Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF

Podsumowanie

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób znakowania i wizualizacji pojedynczej egzocytozy oraz transportu pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki złotych rybek przy użyciu mikroskopii TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji).

Streszczenie

Mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) to technika umożliwiająca badanie zdarzeń zachodzących na błonie komórkowej poprzez selekcyjne obrazowanie cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się najbliżej substancji o wysokim współczynniku załamania światła, takiej jak szkło¹W niniejszym artykule stosujemy tę technikę do obrazowania egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki wyizolowanych z siatkówki złotej rybki. Neurony te są bardzo odpowiednie do tego rodzaju badań ze względu na ich duże zakończenia aksonalne. Dzięki jednoczesnemu zastosowaniu techniki patch-clamp w komórkach bipolarnych możliwe jest zbadanie zależności między napięciem presynaptycznym a uwalnianiem synaptycznym^2,3Pęcherzyki synaptyczne w zakończeniach komórek bipolarnych są ładowane barwnikiem fluorescencyjnym (FM 1-43®) poprzez jednoczesne podawanie barwnika i roztworu Ringera zawierającego wysoką zawartość K⁺koncentracja na zakończeniach synaptycznych. Powoduje to depolaryzację komórek i stymuluje endocytozę, a w konsekwencji pobieranie barwnika do pęcherzyków glutaminergicznych. Po wypłukaniu nadmiaru barwnika przez około 30 minut komórki są gotowe do rejestracji metodą patch-clamp i jednoczesnego obrazowania za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Roztwór w pipecie patch zawiera peptyd oparty na rodaminie, który wiąże się selektywnie z białkiem wstążki synaptycznej RIBEYE⁴, co pozwala na specyficzne znakowanie wstęg podczas obrazowania zakończeń za pomocą lasera o długości fali 561 nm. Umożliwia to precyzyjną lokalizację stref aktywnych oraz odróżnienie zdarzeń synaptycznych od pozasynaptycznych.

