Identyfikacja kompleksów białkowych za pomocą proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Summary

Tutaj opisujemy nową ilościową technikę proteomiki do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwa, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby zidentyfikować z wysoką swoistością partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Abstract

Lipidy są budulcem błon komórkowych, które pełnią funkcję barier i w przedziałach procesów komórkowych, a ostatnio także jako ważne wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe. Jednak w przeciwieństwie do białek, lipidy są małymi cząsteczkami hydrofobowymi, które przemieszczają się głównie słabo opisanymi drogami niepęcherzykowymi, które przypuszczalnie występują w miejscach kontaktu z błoną (MCS). MCS to regiony, w których retikulum endoplazmatyczne (ER) nawiązuje bezpośredni kontakt fizyczny z organellą partnerującą, np. błoną plazmatyczną (PM). Część ER MCS ER-PM jest wzbogacona w enzymy syntetyzujące lipidy, co sugeruje, że synteza lipidów jest kierowana do tych miejsc i sugeruje, że MCS są ważne dla ruchu lipidów. Drożdże są idealnym modelem do badania MCS ER-PM ze względu na ich obfitość, z ponad 1000 kontaktów na komórkę, oraz ich zachowany charakter u wszystkich eukariontów. Odkrycie białek, które tworzą MCS, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób ruch lipidów odbywa się w komórkach i jak działają one jako cząsteczki sygnałowe. Odkryliśmy, że ER o nazwie Scs2p lokalizuje się na MCS ER-PM i jest ważny dla ich powstawania. Koncentrujemy się na odkryciu molekularnych partnerów Scs2p. Identyfikacja kompleksów białkowych tradycyjnie polega najpierw na rozdzieleniu oczyszczonych próbek białkowych za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie trawieniu prążków białkowych w żelu i analizie peptydów za pomocą spektrometrii mas. To często ogranicza badanie do niewielkiego podzbioru białek. Również kompleksy białkowe są narażone na warunki denaturujące lub niefizjologiczne podczas zabiegu. Aby obejść te problemy, wdrożyliśmy wielkoskalową technikę proteomiki ilościowej w celu wyodrębnienia bezstronnych i ilościowych danych. Używamy znakowania stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) w celu włączenia jąder izotopów zszywkowych do białek w nieoznakowanym szczepie kontrolnym. Równe objętości oznakowanej kultury i nieoznakowanej kultury znakowanej SILAC miesza się ze sobą i poddaje lizie przez mielenie w ciekłym azocie. Następnie przeprowadzamy procedurę oczyszczania powinowactwa w celu obniżenia kompleksów białkowych. Na koniec wytrąca się próbka białka, która jest gotowa do analizy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej / tandemowej spektrometrii mas. Co najważniejsze, białka w szczepie kontrolnym są znakowane ciężkim izotopem i wytwarzają przesunięcie masy / ładunku, które można określić ilościowo w stosunku do nieznakowanych białek w szczepie przynęty. Dzięki temu zanieczyszczenia lub niespecyficzne wiązania można łatwo wyeliminować. Stosując to podejście, zidentyfikowaliśmy kilka nowych białek, które lokalizują się w MCS ER-PM. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis naszego podejścia.

Protocol

Materiały i metody

1. Szczepy drożdży
   • Wszystkie szczepy użyte w tym badaniu są oparte na tle BY4742. Szczep kontrolny SILAC (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 i arg4::G418) został utworzony przez skrzyżowanie szczepu delecyjnego arg4 (Mat a, his3, ura3, leu2 i arg4::G418) do BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 i lys2), a haploidy mejotyczne uzyskano przez rozwarstwienie tetradowe. Dlatego szczep kontrolny jest auksotrofem dla lizyny i argininy. Szczep przynęty został stworzony przez rekombinację homologiczną za pośrednictwem PCR przy użyciu wektora pBS1479. Dlatego znacznikiem epitopu użytym w tym badaniu jest znacznik tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) (3).
2. SILAC:
   • Szczep kontrolny SILAC był hodowany w minimalnym pożywce dropout uzupełnionej 98% L-lizyną-4,4,5,5-D4 (0,03 g/L, izotop Cambridge) i 98% L-argininy-13 C ₆ (0,036 g/L, izotop Cambridge).
   • Szczep przynęty był uprawiany na zwykłym, bogatym podłożu z normalnymi aminokwasami izotopowymi.
3. Pierwszy etap oczyszczania TAP [Ten protokół jest zaadaptowany z podręcznika kursu laboratoryjnego Cold Spring Harbor (4)]
   
