o nazwie Scs2p lokalizuje się w MCS typu ER-PM i jest istotne dla ich powstawania. Skupiamy się na zidentyfikowaniu molekularnych partnerów Scs2p. Identyfikacja kompleksów białkowych opiera się tradycyjnie na wstępnym rozdziale oczyszczonych próbek białek metodą elektroforezy żelowej, a następnie na trawieniu pasm białkowych w żelu i analizie peptydów metodą spektrometrii mas. Często ogranicza to badanie do niewielkiej grupy białek. Ponadto kompleksy białkowe są narażone na warunki denaturujące lub niefizjologiczne podczas tej procedury. Aby uniknąć tych problemów, zastosowaliśmy wielkoskalową technikę proteomiki ilościowej w celu uzyskania nieobciążonych i skwantyfikowanych danych. Wykorzystujemy znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC), aby włączyć jądra izotopowe do białek w nieoznaczonej szczepie kontrolnej. Równe objętości hodowli oznaczonej i nieoznaczonej, znakowanej metodą SILAC, są mieszane, a następnie lizowane poprzez rozcieranie w ciekłym azocie. Następnie przeprowadzamy procedurę oczyszczania powinowactwa, aby wyizolować kompleksy białkowe. Na koniec wytrącamy próbkę białkową, która jest gotowa do analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Co najważniejsze, białka w szczepie kontrolnym są znakowane ciężkim izotopem, co powoduje przesunięcie stosunku masy do ładunku, które można skwantyfikować w odniesieniu do białek nieoznaczonych w szczepie z białkiem przynętą. Dzięki temu zanieczyszczenia lub niespecyficzne wiązania mogą być łatwo wyeliminowane. Stosując to podejście, zidentyfikowaliśmy kilka nowych białek lokalizujących się w MCS typu ER-PM. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy opis naszej metody.
Protokół
Materiały i metody
- Szczepy drożdży
- Wszystkie szczepy użyte w niniejszym badaniu oparto na tle BY4742. Szczep kontrolny SILAC (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 i arg4::G418) stworzono poprzez krzyżowanie szczepu z delecją arg4 (Mat a, his3, ura3, leu2 i arg4::G418) z BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 i lys2), a haploidy meiotyczne otrzymano w drodze sekcji tetrad. W związku z tym szczep kontrolny jest aukstrofem w odniesieniu do lizyny i argininy. Szczep z przynętą stworzono za pomocą homologicznej rekombinacji wspomaganej PCR z użyciem wektora pBS1479. Zastosowany w tym badaniu znacznik epitopowy to znacznik do tandemowej puryfikacji powinowactwa (TAP) (3).
- SILAC:
- Szczep kontrolny SILAC hodowano na minimalnej pożywce z pominięciem konkretnych składników (dropout media), uzupełnionej o 98% L-lizynę-4,4,5,5-D4 (0.03 g/L, Cambridge Isotope) oraz 98% L-argininę-13C6 (0.036 g/L, Cambridge Isotope).
- Szczep z przynętą hodowano na standardowej pożywce bogatej z normalnymi izotopowymi aminokwasami.
- Pierwszy etap puryfikacji TAP [Protokół ten został dostosowany z podręcznika kursu laboratoryjnego Cold Spring Harbor (4)]
**W noc poprzedzającą puryfikację schłodzić moździarz i tłuczek w zamrażarce -80°C. Należy również schłodzić zlew w temperaturze -20°C**
Przygotować poniższe bufory bezpośrednio przed użyciem (dla 1 L kultury):- 30 ml buforu NP-40 z 25 µl PIC (1/2000) oraz 50 µl 1M DTT
- 20 ml buforu NP-40 z 1/200 PIC oraz 50 µl 1M DTT
- 10 ml buforu TEV-C z 1/2000 PIC oraz 10 µl 1M DTT
SILAC i przygotowanie
- Hodować oddzielnie 1L szczepu przynęty (bait strain) oraz szczepu kontrolnego do OD600=1,0-1,3.
- Przenieść hodowlę do 500ml wirówek Nalgene. Zrównoważyć ładunek i odwirować komórki przy 2580X g.
- Zlać pożywkę i resuspendować osad w 50ml zimnej dH2O, przenosząc komórki do 50ml probówek wirówkowych. Odwirować komórki. **Osad można zamrozić w temperaturze -80°C**
- **Ważne:** dopasować ilość hodowli szczepu kontrolnego do hodowli szczepu przynęty w stosunku 1:1 według masy suchego osadu.
- Resuspendować każdy osad komórkowy w 10ml buforu NP-40 z dodatkiem 1/2 000 koktajlu inhibitorów proteaz (PIC).
- Wymieszać obie hodowle komórkowe, przelewając zawartość jednej probówki bezpośrednio do drugiej.
Rozcieranie
- Wlać ciekły N2 do schłodzonego wcześniej moździerza i pozwolić mu całkowicie odparować. Dodać do moździerza 2 ml komórek, wykonując ruchy okrężne. Wlać niewielką ilość ciekłego N2, aby zamrozić komórki. Rozcierać komórki, aż powstanie drobny proszek. Powtarzać proces do roztercia wszystkich komórek. **Nie dopuścić do rozmarzania komórek. W razie potrzeby dodawać ciekły N2**
- Przenieść proszek do lodowatego zlewka i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Gdy brzegi zaczną się rozmrażać, dodać 20 ml buforu NP-40 z 1/200 PIC.