Protokół

Część 1: Disekcja i izolacja komórek bipolarnych

1. Przygotować roztwory wymienione w Tabeli 2; pH roztworów ringera (zewnętrznych) należy dostosować do 7,4 za pomocą NaOH, a pH roztworu wewnętrznego do 7,2 za pomocą CsOH. Roztwór wewnętrzny należy chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia;
2. Złotą rybkę należy adaptować do ciemności przez co najmniej 30 minut przed sekcją;
3. Podczas adaptacji zwierzęcia do ciemności przygotować 5 mL roztworu hialuronidazy (hialuronidaza typu V, 1100 units/mL w roztworze ringera z niską zawartością Ca²⁺; Sigma, St. Louis, MO) oraz 10 mL roztworu L-cysteiny (0,5 mg/mL w roztworze ringera z niską zawartością Ca²⁺) i odważyć papainę (proszek liofilizowany, 40 units/mL; Sigma, St. Louis, MO) na 5 mL roztworu do trawienia;
4. Eutanazować złotą rybkę poprzez szybką dekapitację nożyczkami chirurgicznymi, a następnie zniszczyć mózg i rdzeń kręgowy ostrzem skalpela nr 11;
5. Usunąć oczy, przecinając mięśnie pozagałkowe za pomocą zakrzywionej pęsety Dumont nr 7 i przecinając nerw wzrokowy nożyczkami do tęczówki;
6. Umieścić jedno gałkę oczną na kawałku papieru filtracyjnego i przebić limbus twardówki końcówką ostrza skalpela nr 11;
7. Wprowadzić ostrze nożyczek Vannasa do otworu i wyciąć cały segment przedni;
8. Położyć mały kawałek papieru filtracyjnego na pozostałej czarence i lekko docisnąć, aby papier nasiąkł ciałem szklistym;
9. Podnieść papier filtracyjny z przytwierdzoną do niego siatkówką i przeciąć nerw wzrokowy nożyczkami Vannasa;
10. Umieścić papier filtracyjny z siatkówką w plastikowej szalce hodowlanej o średnicy 35 mm z roztworem hialuronidazy i oddzielić siatkówkę od papieru za pomocą pęsety Dumont nr 7;
11. Pokroić siatkówkę na 4-6 kawałków za pomocą połowy przemysłowego jednostronnego ostrza ze stali węglowej i pozostawić w roztworze hialuronidazy na 20 minut;
12. Podczas oczekiwania na działanie hialuronidazy dodać 5 mL roztworu L-cysteiny do papainy i odczekać, aż ciecz stanie się przezroczysta (około 5-10 minut);
13. Przemyć kawałki siatkówki 3x w roztworze ringera z niską zawartością Ca²⁺ i pozostawić w roztworze papainy na 30-35 minut;
14. Przemyć kawałki siatkówki 3x w roztworze ringera z niską zawartością Ca²⁺ i przechowywać do momentu użycia w temperaturze 4 °C w plastikowej szalce hodowlanej o średnicy 35 mm zawierającej roztwór ringera z niską zawartością Ca²⁺;
15. Aby dysocjować komórki, umieścić kawałek siatkówki w probówce do mikrocentryfugi zawierającej 500 mL roztworu ringera z niską zawartością Ca²⁺ i powoli utrzeć siatkówkę, pipetując ją w górę i w dół za pomocą szklanej pipety do dysocjacji, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Pipety do dysocjacji wykonuje się poprzez rozgrzanie końcówki szklanej pipety Pasteura palnikiem Bunsena i lekkie zagięcie jej za pomocą pęsety anatomicznej;
16. Nanieść wyizolowane komórki, dodając kroplę zawiesiny siatkówki do własnoręcznie wykonanej komory rejestracyjnej, uprzednio wypełnionej 2 mL roztworu ringera z niską zawartością Ca²⁺. Komora składa się z dolnej połowy plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm z okrągłym otworem w środku oraz okrągłego szkiełka zakryjącego o współczynniku załamania światła 1,78 (PlanOptik, Niemcy), przyklejonego do dna elastomerem silikonowym (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI).

Część 2: Obciążanie komórek bipolarnych i wypłukiwanie

Obrazowanie pęcherzyków synaptycznych metodą TIRF najlepiej przeprowadzić przy użyciu mikroskopu TIRFM z obiektywem o bardzo wysokiej aperturze numerycznej (NA) i czułą kamerą. W naszych eksperymentach zdecydowaliśmy się na użycie obiektywu o NA 1.65 (Apo x100 O HR, N.A. 1.65, Olympus, Japonia) z kamerą EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). Zastosowanie obiektywu o bardzo wysokiej NA wymaga użycia szkiełek zakrywek o wysokim współczynniku załamania światła oraz odpowiedniego medium imersyjnego (diiodometanu z siarką). W naszych warunkach światło wzbudzenia jest ograniczone do pola zanikającego wykładniczo o stałej długości wynoszącej około 50 nm.

