Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Podsumowanie

Opisano protokół systemu hodowli agregatów embrionalnego mózgu szczura. Wielopotencjalne komórki progenitorowe w agregatach mogą rozwijać się i różnicować w neurony, astrocyty oraz oligodendrocyty.

Streszczenie

System in vitro, który odtwarza proces rozwoju i różnicowania się progenitorów w dojrzałe neurony i glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), stanowiłby potężną platformę dla neuronaukowców do badania interakcji aksonalno-glejowych, właściwości i różnicowania multipotencjalnych progenitorów oraz progresji komórek linii oligodendroglialnej na poziomie komórkowym i molekularnym. Opisujemy tutaj system hodowli agregatów OUN z przedmózgowia embrionalnego szczura, który może być utrzymywany w medium bezsurowiczym do 3–4 tygodni i jest wykorzystywany w naszym laboratorium jako model do badania interakcji neuron-glej oraz mielinizacji w OUN. Ten materiał wideo zademonstruje, jak izolować i hodować te kultury agregatów OUN z mózgu szczura w 16. dniu embrionalnym (E16). Ponadto, z tej samej dyssekcji mózgu można łatwo uzyskać wysoce wzbogacone, klasyczne dysocjowane kultury neuronalne, które mogą być wykorzystywane w różnorodnych badaniach nad neuronami OUN lub w kokulturach z innymi komórkami.

Protokół

Przygotowanie przed sekcją

Narzędzia chirurgiczne: wysterylizować wszystkie nożyczki do sekcji i pincety w autoklawie

Czyszczenie szkiełek nakrywkowych:

1. Namoczyć wszystkie szkiełka nakrywki (o średnicy 15mm do płytki 24-dołkowej) w zlewce o pojemności 1L w 33% HCl przez co najmniej 24 h
2. Myć pod bieżącą wodą przez 10 min, okazjonalnie potrząsając, aby usunąć resztki HCl
3. Opłukać wodą z systemu Millipore
4. Odlać wodę
5. Namoczyć szkiełka nakrywki w 95-98% etanolu
6. Przenieść szkiełka nakrywki na czystą chusteczkę na płaskiej powierzchni i pozostawić do wyschnięcia
7. Przenieść szkiełka nakrywki do zlewki, przykryć folią aluminiową i wysterylizować w autoklawie
   Uwaga: Szkiełka nakrywki można na tym etapie przechowywać
8. Umieścić poszczególne szkiełka nakrywki w płytkach hodowlanych. Są one gotowe do powlekania

Powlekanie szkiełek podstawowych:

1. Rozcieńczyć 100-krotny roztwór zapasowy poli-D-lizyny (PDL, 10 mg/ml w 0,5% albuminie surowicy bydlęcej w PBS, przechowywany w aliquotach w temperaturze -20°C) za pomocą PBS i wysterylizować przez filtr (0,22 μm)
2. Pokryć szkiełka podstawowe 1-krotnym roztworem PDL (~ 0,15 ml/cm²) na 2 h w temperaturze 37°C w inkubatorze
3. Usunąć roztwór PDL, wypłukać 3 razy sterylną wodą ddH₂O i całkowicie wysuszyć szkiełka podstawkowe

Uwaga: Należy pokryć odpowiednią liczbę szkiełek nakrywkowych/płytek dla każdej sekcji. Szkiełka nakrywkowe pokryte PDL mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze 4°C.

Pożywki i roztwory

Pożywka do sekcji (DM): Należy użyć sterylnego, schłodzonego do temperatury lodu zrównoważonego roztworu soli Hanksa (bez Ca²⁺, Mg²⁺) (HBSS, Invitrogen 14175) uzupełnionego o 10 mM HEPES (Invitrogen 15630).

