W niniejszym filmie demonstrujemy sposób znakowania i wizualizacji pojedynczej egzocytozy oraz transportu pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki złotych rybek przy użyciu mikroskopii TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) to technika umożliwiająca badanie zdarzeń zachodzących na błonie komórkowej poprzez selekcyjne obrazowanie cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się najbliżej substancji o wysokim współczynniku załamania światła, takiej jak szkło1W niniejszym artykule stosujemy tę technikę do obrazowania egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki wyizolowanych z siatkówki złotej rybki. Neurony te są bardzo odpowiednie do tego rodzaju badań ze względu na ich duże zakończenia aksonalne. Dzięki jednoczesnemu zastosowaniu techniki patch-clamp w komórkach bipolarnych możliwe jest zbadanie zależności między napięciem presynaptycznym a uwalnianiem synaptycznym2,3Pęcherzyki synaptyczne w zakończeniach komórek bipolarnych są ładowane barwnikiem fluorescencyjnym (FM 1-43®) poprzez jednoczesne podawanie barwnika i roztworu Ringera zawierającego wysoką zawartość K+koncentracja na zakończeniach synaptycznych. Powoduje to depolaryzację komórek i stymuluje endocytozę, a w konsekwencji pobieranie barwnika do pęcherzyków glutaminergicznych. Po wypłukaniu nadmiaru barwnika przez około 30 minut komórki są gotowe do rejestracji metodą patch-clamp i jednoczesnego obrazowania za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Roztwór w pipecie patch zawiera peptyd oparty na rodaminie, który wiąże się selektywnie z białkiem wstążki synaptycznej RIBEYE4, co pozwala na specyficzne znakowanie wstęg podczas obrazowania zakończeń za pomocą lasera o długości fali 561 nm. Umożliwia to precyzyjną lokalizację stref aktywnych oraz odróżnienie zdarzeń synaptycznych od pozasynaptycznych.
Protokół
Część 1: Disekcja i izolacja komórek bipolarnych
- Przygotować roztwory wymienione w Tabeli 2; pH roztworów ringera (zewnętrznych) należy dostosować do 7,4 za pomocą NaOH, a pH roztworu wewnętrznego do 7,2 za pomocą CsOH. Roztwór wewnętrzny należy chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia;
- Złotą rybkę należy adaptować do ciemności przez co najmniej 30 minut przed sekcją;
- Podczas adaptacji zwierzęcia do ciemności przygotować 5 mL roztworu hialuronidazy (hialuronidaza typu V, 1100 units/mL w roztworze ringera z niską zawartością Ca2+; Sigma, St. Louis, MO) oraz 10 mL roz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zaletami mikroskopii TIRF z zastosowaniem obiektywu są: 1) doskonałe sekcjonowanie optyczne dzięki ograniczeniu światła wzbudzenia do wąskiego obszaru w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, co minimalizuje wpływ światła poza ogniskiem; 2) możliwość monitorowania ruchu w kierunku pionowym jako zmiany natężenia fluorescencji, ponieważ natężenie światła spada wykładniczo wraz z odległością; 3) efektywny zbieranie światła dzięki obiektywowi o wysokiej aperturze numerycznej1,5.
Główną wad.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu NIH EY 14990.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