1. Nanieś kroplę cieczy o wysokim współczynniku załamania światła (seria M, współczynnik załamania = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) na obiektyw mikroskopu;
2. Ostrożnie umieść komorę rejestracyjną na obiektywie mikroskopu, a następnie starannie zamontuj elektrodę uziemiającą i rurkę wylotową superfuzji do komory;
3. Pozostaw komorę na mikroskopie na 10-20 minut, aby komórki mogły opaść i przytwierdzić się do dna;
4. W międzyczasie przygotuj 5 mL 1mM roztworu trolox® ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid; Sigma, St. Louis, MO) w roztworze Ringera z wysoką zawartością K⁺. Sonicuj do całkowitego rozpuszczenia;
5. Przygotuj 15 mL roztworu płuczącego ADVASEP-7: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) w roztworze Ringera z niską zawartością Ca²⁺. Należy pamiętać, że użycie ADVASEP-7 jest opcjonalne i można z niego zrezygnować w razie potrzeby;
6. Przepłucz linie superfuzji i wprowadź do systemu superfuzji roztwór płuczący ADVASEP-7, roztwór Ringera z niską zawartością Ca²⁺ oraz kontrolny roztwór Ringera;
7. Wytnij pipety do ładowania z cienkościennego szkła borokrzemianowego (Kwik-Fil® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Rezystancja pipet typu puffer mieści się w zakresie 1,5-2,5 MΩ;
8. Przygotuj roztwory FM1-43® (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)pyridinium dibromide, „special packaging”; Invitrogen, Carlsbad, CA). Najpierw przygotuj roztwór stokowy 1 mM, dodając 160 μL wody destylowanej do jednej fiolki (100 mg) FM1-43®. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. Następnie dodaj 5 μL FM1-43® do 1 mL roztworu Ringera z wysoką zawartością K⁺ + 1mM trolox®. Chroń roztwór przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia;
9. Włącz światło pola jasnego w mikroskopie i wyszukaj nieuszkodzone komórki bipolarne. Delikatnie stuknij w mikroskop, aby upewnić się, że neurony są mocno przytwierdzone do dna komory;
10. Ustaw końcówkę superfuzyjną blisko wybranej komórki i stale perfunduj preparat roztworem Ringera z niską zawartością Ca²⁺;
11. Zgaś światła w pomieszczeniu i wprowadź do toru optycznego czerwony filtr długoprzepustowy (np. RG630; Schott, Germany), aby zminimalizować wzbudzenie barwnika FM;
12. Napełnij pipetę do ładowania 10 μL roztworu barwnika FM, zamontuj pipetę w mikromanipulatorze i opuść ją na preparat bez stosowania nadciśnienia, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co komórka bipolarna, którą chcesz załadować. Upewnij się, że dysponujesz co najmniej dwoma uchwytami do elektrod: uchwytu użytego do barwnika FM nie można wykorzystać do patch clampingu, ponieważ mogłoby to zanieczyścić roztwór wewnątrzkomórkowy;
13. Ustaw otwór pipety puffer w odległości około 10 μm od terminala aksonu, wyłącz system superfuzji i podaj roztwór barwnika przez 10 sekund, włączając nadciśnienie w pipiecie;
14. Wyłącz nadciśnienie i, nie przesuwając pipety, odczekaj 30 sekund;
15. Włącz superfuzję i kąp komorę w roztworze ADVASEP-7 przez 5 minut. W międzyczasie wyjmij pipetę puffer z kąpieli;
16. Po 5 minutach przełącz na roztwór Ringera z niską zawartością Ca²⁺ i perfunduj komorę przez 25-30 minut, aby usunąć nadmiar barwnika.

