Szybki system dostarczania oparty na kropelkach do pompowania pasywnego w urządzeniach mikroprzepływowych

Podsumowanie

Opracowano nowy system mikrofluidyczny wykorzystujący zjawisko pompowania pasywnego oraz system dostarczania płynów sterowany przez użytkownika. Ze względu na niski koszt, łatwość obsługi, precyzję objętościową, wysoką prędkość, powtarzalność i możliwość automatyzacji, system mikrofluidyczny ten ma potencjał do zastosowania w szerokim zakresie aplikacji biologicznych.

Streszczenie

Opracowano nowy system mikrofluidyczny, który wykorzystuje zjawisko pompowania pasywnego wraz z kontrolowanym przez użytkownika systemem dostarczania cieczy opartym na kropelkach. Pompowanie pasywne jest zjawiskiem, w którym różnice ciśnień wywołane napięciem powierzchniowym napędzają ruch cieczy w zamkniętych kanałach. Zautomatyzowany system dostarczania cieczy składa się z zestawu zaworów sterowanych napięciem z mikrodyszami, połączonych z rezerwuarem cieczy oraz systemem sterowania. Zawory sterowane napięciem umożliwiają wolumetrycznie precyzyjne dostarczanie kropelek cieczy do wlotu urządzenia mikrofluidycznego z wysoką częstotliwością. W oparciu o wymiary zaprezentowane w przykładzie w niniejszym badaniu, system jest w stanie tłoczyć 4 mililitry na minutę (przez kanał o przekroju poprzecznym 2,2 mm na 260 μm). Przy tych samych wymiarach kanału wymiana cieczy w punkcie wewnątrz kanału może zostać osiągnięta w czasie zaledwie ośmiu milisekund. Zaobserwowano oddziaływanie między pędem systemu (nadanym przez kombinację kropelek tworzonych przez zawory i prędkość cieczy w kanale) a napięciem powierzchniowym cieczy. Podczas gdy pęd nadaje prędkość przepływowi cieczy (lub odwrotnie), wyrównanie napięcia powierzchniowego na wlocie powoduje gwałtowne zatrzymanie przepływu. To nagłe zatrzymanie pozwala użytkownikowi kontrolować charakterystykę przepływu w kanale i otwiera drogę do różnorodnych zastosowań biologicznych, od dostarczania odczynników po badania nad oddziaływaniem leków z komórkami. Zaobserwowano również, że gdy dysze są skierowane na wlot pod niewielkimi kątami, pęd kropel może wywoływać dodatkowe interesujące zjawiska fluidalne, takie jak mieszanie się wielu kropel we wlocie.

Protokół

W niniejszym raporcie prezentujemy metodę dostarczania płynów, która wykorzystuje napięcie powierzchniowe małych kropli do pompowania pożądanej objętości przez kanał mikrofluidyczny w celu uzyskania szeregu różnych zjawisk płynowych. Przykładowo, użytkownik może chcieć przepływać pojedynczy płyn tak szybko, jak to możliwe, lub dostarczać wiele płynów w szybkiej sekwencji w celu stworzenia określonych wzorów fluidycznych. Aby to osiągnąć, użytkownik musi najpierw opracować aplikację opartą na urządzeniu mikrofluidycznym. Urządzenie mikrofluidyczne nie musi być scalone, ale powinno być wykonane z materiału hydrofilowego. W związku z tym metoda ta może być stosowana w niemal każdym urządzeniu mikrofluidycznym, a jej wydajność jest w dużej mierze podyktowana ograniczeniami geometrycznymi kanału mikrofluidycznego. Aby ułatwić nawigację po ograniczeniach geometrycznych tej metody, w pierwszej kolejności przedstawiono wprowadzenie do odpowiedniej analizy numerycznej.

