Kojenie i separacja tetrad Chlamydomonas reinhardtii do analizy genetycznej

Podsumowanie

Kopulacja i separacja tetrad są niezbędne do analizy genetycznej Chlamydomonas reinhardtii. W niniejszym materiale prezentujemy standardowe metody gametogenezy, kopulacji, kiełkowania zygot oraz sekcji tetrad. Niniejszy protokół składa się z serii łatwych do wykonania kroków, które ułatwią zastosowanie metod genetycznych naukowcom mniej zaznajomionym z Chlamydomonas.

Streszczenie

Jednokomórkowa zielona glonaChlamydomonas reinhardtiiEmpty source. No content to translate.Chlamydomonas) stał się popularnym organizmem w badaniach nad różnymi obszarami biologii komórki i genetyki ze względu na prosty cykl życiowy, łatwość hodowli i manipulacji w analizach genetycznych, zasoby genomiczne oraz możliwość transformacji jądra i obu organelli. Krzyżowanie szczepów jest powszechną praktyką podczas stosowania podejść genetycznych wChlamydomonas, aby stworzyć wegetatywne diploidy do analizy dominacji, po sekcji tetrad w celu ustalenia dziedziczenia jądrowego w stosunku do organellarnego, do testowania allelizmu, analizy epistazy lub generowania populacji na potrzeby klonowania opartego na mapowaniu. Dodatkowo krzyżówki genetyczne są rutynowo wykorzystywane do łączenia genotypów organellarnych z konkretnymi genotypami jądrowymi. W niniejszej pracy prezentujemy standardowe metody gametogenezy, zapłodnienia, kiełkowania zygot i separacji tetrad. Niniejszy protokół składa się z łatwej do śledzenia serii kroków, które udostępnią podejścia genetyczne naukowcom mniej zaznajomionym zChlamydomonasWyjaśniono kluczowe parametry oraz potencjalne problemy. Na koniec przedstawiono źródła dalszych informacji oraz alternatywne metody.

Protokół

Część 1: Przygotowanie szczepów do gametogenezy

Uwaga: Wszystkie manipulacje należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Wyższe lub niższe temperatury wpływają na szybkość kiełkowania zygot i mogą negatywnie oddziaływać na ich żywotność.
Ważna uwaga: Niezbędne jest, aby szczepy przeznaczone do krzyżowania rozwijały się intensywnie i były wolne od zanieczyszczeń grzybami lub bakteriami. Jeśli szczepy nie były regularnie przenoszone, przed generowaniem gamet należy przeprowadzić pasaż na medium bogatym.

1. Szczepy do krzyżowania przenosi się na płytki TAP (100×15 mm), po 1-2 szczepy na płytkę. Komórki powinny być hodowane w formie skoncentrowanego paska o szerokości około 1 cm.
2. Inkubację na płytkach TAP należy kontynuować do momentu uzyskania grubej warstwy intensywnie rosnących komórek, w razie potrzeby wykonując przesiewy pośrednie. Szczepy, które nie były ostatnio przesiewane, mogą wymagać jednego przesiewu i łącznie 1 tygodnia hodowli, natomiast szczepy typu dzikiego będące w regularnym użyciu mogą wymagać jedynie kilku dni i żadnych przesiewów. Mutanty wrażliwe na światło mogą wymagać dodatkowego czasu.
3. Wszystkie komórki z płytek TAP przenosi się na płytki N10, które są ubogą w azot i będą indukowane do gametogenezy. Komórki należy przenieść w formie grubego bloku, podobnie jak występowały na płytce TAP. Ułatwi to późniejszą zbiórkę komórek. Po 3 dniach na N10 komórki są przygotowane do przejścia gametogenezy. Podziały komórkowe na N10 będą przebiegać powoli, jednak komórki powinny zachować ciemnozielony kolor. Wszelkie zanieczyszczone szczepy należy odrzucić, ponieważ nie uzyskamy z nich żywotnych zygot.