Część 3: Metoda patch-clamp i obrazowanie TIRFM

1. Podczas wypłukiwania preparatu, wyciągnij pipety patch z grubościennego szkła borokrzemianowego (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Opór pipet patch mieści się w zakresie 8-10 MΩ;
2. Po zakończeniu wypłukiwania, umieść zakończenie aksonu w centrum pola widzenia;
3. Napełnij pipetę patch 7μL roztworu wewnętrznego, opukaj pipetę, aby usunąć pęcherzyki powietrza, pokryj ją stopionym woskiem dentystycznym (Sticky Wax; Kerr Corporation, Orange, CA) i zamocuj w mikromanipulatorze;
4. Włącz nadciśnienie w pipecie i powoli opuść pipetę na preparat. Sprawdź opór pipety w wzmacniaczu i skoryguj przesunięcia oraz pojemność pipety za pomocą odpowiednich sterowników wzmacniacza;
5. Przełącz superfuzję na kontrolny roztwór ringera. Aby utworzyć gigauszczelnienie (gigaseal) między pipetą a komórką, lekko dotknij końcówką elektrody ciała komórki i wyłącz nadciśnienie w pipecie, jednocześnie delikatnie przykładając podciśnienie do elektrody;
6. Po uzyskaniu uszczelnienia, wybierz w wzmacniaczu tryb „whole cell” i ustaw potencjał podtrzymujący komórki na -60 mV;
7. Za pomocą oprogramowania obrazującego wybierz obszar zainteresowania obejmujący całe zakończenie aksonu, wyłącz światło w polu jasnym i, krótko naświetlając (30 ms) zakończenie laserem 488 nm, znajdź odpowiednią płaszczyznę ogniskowania dla obrazowania TIRF;
8. Przebij membranę komórkową, używając komendy „zap” we wzmacniaczu podczas przykładania lekkiego podciśnienia do pipety;
9. Skoryguj pojemność komórki i opór szeregowy, a następnie zastosuj wybrany protokół napięciowy podczas obrazowania ruchu pęcherzyków synaptycznych. Na tym etapie ważne jest, aby protokół napięciowy był zsynchronizowany z częstotliwością klatek kamery. W naszym przypadku każda klatka trwa 30 ms, zatem zmiany napięcia występują w wielokrotnościach tej wartości (tj. co 300 ms lub 10 klatek);
10. Odczekaj co najmniej 40 sekund między próbami, aby umożliwić regenerację;
11. Aby sprawdzić położenie wstążek synaptycznych, wykonaj zdjęcia po włączeniu lasera 561 nm.

Rycina 1: Układ eksperymentalny. Laser 488 nm (niebieski) jest ogniskowany na obwodzie tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu i ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu w miejscu styku szkła z medium wodnym. Pole elektromagnetyczne generowane przez odbitą wiązkę wzbudza fluorofor wprowadzony do pęcherzyków synaptycznych znajdujących się najbliżej dna szklanej komory, które następnie fluorescują (zielony). Światło fluorescencyjne jest następnie kierowane do oka obserwatora (przedstawione) lub do kamery CCD. Potencjał błonowy obrazowanych komórek jest kontrolowany jednocześnie za pomocą techniki patch-clamp. Takie podejście umożliwia badanie zależności między sygnałami wejściowymi (napięciem błony) a odpowiedzią neuronalną (egzocytozą).

Rycina 2: Typowe wyniki. Lewo: obraz w polu jasnym izolowanej komórki dwubiegunowej złotej rybki. Prawy górny róg: obraz TIRF pęcherzyków synaptycznych w zakończeniu aksonu komórki dwubiegunowej obciążonych barwnikiem FM 1-43® i obrazowanych laserem 488 nm (barwnik FM). Prawy dolny róg: obraz tego samego zakończenia po wykonaniu patch-clamp komórki i obrazowaniu zakończenia aksonu laserem 561 nm. Wstążki synaptyczne są znakowane peptydem wiążącym RIBEYE opartym na rhodaminie (Rpep_rhod).

Tabela 1: Specyficzne odczynniki i sprzęt.

