Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Podsumowanie

Opisano protokół systemu hodowli agregatów embrionalnego mózgu szczura. Wielopotencjalne komórki progenitorowe w agregatach mogą rozwijać się i różnicować w neurony, astrocyty oraz oligodendrocyty.

Streszczenie

System in vitro, który odtwarza proces rozwoju i różnicowania się progenitorów w dojrzałe neurony i glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), stanowiłby potężną platformę dla neuronaukowców do badania interakcji aksonalno-glejowych, właściwości i różnicowania multipotencjalnych progenitorów oraz progresji komórek linii oligodendroglialnej na poziomie komórkowym i molekularnym. Opisujemy tutaj system hodowli agregatów OUN z przedmózgowia embrionalnego szczura, który może być utrzymywany w medium bezsurowiczym do 3–4 tygodni i jest wykorzystywany w naszym laboratorium jako model do badania interakcji neuron-glej oraz mielinizacji w OUN. Ten materiał wideo zademonstruje, jak izolować i hodować te kultury agregatów OUN z mózgu szczura w 16. dniu embrionalnym (E16). Ponadto, z tej samej dyssekcji mózgu można łatwo uzyskać wysoce wzbogacone, klasyczne dysocjowane kultury neuronalne, które mogą być wykorzystywane w różnorodnych badaniach nad neuronami OUN lub w kokulturach z innymi komórkami.

Protokół

Przygotowanie przed sekcją

Narzędzia chirurgiczne: wszystkie nożyczki do sekcji i pincety należy wysterylizować w autoklawie

Czyszczenie szkiełek nakrywkowych:

1. Namoczyć wszystkie szkiełka nakrywki (o średnicy 15 mm dla płytki 24-dołkowej) w zlewce szklanej o pojemności 1 L w 33% HCl przez co najmniej 24 h
2. Przemywać pod bieżącą wodą przez 10 min, okazjonalnie potrząsając, aby usunąć wszelkie pozostałości HCl
3. Opłukać wodą z systemu Millipore
4. Odlać wodę
5. Namoczyć szkiełka nakrywki w etanolu 95-98%
6. Przenieść szkiełka nakrywki na czystą chusteczkę na płaskiej powierzchni i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu
7. Przenieść szkiełka nakrywki do zlewki szklanej, przykryć folią aluminiową i poddać autoklawowaniu
   Uwaga: Szkiełka nakrywki można na tym etapie przechowywać
8. Umieścić pojedyncze szkiełka nakrywki w płytkach hodowlanych. Są one gotowe do powlekania

Powlekanie szkiełka nakrywki:

1. Rozcieńczyć 100-krotny roztwórstok poly-D-lizyny (PDL, 10 mg/ml w 0,5% albuminie surowicy bydlęcej w PBS, przechowywany w aliquotach w -20°C) za pomocą PBS i wysterylizować przez filtr (0,22 μm)
2. Pokryć szkiełka podstawowe 1-krotnym roztworem PDL (~ 0,15 ml/cm²) przez 2 h w temperaturze 37°C w inkubatorze
3. Usunąć roztwór PDL, wypłukać 3 razy sterylną wodą ddH₂O i całkowicie wysuszyć szkiełka podstawkowe

Uwaga: Należy pokryć odpowiednią liczbę szkiełek nakrywkowych/płytek dla każdej sekcji. Szkiełka nakrywkowe pokryte PDL można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4°C.

Pożywki i roztwory

Pożywka do sekcji (DM): użyć sterylnego, schłodzonego do temperatury lodu zrównoważonego roztworu soli Hanksa (bez Ca²⁺, Mg²⁺) (HBSS, Invitrogen 14175) uzupełnionego o 10 mM HEPES (Invitrogen 15630).