Część 2: Kopulacja

1. Każdy szczep przenosi się do kolby Erlenmeyera o pojemności 50 ml i resuspenderuje w około 2,5 ml sterylnej wody destylowanej. Można to zrobić za pomocą pętlki drutowej lub sterylnego patyczka; ważne jest, aby komórki były dobrze zawieszone i nie tworzyły grudek. Dokładną objętość wody należy dostosować tak, aby stężenie komórek, oceniane wizualnie, było zbliżone dla każdego szczepu.
2. Komórki poddaje się wytrząsaniu pod silnym światłem (1.260 μE/m²/sec) przez 2 godziny, w czasie czego komórki przekształcą się w ruchliwe gamety. Ruchliwość należy sprawdzić pod mikroskopem świetlnym. Jeśli gamety słabo pływają, zapłodnienie prawdopodobnie będzie mało wydajne. Jednak nawet szczepy o słabej ruchliwości będą się krzyżować z obniżoną częstotliwością.
3. Następnie równe objętości gamet mt+ i mt- łączy się w jednej kolbie 50 ml. Gamety pozostawia się pod silnym światłem (1.260 μE/m²/sec) bez wytrząsania.
4. Przebieg zapłodnienia można sprawdzić natychmiast pod mikroskopem świetlnym. Pary gamet tworzą się szybko i będą widoczne jako szybko poruszające się komórki połączone w obrębie wici. Jeśli zapłodnienie wydaje się przebiegać bardzo szybko, próbki do generowania zygot należy pobrać w ciągu 30 min - 1 h. W przeciwnym razie przebieg zapłodnienia można sprawdzać co godzinę, choć jest to opcjonalne. Ponieważ czas uzyskania optymalnej gęstości zygot znacznie różni się w zależności od krzyżówek, najlepiej pobierać alikwoty mieszaniny zapładniającej w różnych odstępach czasu po połączeniu gamet, np. po 1 h, 2 h, 3 h i 4 h. Robi się to poprzez przeniesienie próbek o objętości 300 µL na płytki z agarem TAP-3% Difco 60×15 mm; 3-4 kropki na płytkę. Należy uważać, aby nie wytrząsać mieszaniny zapładniającej, ponieważ może to rozbić pary zapładniające się. Stosuje się agar Difco, ponieważ zawiera on mniej zanieczyszczeń niż tańsze agary, co ułatwia obserwację zygot pod mikroskopem.
   Niewykorzystaną mieszaninę zapładniającą można pozostawić w kolbie na noc, a jakość reakcji zapłodnienia będzie oczywista następnego dnia. Gdy zapłodnienie jest wydajne, zygoty przylegają do ścianek lub dna kolby, a medium staje się klarowne. Nawet wytrząsanie kolby nie spowoduje oderwania zygot. Jeśli po energicznym wytrząsaniu mieszaniny nic nie przylega do szkła, oznacza to, że zapłodnienie było niewydajne lub nie nastąpiło.
5. Płytki TAP-Difco zawierające mieszaninę zapładniającą suszy się w sterylnej komorze z uchylonymi pokrywkami, aż do momentu wchłonięcia cieczy z powierzchni. Płytki zazwyczaj pozostawia się na świetle (700 nE/m²/sec) przez 18 godzin, a następnie owija folią, ponieważ dojrzewanie zygospor zachodzi wyłącznie w ciemności. Na płytkach i folii zapisuje się skrzyżowane szczepy, czas i datę zapłodnienia. Płytki przechowuje się od 5 do 7 dni; mogą być przechowywane dłużej, choć wydajność kiełkowania zygot stopniowo spada.