- Przenieść surowy lizat do 40-ml probówek Nalgene. Wirować przy 39 000 xg przez 30 min.
- W czasie oczekiwania odmierzyć 300 μl kulek Sepharose 2B (GE). Przemyć kulki w 300 μl buforu NP-40 (1/2 000 PIC) trzykrotnie. Resuspendować kulki w 300 μl buforu, aby uzyskać zawiesinę 1:1.
Oczyszczanie wstępne lizatu komórkowego
- Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać kulki Sepharose 2B. Inkubować na platformie rotacyjnej w chłodni przez 30 min.
- W czasie oczekiwania odmierzyć 300 μl kulek IgG Sepharose 6 (GE). Przemyć kulki w 300 μl buforu NP-40 (1/2 000 PIC) trzykrotnie. Resuspendować kulki w 300 μl buforu, aby uzyskać zawiesinę 1:1.
- Odwirować kulki. Przenieść supernatant do nowej probówki. **Zachować alikwot lizatu komórkowego do późniejszego rozdzielczego Western blottingu**
Wiązanie do kulek IgG sepharose
- Usunąć kulki Sepharose 2B za pomocą wirowania. Dodać kulki IgG (przygotowane wcześniej jako zawiesina 1:1). Rozdzielić zawartość do dwóch probówek dla wydajniejszego wiązania. Inkubować na platformie rotacyjnej w chłodni przez 2 h.
- Odwirować kulki. **Zachować alikwot frakcji niewiązanej**
- Przemyć kulki 10 ml buforu NP-40 (1/2 000 PIC).
- Przemyć kulki 3 ml buforu TEV-C (1/2 000 PIC). **Zachować alikwot kulek. Pozwoli to ocenić wydajność wiązania**
Elucja z kulek IgG poprzez cięcie proteazą TEV
- Dodać 5 μl AcTEV do 1ml buforu TEV-C (z 1/2 000 PIC). Po wymieszaniu rozdzielić zawartość do dwóch probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml dla wydajniejszego mieszania. Inkubować na platformie rotacyjnej w chłodni przez noc.
- Odwirować kulki i przenieść eluat do nowej probówki 1,5-ml. Przemyć kulki dodatkowymi 0,5 ml buforu TEV-C.
- Połączyć eluaty w jednej probówce. Łączna objętość eluatu powinna wynosić 1,5 ml. **Zachować alikwot eluatu TEV**
Wytrącanie kwasem trichloroctowym (TCA) (do analiz opartych na spektrometrii mas zaleca się wytrącanie EtOH/octanowe)
- Dostosować stężenie alikwotów do 25% TCA za pomocą 100% TCA. W tym celu rozdzielić 1,5 ml eluatu do 2 probówek po 750 μl każda. Do każdej probówki dodać 250 μl 100% TCA. Roztwór powinien stać się mętny.
- Przechowywać na lodzie przez 30 min, okresowo mieszając w wortexie.
- Wirować z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w chłodni przez 30 min.
- Przemyć raz 500 μl lodowatego acetonu zawierającego 0,05 N HCl i wirować przez 5 min z maksymalną prędkością (chłodnia).
- Przemyć raz 500 μl lodowatego acetonu i wirować przez 5 min z maksymalną prędkością (chłodnia).
- Ostrożnie usunąć aceton i wysuszyć osad.
- Do barwienia srebrem resuspendować osad w 50 μl 1X buforu do próbek SDS.
Wytrącanie EtOH/octanowe
- Dodać 20 µg glikogenu.
- Rozcieńczyć próbki 5-krotnie 100% EtOH i dostosować stężenie do 50 mM NaCH3COO przy użyciu roztworu stokowego 2,5 M, pH 5,0.
- Pozostawić roztwór na 2 h.
- Wytrącone białko odwirować przez 10 min przy 12 000 X g w temperaturze pokojowej.
Bufor NP-40 (na 200 ml)
| Stężenie zapasu | Dodać | |
| Bufor fosforanowy sodu 10 mM (pH 7.2) | 0.1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0.1 mM Na3VO4 | 10 mM | 2 ml |
| Dopełnić objętość do 200 ml | ||
DODAĆ przed użyciem:
- 1/1 000 1 M DTT
- 1/2 000 PIC (koktajl inhibitorów proteaz)
Bufor TEV-C (na 50 ml)
| Stężenie roztworu zapasowego | Dodaj | |
| 25 mM Tris (pH 8.0) | 100 mM | 12.5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3.75 ml |
| 0.1 % NP-40 | 100 % | 50 _l |
| 0.5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| Dopełnić objętość do 50 ml | ||
Dodać przed użyciem:
- 1/1 000 1M DTT
- 1/2 000 PIC
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Alikwoty zachowane podczas procedury oczyszczania powinny obejmować (1) uprzednio oczyszczony lizat komórkowy, (2) frakcję związaną, (3) frakcję niezwiązaną oraz (4) frakcję eluentu. Zalecamy analizę zawartości białek w powyższych alikwotach za pomocą metody Western blotting z użyciem przeciwciała anty-TAP lub barwienia srebrem, aby ocenić wydajność wiązania i elucji w eksperymencie. Przykłady żelu barwionego srebrem oraz blotu przedstawiono na Rysunku 1.
Ponieważ metoda SILAC zapewnia nieobc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