Pożywka do hodowli agregatów: Pożywka DMEM/NBB27 zawiera DMEM/Neurobasal (1:1 obj:obj), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM pirogronianu sodu, 0,75mM GlutaMAX, 60μg/ml N-acetylocysteiny, 5 μg/ml insuliny, 10nM d-biotyny oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Aby przygotować 100 ml pożywki do hodowli agregatów, zmieszać 50 ml DMEM (bez pirogronianu/glutaminy, Invitrogen 11960), 50 ml pożywki Neurobasal (Invitrogen 211034), 375 μl GlutaMax (100 x, Invitrogen 35050), 5,5 mg pirogronianu sodu (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17504), 6,3 mg N-acetylocysteiny (Sigma A8199), 1 ml roztworu Sato (stok 100 x, patrz poniżej), 25 μl roztworu d-biotyny (stok 4000 x, 40 μM w PBS, przechowywany w alikwotach w -20°C, Sigma B4639), 100 μl insuliny (stok 1000 x, 5 mg/ml w 0,01N HCl, przechowywany w alikwotach w -20°C, Sigma 16634) oraz 1 ml penicyliny/streptomycyny (stok 100 x, Invitrogen 15140), wysterylizować przez filtr i przechowywać w 4°C.

Roztwór stokowy Sato 100x: Aby przygotować 40 ml roztworu stokowego: zmieszać 40 ml Neurobasal z 400 mg apo-transferyny (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 μl progesteronu (25 mg/ml w etanolu, przechowywanego w alikwotach w temperaturze -20°C, Sigma P8783), 64 mg putrescyny (Sigma P7505) oraz 40 μl selenicyanu sodu (30 μM w PBS, przechowywanego w alikwotach w temperaturze -20°C, Sigma S5261). Roztwór stokowy Sato należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C.

Pożywka do wysiewu neuronów (PM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2mM glutaminy (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C, Invitrogen 25030), 25μM kwasu glutaminowego (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.

Pożywka do hodowli neuronów (CM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2mM glutaminy (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.

Zapas 5-FdU: stężenie 100x, 1mM 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (Sigma F0503) i 1mM urydyny (Sigma U3003) w podłożu Neurobasal. Sterylizowane przez filtrowanie i przechowywane w alikwotach w temperaturze -20°C.

Roztwór do trawienia papainą (przygotować świeżo przed sekcją):

1. Rozpuścić 3.2 mg L-Cysteine (Sigma C-7352) w 4ml DM
2. Doprowadzić pH do poziomu około 7.4 za pomocą 1N NaOH (sprawdzić za pomocą pasków pomiarowych pH) i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C
   Uwaga: Kolejny krok należy wykonać bezpośrednio przed trawieniem tkanki (patrz poniżej).
3. Dodać papainę do stężenia końcowego 20 unit/ml
4. Przeprowadzić sterylizację przez filtrowanie (0.22mm) i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C

Roztwór inhibitora trypsyny (przygotować świeży przed sekcją):

1. Rozpuścić 0,2 g inhibitora trypsyny (Sigma T7295) w 20 ml DM
2. Sprawdzić pH i skorygować pH do ~7,4 za pomocą 1 N NaOH
3. Przefiltrować w celu sterylizacji i umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 37°C

Disekcja mózgu

Przygotowanie:

• Sterylne pincety i nożyczki
• 70% etanol
• Czysty papier tkankowy i podkład chłonny na blacie
• Szalki Petriego o średnicy 10 cm z lodowatym DM dla macicy i płodu na blacie
• Platforma chłodząca przy mikroskopie sekcyjnym
• 2-3 szalki o średnicy 6 cm z DM na lodzie
• Ciepłe PM w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C