Pożywka do hodowli agregatów: Pożywka DMEM/NBB27 zawiera DMEM/Neurobasal (1:1 vol:vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM pirogronianu sodu, 0,75mM GlutaMAX, 60μg/ml N-acetylocysteiny, 5 μg/ml insuliny, 10nM d-biotyny oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Aby przygotować 100 ml pożywki do hodowli agregatów, wymieszać 50 ml DMEM (bez pirogronianu/glutaminy, Invitrogen 11960), 50 ml pożywki Neurobasal (Invitrogen 211034), 375 μl GlutaMax (100 x, Invitrogen 35050), 5,5 mg pirogronianu sodu (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17504), 6,3 mg N-acetylocysteiny (Sigma A8199), 1 ml roztworu Sato (stok 100 x, patrz poniżej), 25 μl roztworu d-biotyny (stok 4000 x, 40 μM w PBS, przechowywany w aliquotach w -20°C, Sigma B4639), 100 μl insuliny (stok 1000 x, 5 mg/ml w 0,01N HCl, przechowywany w aliquotach w -20°C, Sigma 16634) oraz 1 ml penicyliny/streptomycyny (stok 100 x, Invitrogen 15140), a następnie wysterylizować przez filtr i przechowywać w 4°C.

Roztwór zapasowy Sato 100x: Aby przygotować 40 ml roztworu zapasowego: zmieszać 40 ml medium Neurobasal z 400 mg apo-transferyny (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 μl progesteronu (25 mg/ml w etanolu, przechowywanego w alikwotach w temperaturze -20°C, Sigma P8783), 64 mg putrescyny (Sigma P7505) oraz 40 μl selenianu sodu (30 μM w PBS, przechowywanego w alikwotach w temperaturze -20°C, Sigma S5261). Roztwór zapasowy Sato poddać sterylizacji przez filtrowanie i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C.

Pożywka do wysiewu neuronów (PM): pożywka Neurobasal, 2% B27, 2mM glutaminy (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C, Invitrogen 25030), 25μM kwasu glutaminowego (stok 100, alikwoty przechowywane w -20°C) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.

Pożywka do hodowli neuronów (CM): Pożywka Neurobasal, 2% B27, 2mM glutaminy (stok 100x, aliquoty przechowywane w -20°C) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.

Zapas 5-FdU: roztwór stokowy 100x, 1mM 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (Sigma F0503) i 1mM urydyny (Sigma U3003) w podłożu Neurobasal. Sterylizowany przez filtr i przechowywany w alikwotach w temperaturze -20°C.

Roztwór trawiący z papainą (przygotować bezpośrednio przed sekcją):

1. Rozpuścić 3,2 mg L-Cysteiny (Sigma C-7352) w 4ml DM
2. Dostosować pH do poziomu około 7,4 za pomocą 1N NaOH (sprawdzić za pomocą pasków pomiarowych pH) i umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C
   Uwaga: Kolejny krok należy wykonać bezpośrednio przed trawieniem tkanek (patrz poniżej).
3. Dodać papainę do końcowego stężenia 20 unit/ml
4. Przefiltrować w celu sterylizacji (0,22mm) i umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C

Roztwór inhibitora trypsyny (przygotować na świeżo przed sekcją):

1. Rozpuścić 0,2 g inhibitora trypsyny (Sigma T7295) w 20ml DM
2. Sprawdzić pH i dostosować pH do wartości ~7,4 za pomocą 1 N NaOH
3. Przefiltrować w celu sterylizacji i umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C

Disekcja mózgu

Przygotowanie:

• Sterylna pęseta i nożyczki
• 70% etanol
• Czysty papier do tkanek i podkład chłonny na blacie
• Szalki Petriego o średnicy 10 cm z lodowatym DM dla macicy i płodu na blacie
• Platforma z lodem przy mikroskopie sekcyjnym
• 2-3 szalki o średnicy 6 cm z DM na lodzie
• Ciepłe PM w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C

