Pomiar rozciągania ściany komórkowej roślin (pełzania) indukowanego niskim pH oraz alfa-ekspansyną

Podsumowanie

Przedstawiamy zastosowanie ekstensometru o stałej sile do pomiaru długotrwałego wydłużenia (pełzania) próbek ścian komórkowych roślin wywołanego przez bufory kwasowe i białko ekspansynę.

Streszczenie

Ścianki komórkowe rosnących roślin charakteryzują się właściwością znaną jako „wzrost kwasowy” (acid growth), co oznacza, że są one bardziej rozciągliwe przy niskim pH (< 5) ¹. Hormon roślinny auksyna szybko stymuluje wydłużanie komórek w młodych łodygach i podobnych tkankach, przynajmniej częściowo poprzez mechanizm wzrostu kwasowego ^{2, 3}. Auksyna aktywuje pompę H⁺ w błonie plazmatycznej, co powoduje zakwaszenie roztworu w ścianie komórkowej. Zakwaszenie ściany aktywuje ekspansyny, które są endogennymi białkami rozluźniającymi ścianę komórkową ⁴, co sprawia, że ściana komórkowa ulega naprężeniom wywołanym turgorem komórki. W rezultacie komórka zaczyna się gwałtownie powiększać. Zjawisko „wzrostu kwasowego” można łatwo zmierzyć w izolowanych (nieżyjących) próbkach ścian komórkowych. Zdolność ścian komórkowych do rozciągania indukowanego kwasem nie jest jedynie wynikiem strukturalnego układu polisacharydów ściany komórkowej (np. pektyn), lecz zależy od aktywności ekspansyn ⁵. Ekspansyny nie wykazują znanej aktywności enzymatycznej, a jedynym sposobem na oznaczenie aktywności ekspansyn jest pomiar indukowania przez nie rozciągania ściany komórkowej. Niniejszy raport wideo szczegółowo opisuje źródła i techniki przygotowania odpowiednich materiałów ściennych do testów ekspansyn, a następnie prezentuje rozciąganie indukowane kwasem oraz rozciąganie indukowane ekspansynami w próbkach ścian przygotowanych z rosnących podkotylowych łodyżek ogórka.

Aby uzyskać odpowiednie próbki ścian komórkowych, siewki ogórka są hodowane w ciemności, a następnie ich podkotylony są odcinane i mrożone w temperaturze -80 °C. Zamrożone podkotylony są ścierane, spłaszczane, a następnie mocowane pod stałym napięciem w specjalnej kuwecie do pomiarów ekstensometrycznych. Aby zmierzyć rozciąganie indukowane kwasem, ściany są początkowo buforowane w neutralnym pH, co skutkuje niską aktywnością ekspansyn będących składnikami natywnych ścian komórkowych. Po wymianie buforu na taki o kwasowym pH ekspansyny zostają aktywowane, a ściany komórkowe gwałtownie się rozciągają. Wykazujemy również aktywność ekspansyn w teście rekonstytucyjnym. W tej części stosujemy krótką obróbkę termiczną w celu denaturacji natywnych ekspansyn w próbkach ścian komórkowych. Te dezaktywowane ściany komórkowe nie rozciągają się nawet w buforze kwasowym, jednak dodanie ekspansyn do ścian komórkowych szybko przywraca ich zdolność do rozciągania.

Protokół

Część 1: Hodowla i przechowywanie odpowiedniego materiału roślinnego

1. Z naszego doświadczenia wynika, że młode podkiełkowie z etiolowanych siewek ogórka stanowią wygodne źródło materiału ścian komórkowych do tych eksperymentów. Nasiona ogórka wysiewa się na mokry papier w świetłoszczelnym pudełku, które umieszcza się w ciemnej szafce w pomieszczeniu o stałej temperaturze ustawionej na 26 °C. Dokładna temperatura nie jest krytyczna, gdyż jakakolwiek wartość między 22° a 30 °C powinna być odpowiednia, jednak temperatura ta determinuje szybkość osiągania przez siewki właściwego stadium rozwoju. Im wyższa temperatura, tym szybciej siewki będą rosnąć. Zazwyczaj wykorzystujemy siewki, gdy osiągną one długość około 5 cm, co następuje 3-4 dni po wysiewie. Ważne jest, aby siewki rosły w ciemności, ponieważ nawet niewielkie ilości światła wpływają zarówno na tempo rozwoju siewek, jak i na właściwości ścian komórkowych, które mierzymy za pomocą tej techniki. W 3. dniu można zajrzeć do pudełka, używając słabego światła z zielonym filtrem, aby sprawdzić stopień rozwoju siewek.
2. Siewki należy szybko odciąć, zapakować do małych plastikowych pudełek (100-150 siewek na pudełko) i przechowywać w temperaturze -80 °C. W tej temperaturze pozostają one użyteczne przez wiele tygodni.