1. Metody analityczne: Zgodnie z prawem Laplace'a i prawem Washburna [1], szybkość przepływu w kanale mikrofluidycznym można powiązać z jego wymiarami i właściwościami płynącej cieczy, co przedstawiono w równaniu (1),
   (1)
   gdzie ΔP to różnica ciśnień między wlotem a wylotem, γ to napięcie powierzchniowe cieczy, R to promień kropli na wlocie, Q to szybkość przepływu, a K to opór hydrauliczny opisany równaniem (2),
   (2)
   gdzie η to lepkość cieczy, L₀ to długość kanału, h to wysokość kanału, w to szerokość kanału, λ=w/h oraz g (λ) =1,5 jeżeli λ >4,45 lub
   
   jeżeli λ < 4,45. Podstawiając równanie (2) do równania (1), przy założeniu, że h (3)
   Analogiczną analizę można przeprowadzić dla prędkości cieczy wewnątrz kanału, wiedząc, że Q=VA, gdzie V to średnia prędkość cieczy, a A to powierzchnia przekroju poprzecznego, czyli hw. Podstawiając te wartości do równania (3), otrzymujemy równanie (4),
   (4)
   Ważnym pojęciem mechanicznym często stosowanym w biologii mikrofluidycznej jest naprężenie ścinające, które wiąże się z szybkością przepływu i prędkością zgodnie z równaniem (5),
   (5)
   Znajomość zależności między szybkością przepływu, prędkością i ich fizycznymi implikacjami w funkcji wymiarów kanału i właściwości cieczy jest kluczowa przy projektowaniu urządzenia mikrofluidycznego do określonego celu. Po stworzeniu urządzenia użytkownik musi skalibrować system podawania cieczy, aby uzyskać pożądane charakterystyki przepływu wewnątrz urządzenia.
2. Kroki konfiguracji i kalibracji systemu podawania:
   1. Wykonaj urządzenie mikrofluidyczne metodą miękkiej litografii, używając polidimetylosiloksanu (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning) [2]. W JoVE znajduje się wiele artykułów ilustrujących metody wytwarzania mikrofluidycznych urządzeń z PDMS [5]. Do tego pokazu wybraliśmy prosty prostokątny kanał o następujących wymiarach: szerokość 2,2 mm, długość 10 mm i wysokość 260 µm. Średnice wlotu i wylotu wynoszą odpowiednio 1,8 mm i 5,1 mm (rycina 1). Przymocuj odwracalnie urządzenie z PDMS do szkiełka przedmiotowego, dociskając je do szkiełka (lub innego odpowiedniego podłoża) i usuwając pęcherzyki powietrza [5]. Odwracalne mocowanie pozwala na wielokrotne wykorzystanie urządzenia. Metodę tę można stosować również w przypadku urządzeń trwale związanych, ale nie jest to wymagane.
   2. Napełnij urządzenie cieczą. Hydrofobowy charakter PDMS oraz hydrofilowy charakter szkła pomagają w przesunięciu kropli umieszczonej na wlocie lub wylocie do wnętrza kanału. Jeśli kropla cieczy nie wpływa do kanału samoistnie lub jeśli do kanału dostaną się pęcherzyki, użytkownik może nałożyć kroplę cieczy na wlot lub wylot i użyć pipety z przeciwnego końca, aby wciągnąć ciecz przez kanał. Inną metodą ułatwiającą wprowadzenie cieczy do kanału jest oddzielenie urządzenia z PDMS od szkiełka i delikatne oczyszczenie obu elementów etanolem. Przywraca to PDMS-owi i szkiełku odpowiednio ich właściwości hydrofobowe i hydrofilowe, które mogły ulec osłabieniu z czasem i w wyniku użytkowania.