Nazwa	Typ	Producent	Katalog	Komentarz
-	Stół optyczny pneumatyczny	Newport Corporation	-	-
IX70	Mikroskop odwrócony	Olympus	-	Wyposażony w lampę wolframową do pola jasnego i boczny port dostępu dla TIRF
TH4-100	Zasilacz lampy	Olympus	-	-
FF498_581-Di01	Filtr dychroiczny	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	Filtr emisyjny	Semrock	-	-
Apo x100 O HR	Obiektyw	Olympus	-	N.A. 1.65
RG630	Czerwony filtr szklany	Schott	-	-
-	Laser 488 nm	Coherent	-	Stosować przy minimalnej mocy
-	Migawka	Uniblitz	-	-
VMM-D1	Sterownik migawki	Uniblitz	-	-
-	Laser 561 nm	Melles Griot	-	-
-	Migawka	Uniblitz	-	-
VMM-D3	Sterownik migawki	Uniblitz	-	-
Perfusion Pressure Kit	System superfuzji	Automate Scientific	09-04	-
Perfusion Pen	System superfuzji	Automate Scientific	-	-
Valvelink 8	Sterownik systemu superfuzji	Automate Scientific	-	-
Cascade 512B	Kamera EM CCD	Roper Scientific	-	-
Metamorph 7.1	Oprogramowanie do obrazowania	Molecular Devices	-	-
EPC-9	Wzmacniacz patch-clamp	HEKA Elektronik	-	-
Pulse	Oprogramowanie wzmacniacza	HEKA Elektronik	-	-
MP-285	Mikromanipulator	Sutter Instrument	-	-
-	Uchwyt elektrody	HEKA Elektronik	-	Dla szkła o średnicy zewnętrznej 1.5 mm, 2 sztuki
Kwik-Fil® TW150-3	Szkło kapilarne borokrzemowe	WPI	-	Bez włókna
B150-86-10	Szkło kapilarne borokrzemowe	Sutter Instrument	-	Z włóknem
P-97	Wytciągacz mikroelektrod	Sutter Instrument	-	Wyposażony w włókno w obudowie 3x3 i komorę środowiskową
-	Pompa próżniowa ciśnieniowa	Thomas Scientific	7893B05	Tworzy próżnię do usuwania cieczy z komory oraz nadciśnienie dla pipet
MatLab R2008a	Oprogramowanie analityczne	MathWorks	-	-
353001	Plastikowe szalki hodowlane 35 mm	Falcon	-	-
-	Szkło o wysokim współczynniku załamania	PlanOptik	-	Współczynnik załamania488 nm = 1.78
Series M	ciecz o wysokim współczynniku załamania	Cargille Labs	-	Współczynnik załamania = 1.78
Sylgard 184	Zestaw elastomeru silikonowego	Dow Corning	-	-
Glutathione	Tripeptyd	EMD Chemicals		Wymiatacz wolnych rodników
Hyaluronidase	Enzym	Sigma	H6254	Typ V
L-cysteine	Aminokwas	Fluka	30090	Aktywuje papainę
Papain	Enzym	Fluka	76220	Z Carica papaya
Trolox®	Rozpuszczalna witamina E	Sigma	56510	Wymiatacz wolnych rodników
ADVASEP-7	Sulfonowana pochodna β-cyklodekstryny	Sigma	A3723	Zmniejsza fluorescencję tła FM 1-43®
FM 1-43®	Barwnik fluorescencyjny	Invitrogen	T35356	„Specjalne opakowanie”
Sticky Wax	Środek do powlekania pipet	Kerr Corporation	-	Zmniejsza pojemność pipety

Tabela 2: Roztwory fizjologiczne użyte w niniejszym badaniu.

Substancja	Roztwór Ringera z niską zawartością Ca2+	Kontrolny roztwór Ringera	Roztwór Ringera z wysoką zawartością K+	Roztwór wewnętrzny
NaCl	120 mM	120 mM	97.5 mM	-
KCl	2.5 mM	2.5 mM	25 mM	-
MgCl2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mM
CaCl2	0.5 mM	2.5 mM	2.5 mM	-
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0.75 mM	-	-	0.5 mM
Glukoza	10 mM	10 mM	-	-
Glutation	2 mM	2 mM	-	1 mM
CH3CsO3S*	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-rhod**	-	-	-	5 mM
Objętość	200 mL	100 mL	5 μL	100 μL

* Metanosulfonian cezu.
** Peptyd wiążący RIBEYE: rhodamine+EQTVPVDLSVARDR-cooh (mw 1997.75).

Dyskusja

Zaletami mikroskopii TIRF z zastosowaniem obiektywu są: 1) doskonałe sekcjonowanie optyczne dzięki ograniczeniu światła wzbudzenia do wąskiego obszaru w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, co minimalizuje wpływ światła poza ogniskiem; 2) możliwość monitorowania ruchu w kierunku pionowym jako zmiany natężenia fluorescencji, ponieważ natężenie światła spada wykładniczo wraz z odległością; 3) efektywny zbieranie światła dzięki obiektywowi o wysokiej aperturze numerycznej^1,5.

Główną wad...