   **W noc przed oczyszczaniem wstępnie schłodź moździerz i tłuczek w zamrażarce o temperaturze -80°C. Zlewkę należy również schłodzić w temperaturze -20°C**
   
   Przygotuj te tuż przed użyciem (na 1 l kultury):
   • 30 ml buforu NP-40 z 25 μl (1/2000), 50 μl 1M DTT
   • 20 ml buforu NP-40 z 1/200, 50 μl 1M naziemnej telewizji cyfrowej
   • 10 ml buforu TEV-C z 1/2000, 10 μl 1 M naziemnej telewizji cyfrowej

SILAC i przygotowanie

1. Wyhoduj 1 litr każdego szczepu przynęty i szczepu kontrolnego osobno do OD₆₀₀ = 1,0-1,3.
2. Wlej kulturę do 500 ml probówek wirówkowych Nalgene. Zrównoważ ogniwa obciążeniowe i granulki przy 2580X g.
3. Zdekantować podłoże i ponownie zawiesić granulat z 50 ml zimnego dH₂O, przenosząc komórki do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Ogniwa na pelety. **Pellet można zamrozić w temperaturze -80°C**
4. **WAŻNE** Dopasuj kulturę szczepu kontrolnego do kultury szczepu przynęty w stosunku 1:1 według masy suchego granulatu.
5. Zawiesić każdą komórkę w 10 ml buforu NP-40 z 1//2,000 koktajlu inhibitorów proteazy ().
6. Wymieszaj dwie kultury komórkowe, bezpośrednio dekantując jedną probówkę do drugiej.
   
   Szlifowanie
   
   
7. Wlać płyn_N2 do wstępnie schłodzonej zaprawy i pozostawić do całkowitego odparowania. Dodać 2 ml komórek do zaprawy okrężnymi ruchami. Wlej trochę płynu N₂, aby zamrozić komórki. Zmiel komórki, aż zamienią się w drobny proszek. Powtarzaj proces, aż wszystkie komórki zostaną zmielone. **Nie pozwól, aby komórki się rozmroziły. W razie potrzeby dodać płyn N₂**
8. Przenieść proszek do lodowatej zlewki i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Gdy krawędzie zaczną się rozmrażać, dodać 20 ml buforu NP-40 z 1/200.
9. Przenieść surowy lizat do 40-mililitrowych probówek Nalgene. Wirowanie z prędkością 39000 xg przez 30 min.
10. Czekając, weź 300 μl kulek Sepharose 2B (GE). Umyj kulki w 300 μl buforu NP-40 (1/2 000) 3 razy. Ponownie zawiesić kulki w buforze 300 μl, tak aby znalazły się w gnojowicy 1:1.
    
    Wstępne oczyszczanie lizatu komórkowego
    
    
11. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać kulki Sepharose 2B. Inkubować na platformie obrotowej w chłodni przez 30 minut.
12. Czekając, weź 300 μl IgG Sepharose 6 kulek (GE). Umyj kulki w 300 μl buforu NP-40 (1/2 000) 3 razy. Ponownie zawiesić kulki w buforze 300 _l, tak aby znajdowały się w gnojowicy 1:1.
13. Granuluj koraliki. Przenieść supernatant do nowej probówki. **Zachowaj podwielokrotność lizatu komórkowego do późniejszego Western Blotting**
    
    Wiązanie z koralikami sefarozy IgG
    
    
14. Usuń kulki Sepharose 2B za pomocą wirówki. Dodać kulki IgG (wcześniej przygotowane w gnojowicy w proporcji 1:1). Podziel zawartość na dwie tuby, aby uzyskać bardziej wydajne wiązanie. Inkubować na obrotowej platformie w chłodni przez 2 godziny.
15. Zakręć koraliki. **Zapisz podwielokrotność frakcji niezwiązanej**
16. Płukać kulki 10 ml buforu NP-40 (1/2 000).
17. Umyj kulki 3 ml buforem TEV-C (1/2 000). **Zapisz porcję koralików. Będzie to odzwierciedlać skuteczność wiązania**
    