1. Uśmierć ciężarną szczurkę linii Sprague-Dawley (E16) zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez lokalną Komisję ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach (IACUC)
2. Połóż szczurkę na podkładzie chłonnym i spryskaj alkoholem okolicę brzuszną
3. Za pomocą pęsety uchwyć skórę brzucha i nożyczkami wykonaj nacięcie w kształcie litery V, przecinając tylko skórę
4. Rozchyl skórę i używając drugiej pary sterylnych pęset i nożyczek, przetnij warstwę mięśniową
5. Wyjmij łańcuch pęcherzy płodowych i przenieś je do naczynia o średnicy 10 cm zawierającego lodowate DM
6. Używając nożyczek do mikrodysekcji, ostrożnie wyjmij każdy embrion z pęcherzyka, a następnie wyjmij mózg z każdego embrionu i umieść uwolnione mózgi w czystym naczyniu o średnicy 10 cm z DM na platformie z lodem
7. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, pod mikroskopem dissectingowym, odetnij sekcje śródmózwia i rzbmozgowia, a za pomocą precyzyjnej pęsety usuń oponi mózgowe i przenieś oczyszczone kory/hipokampy do nowego naczynia o średnicy 6 cm z DM na wkładzie chłodzącym
   Uwaga: na tym etapie tkanka jest gotowa do trawienia enzymatycznego.
8. Przygotuj roztwór papainy i inhibitora trypsyny, a następnie poddaj go sterylizacji przez filtrowanie
9. Usuń nadmiar DM z kory/hipokampów
10. Dodaj 4 ml przygotowanego roztworu trawiennego z papainą
11. Przenieś całą zawartość do probówki 50 ml i umieść probówkę Falcon w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C dokładnie na 5 min
12. Usuń roztwór papainy za pomocą pipety
13. Dodaj 5 ml roztworu inhibitora trypsyny, zamieszaj probówkę i pozostaw w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 2-3 min
14. Usuń roztwór inhibitora trypsyny
15. Powtórz kroki 13 i 14 trzykrotnie
16. Dodaj 20 ml ciepłego PM
17. Trituruj do momentu całkowitego rozbicia grudek (~20-30 razy)
18. Odwiruj przy 100xg przez 7 min
19. Resuspenduj osad w 10 ml PM i przemyj dwukrotnie poprzez wirowanie
20. Resuspenduj osad w 10 ml PM dla standardowych kultur neuronów lub w NBB27/DMEM dla kultur agregatów
21. Przepuść komórki przez sita komórkowe 70μm
22. Policz żywe komórki
23. Przejdź do hodowli agregatów zgodnie z poniższym opisem lub wysiej komórki do standardowych kultur neuronów
    Uwaga: Na tym etapie można uzyskać silnie wzbogacone kultury neuronów, wysiewając dysocjowane komórki na płytki pokryte PDL w gęstości 200-640 komórka/mm², w zależności od celu eksperymentów. Po przytwierdzeniu się komórek (~ 2-4 h), wymień medium na ciepły PM. W przypadku długotrwałej hodowli, w 4. dniu wymień połowę medium na ciepły CM. Dla wysoce oczyszczonych kultur neuronalnych w DIV2 można dodać inhibitor mitotyczny 5-FdU (stężenie końcowe 10 μM), aby zahamować proliferację komórek nieneuronalnych (tj. w DIV2-3). Po regeneracji w CM przez 2 dni, komórki poddaje się ponownej impulsowej obróbce 5-FdU przez kolejne 2 dni (DIV 6-7), a następnie całkowitej wymianie medium. Następnie, co 3-4 dni, wymieniaj połowę medium na świeży, ciepły CM. Neurony pozostają żywotne do 4 tygodni.