Część 2: Przygotowanie próbek ścian komórkowych

1. Małe grupy (8-10) zamrożonych, przeciętych siewek przenosi się z zamrażarki do izolowanego pojemnika zawierającego wkład chłodzący do zamrażarki -80°C.
2. Kutikula pokrywająca podkiełkusz jest ścierana karborundem. Wykonuje się to poprzez wielokrotne przeciąganie podkiełkusza między kciukiem a palcem wskazującym, które są pokryte gęstą zawiesiną mokrego proszku karborundowego. Wymaga to pewnego doświadczenia, aby dobrać odpowiednią siłę nacisku: zbyt duży nacisk spowoduje poszarpanie i rozerwanie warstwy epidermy, natomiast zbyt mały sprawi, że kutikula nie zostanie przepuszczalna. Należy również pracować szybko, ponieważ zamrożony podkiełkusz podczas rozmrażania staje się wiotki i trudny w manipulacji.
3. Ścierany podkiełkusz zanurza się w lodowatej wodzie, aby usunąć większość przylegającego karborundu, a następnie przechowuje w lodowatej wodzie, podczas gdy pozostałe podkiełkusze przygotowuje się w podobny sposób.
4. Podkiełkusze przycina się do pożądanej długości, zazwyczaj 1,2 cm, nowym jednostronnym ostrzem brzytwy, a następnie układa się je równolegle na szkiełku przedmiotowym.
5. Następnie należy spłaszczyć ściany, aby usunąć sok komórkowy i ułatwić zaciskanie. Drugie szkiełko przedmiotowe kładzie się na wierzchu grupy 8-10 próbek, tworząc kanapkę. Na szkiełku kładzie się obciążnik (400-500 g) na 5 min. Jako obciążnika rutynowo używamy zlewki zawierającej odpowiednią ilość wody.
6. Krok opcjonalny: W zależności od eksperymentu, podkiełkusze można w tym momencie inaktywować za pomocą krótkiej obróbki termicznej. Aby to zrobić, związujemy szkiełka przedmiotowe gumkami recepturkami, umieszczamy zestaw w pojemniku z 100 mL zdejonizowanej wody w temperaturze pokojowej i wkładamy do kuchenki mikrofalowej na pełnej mocy. W przypadku naszej kuchenki woda zaczyna wrzeć po około 50 s i wyłączamy urządzenie 15 s po rozpoczęciu wrzenia. Gorącą wodę szybko wylewa się i zastępuje zimną wodą, aby zatrzymać denaturację. Może być konieczna zmiana tych czasów, ponieważ Państwa kuchenka mikrofalowa może różnić się od naszej. Przy nadmiernym ogrzewaniu próbki stają się słabe i łatwo pękają. Przy niewystarczającym ogrzewaniu endogenna ekspansyna nie zostaje inaktywowana, a próbki ścian zachowują pewną reaktywność na niskie pH.

Część 3: Konfiguracja ekstensometru

1. Próbki ścian komórkowych są teraz zaciskane w ekstensometrze o stałej sile. Jest to urządzenie zbudowane na zamówienie, które składa się z kuwety z Pleksiglasu do utrzymywania podstawowego końca próbki ściany oraz ruchomego zacisku przymocowanego do końca wierzchołkowego próbki. Ruchomy zacisk jest zamontowany na końcu pręta, który przechodzi przez otwarte cewki czujnika położenia LVDT (Linear Variable Differential Transformer), który elektronicznie wykrywa położenie małego metalowego cylindra, tzw. rdzenia, przymocowanego do pręta. Górny koniec pręta jest połączony z dźwignią z regulowanym przeciwwagą. Dźwignia ta wywiera regulowaną siłę skierowaną w górę na próbkę ściany. Siłę reguluje się poprzez dodawanie lub usuwanie skalibrowanych ciężarków metalowych z przeciwległego końca dźwigni.
2. Wracając do próbki ściany – podstawowy koniec próbki podkotylonu chwyta się precyzyjną pincetą, a ~2-3 mm końca wierzchołkowego umieszcza się pomiędzy otwartymi szczękami ruchomego zacisku. Zacisk ten jest sprężynowym zaciskiem typu krokodylk, którego metalowe szczęki są pokryte plastikiem, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi metalowej powierzchni z roztworem buforowym lub próbką ściany. Z naszego doświadczenia wynika, że jony metali mogą wymywać się z zacisku i hamować zdolność ściany do rozciągania, dlatego metal pozostaje zakryty.
3. Trzymając zespół ruchomego zacisku w jednej ręce, podstawowy koniec próbki ściany manewruje się pomiędzy dwiema zawiasowymi częściami kuwety z Pleksiglasu, a następnie części kuwety zbliża się do siebie i mocno przykręca, blokując tym samym dolny koniec próbki ściany w kuwecie.
4. Zespół ruchomego zacisku jest teraz delikatnie zwalniany, co pozwala na przekazanie pełnej siły przeciwwag na próbkę ściany. W przypadku próbek ścian przygotowanych z podkotylonów ogórka rutynowo stosujemy całkowitą przeciwwagę 20 g. Inne materiały ściany lub eksperymenty mogą wymagać zastosowania innych ciężarów.
5. Kuwetę wypełnia się buforem (200 µL), a położenie kuwety przesuwa się w górę lub w dół za pomocą śruby regulacyjnej tak, aby ruchomy zacisk znalazł się w dolnym zakresie pomiarowym LVDT. Nasz LVDT jest podłączony do jednostki akwizycji danych mikrokomputera, dzięki czemu monitorujemy położenie LVDT za pomocą komputera. Mamy osiem zespołów LVDT podłączonych równolegle do jednego komputera, co pozwala nam na jednoczesne badanie 8 próbek ścian. Komputer rejestruje położenie każdego z zespołów LVDT co 30 s.