1. Uśmierć ciężarną szczurzycę linii Sprague-Dawley (E16) zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Instytucjonalną Komisję Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC)
2. Połóż szczurzycę na podkładzie chłonnym i spryskaj alkoholowym roztworem obszar brzucha
3. Używając pęsety, przytrzymaj skórę brzucha i za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery V, przecinając jedynie skórę
4. Rozchyl skórę i użyj kolejnej sterylnej pęsety oraz nożyczek, aby przeciąć warstwę mięśniową
5. Wyjmij łańcuch pęcherzy płodowych i przenieś je do naczynia o średnicy 10 cm zawierającego lodowaty DM
6. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji ostrożnie wyjmij każdy embrion z pęcherza, a następnie wyjmij mózg z każdego embrionu i umieść uwolnione mózgi w czystym naczyniu o średnicy 10 cm z DM na platformie z lodem
7. W komorze z laminarnym przepływem powietrza i pod mikroskopem lupy usuń sekcje śródmózgowia/tylnomózgowia; za pomocą precyzyjnej pęsety usuń opony mózgowe, a następnie przenieś oczyszczoną korę/hipokamp do nowego naczynia o średnicy 6 cm z DM na wkładzie chłodzącym
   Uwaga: na tym etapie tkanka jest gotowa do trawienia enzymatycznego.
8. Przygotuj roztwór papainy i inhibitora trypsyny, a następnie poddaj go sterylizacji przez filtrowanie
9. Usuń nadmiar DM z kory/hipokampów
10. Dodaj 4 ml przygotowanego roztworu trawiennego papainy
11. Przenieś całą zawartość do probówki 50 ml i umieść probówkę Falcona w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na dokładnie 5 min
12. Usuń roztwór papainy za pomocą pipety
13. Dodaj 5 ml roztworu inhibitora trypsyny, zakręć probówką i umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 2-3 min
14. Usuń roztwór inhibitora trypsyny
15. Powtórz kroki 13 i 14 trzykrotnie
16. Dodaj 20 ml ciepłego PM
17. Trituruj aż do całkowitego zniknięcia grudek (~20-30 razy)
18. Wiruj przy 100xg przez 7 min
19. Resuspenduj osad w 10 ml PM i przemyj dwukrotnie poprzez wirowanie
20. Resuspenduj osad w 10 ml PM dla standardowych kultur neuronów lub w NBB27/DMEM dla kultur agregatów
21. Przepuść komórki przez sito komórkowe 70μm
22. Policz żywe komórki
23. Przejdź do hodowli agregatów zgodnie z opisem poniżej lub wysiej komórki do standardowych kultur neuronów
    Uwaga: Na tym etapie można uzyskać silnie wzbogacone kultury neuronów, wysiewając dysocjowane komórki na płytki pokryte PDL z gęstością 200-640 komórka/mm² w zależności od celu eksperymentów. Po przytwierdzeniu się komórek (~ 2-4h), zastąp medium ciepłym PM. W przypadku długotrwałej hodowli, w 4. dniu zastąp połowę medium ciepłym CM. Dla bardzo czystych kultur neuronalnych w DIV2 można dodać inhibitor mitotyczny 5-FdU (stężenie końcowe 10 μM), aby zahamować proliferację komórek nieneuronalnych (tj. w dniach DIV2-3). Po 2-dniowym regenerowaniu w CM, komórki zostaną ponownie poddane impulsowej obróbce 5-FdU przez kolejne 2 dni (DIV 6-7), po czym następuje całkowita wymiana medium. Następnie co 3-4 dni zastępuj połowę medium świeżym, ciepłym CM. Neurony pozostają żywotne do 4 tygodni.