   3. Po napełnieniu urządzenia cieczą, umieść małą kroplę na wlocie i większą kroplę na wylocie. Upewnij się, że zachodzi pompowanie pasywne, obserwując zapadanie się małej kropli na wlocie oraz przepływ cieczy w stronę wylotu. Ponownie sprawdź, czy wewnątrz kanału nie ma pęcherzyków powietrza.
   4. Korzystając ze startowego zestawu do mikrodozowania VHS firmy The Lee Company [3], złóż jeden lub więcej zaworów (konfiguracja zaworów na rycini 2), składających się z zaworu Lee VHS M/2 24 V, dysz 0,062 MINSTAC o rozmiarze otworu 0,0100", adaptera Lee 0,062 Minstac do miękkich rurek, sterownika Lee Spike and Hold Driver (do kontroli przez użytkownika, niewidoczny na rysunku) oraz zestawu przewodów prowadzących (łączących zawór ze sterownikiem Spike and Hold Driver, niewidoczny na rysunku).
   5. Łatwym sposobem mocowania zaworów jest zastosowanie miniaturowych uchwytów Bioscience tools (rycina 2) [4]. Umożliwiają one precyzyjne celowanie i utrzymanie zaworu w określonej pozycji podczas eksperymentu poprzez przyklejenie zaworu do jednego końca uchwytu i zastosowanie podstawy magnetycznej (niewidocznej na rysunku) z drugiej strony.
   6. Stwórz system zbiorników, który zostanie umieszczony kilka stóp nad urządzeniem mikrofluidycznym z PDMS (w naszym przypadku użyliśmy strzykawek o pojemności ¾ uncji otwartych na otoczenie, patrz rycina 2). Zbiornik zapewnia ciśnienie hydrostatyczne napędzające dysze, przy czym ciśnienie jest proporcjonalne do wysokości zbiornika. Alternatywnie, zawory dysz mogą być poddawane ciśnieniu na różne sposoby (np. za pomocą gazu sprężonego). Przymocuj igłę strzykawki do strzykawki. Typowa igła strzykawki łatwo wpasuje się w rurkę o średnicy wewnętrznej 1,14 mm. Rurka 1,14 mm zostanie następnie łatwo połączona z rurką o średnicy wewnętrznej 1,58 mm (1/16”), która z kolei łączy się z adapterem „Soft Tube Adapter” zaworu. Aby zapobiec wyciekom cieczy na połączeniu rurek 1,14 mm i 1,58 mm, można użyć PDMS jako uszczelniacza. Po utworzeniu linii między igłą strzykawki a zaworem Lee Co., napełnij zbiorniki strzykawek cieczą. Dodatkowa strzykawka i zawór mogą pomóc w procesie odpowietrzania (pokazane, ale nieoznaczone na rycini 2). Umieść magnes obok zaworu; w ten sposób odpowietrza się te zawory (są to zawory elektromagnetyczne normalnie zamknięte) i obserwuj, jak ciecz zaczyna płynąć ze zbiornika przez zawór i wypływać przez dyszę 0,0100’’.
   7. Skalibruj system, wybierając czas otwarcia zaworu (czas otwarcia to czas, w którym zawór pozwala na przepływ cieczy w ramach jednego impulsu) oraz częstotliwość (liczba impulsów na sekundę). Aktywuj jeden zawór przez wybrany czas (około minuty, należy zapamiętać całkowity czas pracy). Zważ ciecz, która wypłynęła z zaworu. Znając całkowity czas pracy, częstotliwość i czas otwarcia na impuls, oblicz ilość gramów na milisekundę wydzielaną z zaworu. Ta wartość „gramów na milisekundę” pozwoli dobrać czas otwarcia dla dowolnej objętości, jaką użytkownik chce podać z zaworu.