Część 4: Pomiar odpowiedzi rozciągania na niskie pH lub ekspansynę – reprezentatywne wyniki

1. [Pierwszy eksperyment] W celu pomiaru rozciągania indukowanego kwasem rozpoczynamy od natywnych próbek ścian komórkowych (tj. nieinaktywowanych termicznie) i do kuwety dodajemy bufor obojętny. Próbki ścian rozciągają się przez kilka minut w odpowiedzi na przyłożone naprężenie, jednak po kilku minutach tempo rozciągania spada do niskiej wartości. Nasz komputer pozwala monitorować albo zmianę długości próbki (tj. zmianę pozycji ruchomego zacisku po rozpoczęciu eksperymentu), albo pochodną czasu pozycji, innymi słowy tempo rozciągania. Tempo rozciągania stabilizuje się z czasem na niskim poziomie.
2. Po około 20 min bufor obojętny jest usuwany. Używamy do tego cienkiej metalowej rurki wykonanej z igły hipodermicznej o dużym rozmiarze, podłączonej do pompy próżniowej, aby szybko usunąć bufor przy minimalnym zakłóceniu ściany lub zespołu mechanicznego. Następnie dodaje się bufor kwasowy, czasami wykonując 1-2 szybkie wymiany, aby zapewnić całkowite przejście na bufor kwasowy. Następnie obserwujemy reakcję ściany. Zazwyczaj szybsze tempo rozciągania można wykryć w ciągu kilku minut. Po 60 min dysponujemy zazwyczaj wystarczającymi informacjami do oceny odpowiedzi w postaci rozciągania, choć w niektórych przypadkach pomiary mogą trwać dłużej.
3. [Drugi eksperyment] W celu pomiaru rozciągania ściany komórkowej indukowanego przez ekspansynę rozpoczynamy od próbek ścian inaktywowanych termicznie i do kuwety dodajemy bufor kwasowy. Podobnie jak w Pierwszym eksperymencie, tempo rozciągania ściany komórkowej stopniowo stabilizuje się na niskim poziomie ze względu na brak funkcjonalnej ekspansyny.
4. Po około 20 min do kuwety dodaje się białko ekspansyny poprzez „spikowanie” buforu w kuwecie 10-20 µL roztworu ekspansyny. Ekspansyna szybko przenika do próbki ściany komórkowej i w ciągu kilku minut zauważamy wzrost tempa rozciągania. Tę odpowiedź rozciągania można monitorować przez godzinę lub dłużej.

Rysunek 1: Schemat procedur przygotowania ścian komórkowych w celu oceny rozciągania ścian indukowanego kwasem lub ekspansyną.

Dyskusja

W tej demonstracji wykorzystaliśmy ściany komórkowe z podkotylowych części pędów ogórka, ponieważ okazały się one niezawodnym źródłem próbek ścian, które są łatwe w obróbce i wykazują wysoką czułość. Odnieśliśmy również sukcesy w przypadku ścian z innych siewek, a także materiałów dostępnych w supermarketach, takich jak młode liście szpinaku i łodygi selera naciowego. W zasadzie młode, miękkie i szybko rosnące tkanki roślinne prawdopodobnie będą łatwe do pomiaru za pomocą tej techniki, natomiast tkanki twarde, stare, utl...