Przygotowanie i wysiew agregatów

1. Zawiesić rozdzielone komórki w medium NBB27/DMEM zawierającym 1x Sato, 10ng/ml CNTF oraz 10μM forskoliny przy gęstości 2x10⁶ komórek/ml
2. Przenieść 2ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka niepowlekanej płytki 6-dołkowej
3. Kulturować przez 3 noce. Każdego dnia raz delikatnie resuspendować komórki za pomocą Pipetmana P1000
   Uwaga: Komórki zaczynają tworzyć agregaty (Rysunek 1).
4. W dniu poprzedzającym wysiew agregatów, powlec płytkę/szkiełka Matrigelem:
   • Rozcieńczyć stock Matrigelu (z obniżoną zawartością czynników wzrostu, BD Biosciences 354230) w stosunku 1:20 zimnym DMEM na lodzie
     Uwaga: Alikwoty Matrigelu należy przygotować zgodnie z protokołem producenta. Wszystkie końcówki, probówki Eppendorf i roztwory do przygotowania alikwotów stocku powinny być zimne, aby uniknąć polimeryzacji Matrigelu. Alikwoty Matrigelu przechowuje się w temperaturze -80°C i rozmraża w temperaturze 4°C.
   • Powlec wcześniej powleczone PDL szkiełka 300μl/dołek rozcieńczonego roztworu Matrigelu przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C
   • Przepłukać ciepłym PBS, a następnie przemyć płytkę ciepłą sterylną ddH₂O i pozostawić płytki w inkubatorze.
5. 3 dni po utworzeniu agregatów, ponownie delikatnie resuspendować komórki i przesiać zawiesinę przez sito 200μm do probówki Falcon 50ml. Pozostawić agregaty do osiadania na dnie probówki pod wpływem grawitacji (~3-5min)
6. Ostrożnie usunąć nadsącz
7. Dodać medium, delikatnie resuspendować agregaty i pozwolić im ponownie osiąść. Powtórzyć tę procedurę kilka razy, aby usunąć martwe komórki, pojedyncze komórki i debris. Użyć mikroskopu, aby sprawdzić, czy nadsącz nadal zawiera niezagregowane komórki i debris
8. Delikatnie resuspendować agregaty w tym samym medium NBB27/DMEM (Rysunek 1) i policzyć agregaty
9. Dostosować gęstość agregatów do około 25-30 agregatów/50ul
10. Przenieść alikwoty (500-1000μl) zawiesiny agregatów do probótek Eppendorf 2ml w celu wysiewu
    Uwaga: Ponieważ agregaty mają tendencję do osiadania na dnie probówek, kluczowe jest przygotowanie wielu probówek z zawiesiną agregatów do wysiewu. Często i delikatnie resuspendować agregaty przed ich wysianiem na powleczone szkiełka lub płytki hodowlane, aby zapewnić podobną liczbę agregatów wysianych na każdym szkiełku.
11. Wyjąć z inkubatora płytkę hodowlaną zawierającą powleczone Matrigelem szkiełka. Usunąć roztwór z każdego dołka, przepłukać szkiełka ciepłym PBS oraz ddH₂O, a następnie krótko osuszyć. Są one teraz gotowe do wysiewu agregatów
12. Odwrócić probówkę z zawiesiną agregatów, aby umożliwić ich równomierne rozłożenie przed wysiewem. Nanieść 50μl zawiesiny agregatów na środek każdego szkiełka i delikatnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, bez dalszych zaburzeń, aby umożliwić agregatom równomierne przytwierdzenie się do szkiełka
    Uwaga: Gęstość agregatów jest kluczowa. Jeśli agregaty zostaną wysiane zbyt blisko siebie lub jeśli gęstość wysiewu będzie wysoka, mają one tendencję do łączenia się w miarę wzrostu.
13. Dodać dodatkowe medium DMEM/NBB27 (500 μl) do każdego dołka po 4-6 h lub wczesnym rankiem następnego dnia
14. Aby utrzymać kulturę agregatów, wymieniać połowę medium co 3-4 dni. Podczas wymiany medium należy uważać, aby nie naruszyć agregatów; wykonuje się to poprzez delikatne dodawanie medium wzdłuż bocznej ścianki dołka.
    Uwaga: Kilka godzin po przytwierdzeniu się agregatów do płytki można zaobserwować wyrastanie neurytów z agregatów. Aksony rosną szybko w ciągu pierwszych dwóch tygodni i tworzą liczne połączenia między agregatami (Rysunek 2). Progenitory glejowe migrują radialnie z agregatów i z czasem różnicują się w astrocyty i dojrzałe oligodendrocyty.

Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym komórek tworzących agregaty w różnych dniach oraz agregatów po przemyciu.

Rycina 2. Obrazy w kontraście fazowym hodowli agregatów 2 i 12 dni po wysianiu na szkiełkach nakrywkowych pokrytych Matrigelem.

Dyskusja

Wczesne badania donosiły o tworzeniu się synaps i dojrzałej mieliny w kulturach wolno pływających agregatów indukowanych rotacją¹. Opisany tutaj system kultur agregatów OUN łączy bezserumowy wzrost wielopotencjalnych komórek progenitorowych w agregatach trójwymiarowych z wygodą tradycyjnych kultur 2D, co ułatwia analizy rozwoju, migracji i różnicowania komórek in vitro. System ten można modyfikować i wykorzystywać do badań nad komórkami prekursorowymi neuronów oraz do badania interakcji neuron-glia. N...