Przygotowanie i wysiew agregatów

1. Resuspenduj zdysocjowane komórki w medium NBB27/DMEM zawierającym 1x Sato, 10ng/ml CNTF oraz 10μM forskoliny, osiągając gęstość 2x10⁶ komórek/ml
2. Przenieś 2ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka niepowleczonej płytki 6-dołkowej
3. Kultywuj przez 3 noce. Każdego dnia delikatnie resuspenduj komórki raz, używając Pipetmana P1000
   Uwaga: Komórki zaczynają tworzyć agregaty (Rysunek 1).
4. W dniu poprzedzającym wysiew agregatów powlekaj płytkę/szkiełka nakrywkowe Matrigelem:
   • Rozcieńcz roztwór zapasowy Matrigelu (growth factor reduced, BD Biosciences 354230) w stosunku 1:20 zimnym DMEM na lodzie
     Uwaga: Alikwoty Matrigelu należy przygotować zgodnie z protokołem producenta. Wszystkie końcówki, probówki Eppendorf oraz roztwory służące do przygotowania alikwotów z roztworu zapasowego powinny być zimne, aby zapobiec polimeryzacji Matrigelu. Alikwoty Matrigelu przechowuje się w temperaturze -80°C i rozmraża w temperaturze 4°C.
   • Powlek wcześniej pokryte PDL szkiełka nakrywkowe 300μl/dołek rozcieńczonego roztworu Matrigelu przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C
   • Przemyj ciepłym PBS, następnie przemyj płytkę ciepłą sterylną wodą ddH₂O i pozostaw płytki w inkubatorze.
5. 3 dni po utworzeniu agregatów delikatnie resuspenduj ponownie komórki i przefiltruj zawiesinę przez sito o oczkach 200μm do probówki Falcon 50ml. Pozostaw agregaty, aby opadły na dno probówki pod wpływem grawitacji (~3-5min)
6. Ostrożnie usuń nadsącz
7. Dodaj medium, delikatnie resuspenduj agregaty i pozwól im ponownie opaść. Powtórz tę procedurę kilka razy, aby usunąć martwe komórki, pojedyncze komórki i debris. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy w nadsączu wciąż znajdują się niezagregowane komórki i debris
8. Delikatnie resuspenduj agregaty w tym samym medium NBB27/DMEM (Rysunek 1) i policz agregaty
9. Dostosuj gęstość agregatów do poziomu około 25-30 agregatów/50ul
10. Przenieś alikwoty (500-1000μl) zawiesiny agregatów do probótek Eppendorf 2ml w celu wysiewu
    Uwaga: Ponieważ agregaty mają tendencję do opadania na dno probówek, kluczowe jest przygotowanie wielu probówek z zawiesiną agregatów do wysiewu. Delikatnie i często resuspenduj agregaty przed ich wysiewem na powlekane szkiełka nakrywkowe lub płytki hodowlane, aby zapewnić podobną liczbę agregatów na każdym szkiełku.
11. Wyjmij z inkubatora płytkę hodowlaną zawierającą powlekane Matrigelem szkiełka nakrywkowe. Usuń roztwór z każdego dołka, przemyj szkiełka nakrywkowe ciepłym PBS i wodą ddH₂O, a następnie krótko osusz. Są one teraz gotowe do wysiewu agregatów
12. Odwróć probówkę z zawiesiną agregatów, aby umożliwić ich równomierny rozkład przed wysiewem. Nanieś 50μl zawiesiny agregatów na środek każdego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, unikając dalszych zakłóceń, aby umożliwić równomierne przytwierdzenie się agregatów do szkiełka
    Uwaga: Gęstość agregatów jest kluczowa. Jeśli agregaty zostaną wysiane zbyt blisko siebie lub jeśli gęstość wysiewu będzie zbyt wysoka, mają one tendencję do zrastania się w miarę wzrostu.
13. Dodaj dodatkowe medium DMEM/NBB27 (500 μl) do każdego dołka 4-6 h później lub wcześnie następnego ranka
14. Aby utrzymać kulturę agregatów, wymieniaj połowę medium co 3-4 dni. Podczas wymiany medium uważaj, aby nie uszkodzić agregatów; należy to robić poprzez delikatne dodawanie medium wzdłuż bocznej ścianki dołka.
    Uwaga: Kilka godzin po przytwierdzeniu się agregatów do płytki można zaobserwować wzrost neurytów z agregatów. Aksony rosną szybko w ciągu pierwszych dwóch tygodni i tworzą liczne połączenia między agregatami (Rysunek 2). Progenitory glejowe migrują radialnie z agregatów i z czasem różnicują się w astrocyty i dojrzałe oligodendrocyty.

Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym komórek tworzących agregaty w różnych dniach oraz agregaty po przemyciu.

Rycina 2. Obrazy w kontraście fazowym hodowli agregatowej 2 i 12 dni po wysianiu na szkiełkach podstawkowych pokrytych Matrigel.

Dyskusja

Wczesne badania donosiły o tworzeniu się synaps i dojrzałej mieliny w kulturach wolno pływających agregatów indukowanych rotacją¹. Opisany tutaj system kultur agregatów OUN łączy bezserumowy wzrost wielopotencjalnych komórek progenitorowych w agregatach trójwymiarowych z wygodą tradycyjnych kultur 2D, co ułatwia analizy rozwoju, migracji i różnicowania komórek in vitro. System ten można modyfikować i wykorzystywać do badań nad komórkami prekursorowymi neuronów oraz do badania interakcji neuron-glia. N...