Przykład: System aktywowany przez minutę (60 sekund). Częstotliwość wynosiła 15 Hz (15 impulsów w jednej sekundzie). Czas otwarcia pojedynczego impulsu wynosił 20 milisekund (ms).

(20ms)(15Hz)(60s)=18000ms.

Oznacza to, że z 60 000 ms w ciągu jednej minuty zawór był faktycznie otwarty przez 18 000 ms.
Przyjmijmy, że masa podanego płynu wynosiła 5 gramów. Wówczas,

5 g / 18000 ms = 2,78e^-4 g/ms.

W przypadku wody, której gęstość wynosi jeden gram na mililitr (mL),

2,78e^-4 g/ms = 2,78e^-4 mL/ms.

Po kalibracji objętość kropli zależy od czasu otwarcia. Na przykład, przy czasie otwarcia wynoszącym 20ms i przy zachowaniu wszystkich parametrów takich samych jak w poprzednim przykładzie,

(2,78e^-4 mL/ms)(20 ms) = 5,56e^-3 mL = 5,56 μL.

Aby wyznaczyć czas otwarcia y niezbędny do utworzenia kropli o objętości x mikrolitrów (μL),

(x μL) / [(2,78e^-4 mL/ms)(1000 μL/mL)] = y ms

8) Skieruj jedną lub więcej dysz do wlotu urządzenia PDMS (rycina 3). Po skalibrowaniu systemu oblicz objętość wypływającą z każdego zaworu, opierając się na wymiarach urządzenia mikrofluidycznego. W przypadku pasywnego pompowania z dużą prędkością (w celu uzyskania maksymalnego natężenia przepływu), oblicz objętość kropli wlotowej niezbędną do wytworzenia kropli, która posiada kąt zwilżania 90deg z powierzchnią wlotową [2]. W celu tworzenia pakietów oblicz częstotliwość i czasy otwarcia zaworów oraz synchronizację zaworów niezbędną do aktywacji dwóch zaworów sekwencyjnie. Jak pokazano na rycini 3, dwie dysze mogą być skierowane do wlotu. Metodę tę można rozszerzyć na wiele dysz, wszystkie skierowane do wlotu kanału.

Reprezentatywne wyniki:

Po prawidłowej kalibracji, przy odpowiednio obliczonych czasach otwarcia zaworu i właściwym skierowaniu dysz na wlot, użytkownik powinien zaobserwować przepływ pompowany pasywnie (rycina 4). Z zaworu powinien wydostać się strumień cieczy i dotrzeć do wlotu. W momencie dotarcia cieczy do wlotu następuje natychmiastowe zapadnięcie się kropli wlotowej do kanału, w kierunku wylotu. Ciecz wewnątrz kanału przemieszcza się wyłącznie podczas zapadania się kropli wlotowej. Całkowity ruch płynu w kanale ustaje wraz z końcem zapadania się kropli, co zapewnia natychmiastowe zatrzymanie płynu i wyraźnie zdefiniowane granice fluidyczne (w przypadku przepływu wielu cieczy). Czas zapadania się kropli zależy od promienia portu wlotowego oraz objętości kropli wlotowej [1]. W naszej konfiguracji i projekcie eksperymentalnym zapadanie się kropli wlotowej następuje w ciągu kilku milisekund.

Rysunek 1. Mikrofluidyczne urządzenie PDMS z jednym wlotem po lewej i jednym wylotem po prawej stronie. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rycina 2. System zbiornika i konfiguracja zaworu. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Rycina 3. Dwa zawory, oba skierowane do jednego wlotu urządzenia mikrofluidycznego. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 3.

Rysunek 4. Sekwencja kroków czasowych (33 milisekund) zapadania się kropli wlotowej po wyrzucie cieczy z zaworu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 4.

Dyskusja

1. W przypadku szybkiego pompowania pasywnego, przy wyborze odpowiedniej kombinacji częstotliwości i objętości pojedynczego impulsu (wynikającej z poprawnego czasu otwarcia), użytkownik powinien zaobserwować obraz przypominający statyczną kroplę lub otoczkę przy wlocie oraz bardzo szybki przepływ wewnątrz kanału. Jeśli występuje przepełnienie, czas otwarcia i/lub częstotliwość są zbyt wysokie.
2. Aby wykryć oddziaływania między pędem a napięciem powierzchniowym, użytkownik powinien pompować jeden impuls na raz i obserwować środowisk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sylgard 184 Silikonowa podstawa elastometryczna	Dow Corning	Nr karty charakterystyki: 01064291
Sylgard 184 Utwardzacz z elastometru silikonowego	Nr karty charakterystyki	Dow Corning
Mikrodozowanie VHS Zestaw startowy	The Lee Company	IKTX0322000A
Miniaturowe uchwyty	Narzędzia biologiczne	MH-2
LabVIEW	National System sterowania przyrządami
Rurki o średnicy wewnętrznej 1,14 mm	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/7
1,57 mm	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/10
20 ml BD™ Strzykawka Luer-Lok Tip, niesterylna	BD Biosciences	301032
http://www.theleeco.com. http://www.biosciencetools.com/Catalog/mHolders.htm.