Część 3: Disekcja tetrad

1. Komórki wegetatywne należy zeskrobać z wyschniętych plam mieszaniny kopulacyjnej za pomocą tępego ostrza, np. skalpela. Ostrze można wykorzystać do odsłonięcia obszaru z zygotami, które przylegają ściśle do 3% agaru. Ten etap wykonuje się zazwyczaj po południu, aby zygoty zdążyły wykiełkować do następnego ranka, ale nie przeszły drugiego podziału wegetatywnego, który doprowadziłby do powstania 8 potomnych. Biolodzy badający Chlamydomonas szybko uczą się rozpoznawać zygoty pod mikroskopem, ponieważ są one większe od komórek wegetatywnych i posiadają grubą ścianę zygospory, która tworzy czarny kontur. Zygospory często wydają się żółte, ale mogą być również nieco zielone. Najważniejszą cechą jest to, że przylegają one do agaru, podczas gdy komórki wegetatywne łatwo przesunąć. Jednakże, jeśli płytki są zbyt suche, tak nie będzie. Ponadto, jeśli mieszanina kopulacyjna była zbyt gęsta, zygoty mogą utworzyć matę, co utrudni lub uniemożliwi transfer pojedynczych zygot. Odpowiednie zagęszczenia ustala się w kroku 2.1 i nabywa się wprawy w ich określaniu wraz z doświadczeniem.
2. Przygotowuje się szklane igły do zbierania zygot i rozdzielania potomnych tetrad. Przygotowuje się je poprzez wyciąganie 3 mm szklanych prętów w niewielkim płomieniu w celu utworzenia długiej, cienkiej nici, którą można odłamać. Końcówki tych zwężających się końców wygładza się lub wygina w haczyki poprzez krótkie podgrzanie w niskim płomieniu (np. alkoholowym lub z zapalonej zapałki). Należy przygotować 3 lub więcej szklanych igieł, ponieważ dość łatwo pękają, szczególnie w przypadku niedoświadczonych użytkowników.
3. Zygoty zbiera się z 3% płytki TAP-Difco za pomocą szklanej igły w małą kupkę. Wycina się za pomocą tępego skalpela kwadrat agaru (do 0,5 cm²) zawierający zygoty. Następnie blok agaru kładzie się stroną skierowaną w dół na 15 mm płytce 1,5% TAP-Difco i przesuwa wzdłuż poziomej linii około 1,5 cm od górnej krawędzi płytki, aby rozmieścić zygoty. Na tylnej stronie płytek wycina się górną linię poziomą oraz siatkę o odstępach poziomych około 1,5 cm i pionowych około 0,5 cm. Siatka posłuży następnego dnia jako prowadnica do rozdzielania potomnych tetrad (siatkę można wyciąć również w dniu sekcji). Na koniec pojedyncze zygoty przenosi się do punktów przecięcia górnej linii poziomej z każdą linią pionową, rozmieszczając około 20-30 zygot na płytce. Chociaż sekcję przeprowadza się tylko dla około 12 z nich, nie każda zygota kiełkuje, a niektóre podzielą się dwukrotnie przed pęknięciem, dlatego potrzebne są dodatkowe zygoty.
4. Po rozmieszczeniu zygot, komórki wegetatywne, które zostały przypadkowo przeniesione z 3% płytki agarowej, zabija się, wystawiając odwróconą płytkę na 30 sekund nad szklane naczynie zawierające cienką (1-2 mm) warstwę chloroformu. Odległość między płytką a chloroformem powinna wynosić około 5 cm. Jeśli użyje się zbyt dużo chloroformu lub jeśli odległość będzie zbyt mała bądź zbyt duża, istnieje ryzyko zabicia zygot lub niezdobycia skuteczności w zabiciu komórek wegetatywnych. Zabieg z użyciem chloroformu musi zostać wykonany natychmiast po rozmieszczeniu zygospor na płytce do kiełkowania, aby zapewnić selektywność.
5. Kiełkowanie trwa od 16 do 20 godzin dla większości szczepów, ale czas ten różni się w zależności od genotypu i wieku zygot. Do kiełkowania płytki umieszcza się w słabym świetle (239 nE/m²/sec) lub w średnim świetle przyciemnionym poprzez przykrycie płytki chusteczką.
6. Wykiełkowane zygoty można zidentyfikować pod mikroskopem jako spuchnięte lub czasami pęknięte komórki z komórkami potomnymi wewnątrz. Jeśli zygospora nie pękła, delikatne dotknięcie szklaną igłą spowoduje przerwanie ściany, o ile nastąpiło kiełkowanie. Komórki potomne są delikatnie przeciągane do punktów siatki poniżej zygoty. Najłatwiej zrobić to, przechwyciwszy komórkę w niewielkiej ilości ciekłego medium uwolnionego z agaru pod naciskiem szklanej igły i przeciągając tę „kałużę” za igłą. Formą „zapewnienia”, że przeprowadzono sekcję zygoty, a nie dwa razy podzielonej komórki wegetatywnej, jest fakt, że oprócz czterech komórek potomnych pozostanie „skóra” ściany zygospory.
7. Rozdzielone potomstwo hoduje się w odpowiednich warunkach, aż do momentu, gdy widoczne kolonie będzie można pobrać do dalszych analiz. Płytki należy codziennie monitorować pod kątem kontaminacji.

Uwaga: Generowanie diploidów wegetatywnych nie jest tutaj omawiane, ale w zasadzie polega na wysianiu mieszaniny kopulacyjnej na podłożu, które nie będzie wspierać wzrostu żadnego ze szczepów rodzicielskich, ale będzie wspierać wzrost diploida (np. dwa różne markery aukstotroficzne). Płytki przechowuje się w świetle, aby uniknąć powstawania zygot.

Dyskusja

Analiza genetyczna u Chlamydomonas jest prosta, jednak wymaga ona zastosowania szczególnych technik w celu generowania gamet i rozdzielania potomstwa tetrad. W przypadku zdrowych szczepów techniki te są łatwe do opanowania. Przy niektórych szczepach mutantów staje się to bardziej sztuką i czytelnicy powinni zapoznać się z tomem 1 niedawno opublikowanego Chlamydomonas Sourcebook w celu uzyskania informacji historycznych i praktycznych wskazówek. Dodatkowo należy zaznaczyć, że istnieje wiele wariantów pod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CC-125	Szczep typu zapłodnienia plus	Chlamydomonas Stock Center
CC-124	Szczep typu zapłodnienia minus	Chlamydomonas Stock Center
Tris-Acetate-Phosphate (TAP)	Pożywka wzrostowa
N10	Pożywka wzrostowa
Agar Difco	Odczynnik
Stalowe ostrza Fisherbrand	Narzędzia	Fisher Scientific	08-916-5B
Rączki do skalpela BD	Narzędzia	Fisher Scientific	08-914-5
Metalowe skalpele Fisherbrand	Narzędzia	Fisher Scientific	08-920A