    Elucja z kulek IgG przez rozszczepienie proteazy TEV
    
    
18. Dodać 5 μl AcTEV do 1 ml buforu TEV-C (z 1/2 000). Po wymieszaniu rozdziel zawartość do dwóch probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać bardziej efektywne mieszanie. Inkubować na obrotowej platformie w chłodni przez noc.
19. Odkręć kulki i przenieś eluat do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki dodatkowymi 0,5 ml buforu TEV-C
20. Połącz elaut w jednej probówce. W sumie powinno być 1,5 ml eluatu. **Zachować podwielokrotność eluatu TEV**
    
    Cypatacja kwasu trichlorooctowego (TCA) (do analizy opartej na spektrometrii mas zalecamy stosowanie wytrącania EtOH/octanu)
    
    
21. Dostosuj podwielokrotności do 25% TCA z 100% TCA. W tym celu należy rozdzielić 1,5 ml eluatu na 2 probówki po 750 μl każda. Do probówki dodać 250 μl 100% TCA. Twój roztwór powinien zmienić kolor na mleczny.
22. Umieść na lodzie na 30 minut z okresowym wirowaniem.
23. Wirować z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w chłodni przez 30 minut.
24. Przemyć raz 500 μl lodowatego acetonu zawierającego 0,05 N HCl i wirować przez 5 minut z maksymalną prędkością (chłodnia).
25. Umyć raz 500 μl lodowatego acetonu i wirować przez maksymalnie 5 minut (w chłodni).
26. Ostrożnie usuń aceton i suchy granulek.
27. W przypadku barwienia srebrem należy ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu do próbek 1X SDS.
    
    EtOH/ precypatacja octanu
    
    
28. Dodać 20 μg glikogenu
29. Rozcieńczyć próbki 5X 100% EtOH i dostosować do 50 mM NaCH₃COO z 2,5 M zapasem, pH 5,0
30. Czekaj na rozwiązanie przez 2 godziny
31. Białko wytrącone w granulkach przez odwirowanie przez 10 minut przy 12 000 X g w temperaturze pokojowej.

NP-40 Bufor (na 200 ml)

  Koncentracja zapasów dodawać 10 mM bufor fosforanu sodu (pH 7,2) 0,1 mln Pojemność 20 ml 150 mM NaCl 2 mln Pojemność 15 ml 1% NP-40 W 100% Pojemność 2 ml 50 mM NaF 1 mln Pojemność 10 ml 0,1 mM na₃VO₄ 10 mM Pojemność 2 ml Objętość do 200 ml

DODAJ przed użyciem:

1. 1/1 000 z 1 m naziemnej telewizji cyfrowej
2. 1/2 000 (koktajl inhibitorów proteazy)

Bufor TEV-C (na 50 ml)

  Koncentracja zapasów dodawać 25 mM Tris (pH 8,0) 100 mM Pojemność 12,5 ml 150 mM NaCl 2 mln Pojemność 3,75 ml 0,1 % NP-40 100 % 50 _l 0,5 mM EDTA 500 mM 50 __l Objętość do 50 ml

DODAJ przed użyciem:

1. 1/1 000 naziemnej telewizji cyfrowej o długości 1 mln
2. 1/2 000

Discussion

Podwielokrotności zapisane podczas procedury oczyszczania powinny obejmować: (1) wstępnie oczyszczony lizat komórkowy, (2) frakcję związaną, (3) frakcję niezwiązaną i (4) frakcję eluowaną. Zalecamy analizę zawartości białka w powyższych podwielokrotnościach za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciał anty-TAP lub barwienia srebrem, aby odzwierciedlić skuteczność wiązania i elucji eksperymentu. Przykłady zabarwionego srebrem żelu i plamy pokazano na rysunku 1.

Ponieważ SILAC zapewnia nam be...