Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Leczenie cukrzycy typu 1 jest obciążeniem zarówno dla jednostki, jak i społeczeństwa, generując roczne koszty przekraczające 100 miliardów dolarów. Pomimo powszechnego stosowania monitorowania glikemii i nowych preparatów insuliny, u wielu osób nadal rozwijają się wyniszczające powikłania wtórne. Transplantacja wysepek trzustkowych może przywrócić niemal prawidłową kontrolę poziomu glukozy u pacjentów z cukrzycą1bez ryzyka wystąpienia ciężkich epizodów hipoglikemii związanych z intensywną insulinoterapią. Zapewnienie odpowiedniej masy wysepek jest kluczowe dla sukcesu transplantacji wysepek. Jednakże charakterystyka dawców, sposób pozyskania oraz konserwacja narządów wpływają na końcowy wynik izolacji2Na Uniwersytecie Illinois w Chicago (UIC) opracowaliśmy skuteczny protokół izolacji z ulepszonym gradientem oczyszczania3Program rozpoczął się w styczniu 2004 roku i do listopada 2008 roku wykonano ponad 300 izolacji. Trzustki przesyłano w chłodnych roztworach do konserwacji (UW, University of Wisconsin lub HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate)4-7do Laboratorium Izolacji Komórek w UIC w celu izolacji wysepek. Wysepki trzustkowe zostały wyizolowane metodą UIC, która jest zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Ricordiegoi in. 8Zgodnie z opisem w Części I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki, ludzka trzustka została przycięta, kaniulowana, przepłukana i poddana trawieniu. Po pobraniu i inkubacji w roztworze UW przez co najmniej 30 minut, tkankę umieszczono w separatorze komórek (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) w celu puryfikacji.3Po oczyszczaniu określono wydajność wysepek (wyrażoną jako ekwiwalenty wysepek, IEQ), objętość tkanki oraz stopień czystości zgodnie ze standardowymi metodami9Wyizolowane wyspy hodowano w pożywce CMRL-1066 (Mediatech, Herndon, VA), uzupełnionej o 1,5% albuminy ludzkiej, 0,1% insulinowo-transferryno-selenowej (ITS), 1 ml cyprofloksacyny, 5 ml 1M HEPES oraz 14,5 ml 7,5% wodorowęglanu sodu, w kolbach T175 w temperaturze 37°C w hodowli nocnej przed transplantacją wysp lub ich wykorzystaniem w badaniach.
Protokół
1. Oczyszczanie wysepek
- Aby rozpocząć procedurę oczyszczania wysepek, napełnij worek COBE, zaklempsuj wszystkie przewody z wyjątkiem zielonego i ustaw prędkość na 1 500 oraz super out na 0.
- W komorze z laminarem przygotuj pompę oraz zlewki z gradientami i podłącz przewód do zbierania do zielonego przewodu.
- Można teraz rozpocząć ładowanie Ficoll 1.100: naciśnij „spin”, dodaj 110 ml Ficoll 1.100 do przedniej zlewki i uruchom pompę, aby napełnić worek COBE. W miarę ładowania Ficollu naciśnij super out, zatrzymaj pompę, odepnij zacisk z głowicy pompy i ustaw prędkość super out na 100.
- Gdy Ficoll dotrze do zlewki i całe powietrze zostanie usunięte z przewodów, ponownie zaklempsuj głowicę pompy. Ustaw prędkość wirowania (spin speed) na 3 000, a prędkość super out na 0.
- Przygotuj się teraz do ładowania gradientów, wlewając gradient ciężki do przedniej zlewki. Lekko poluź zacisk między dwiema zlewkami, aby usunąć powietrze. Następnie wlej gradient lekki do tylnej zlewki.
- Włącz mieszadło magnetyczne, naciśnij „spin” w urządzeniu COBE, zdejmij zacisk z przewodu łączącego obie zlewki i wizualnie sprawdź, czy gradienty ciężki i lekki mieszają się.
- Gdy gradienty zaczną się mieszać, włącz wirówkę. Odczekaj jedną minutę, a następnie uruchom pompę, aby załadować mieszające się gradienty.
- Aby załadować tkankę, pozwól, aby poziom gradientu w przedniej zlewce opadł, ale nie na tyle nisko, by powietrze mogło dostać się do przewodu doprowadzającego, następnie ponownie zaklempsuj przewód łączący zlewki i załaduj tkankę.
- Kontynuuj dodawanie pozostałej tkanki. Następnie przemyj probówkę, w której znajdowała się tkanka, 50 ml roztworu piorącego i użyj go do wypłukania przedniej zlewki.
- W momencie, gdy ostatnia część tkanki trafi do worka, jednocześnie zatrzymaj pompę, odepnij zacisk z głowicy pompy i zaklempsuj przewód powyżej worka. Kontynuuj wirowanie przez 5 minut.
- Podczas wirowania przenieś 12 probówek do zbierania do komory z laminarem i poluź ich nakrętki. Podłącz przewód do zbierania do żółtego przewodu i umieść sterylną końcówkę do zbierania w probówce stożkowej nr 1. Następnie odepnij zacisk z żółtego przewodu i zaklempsuj zielony przewód.
- Po zakończeniu wirowania powoli zwiększ Superout do 100. Zbierz 150 ml do probówki 1. Następnie zbierz po 30 ml do probówek 2-12 (od 200 do 230 ml).
- Po zakończeniu zbierania naciśnij „STOP” w urządzeniu COBE. Po zakończeniu oczyszczania wysepki mogą zostać poddane ocenie i hodowli.
2. Pobieranie próbek i hodowla
- Po zebraniu frakcji oczyszczonych wysepek, pobierz próbkę z każdej z 12 probówek do zbierania i zabarw ditiizonem. Barwienie pozwoli określić, które warstwy zawierają wysepki o wysokiej czystości, a które o niskiej czystości.
- Zbierz tkanki o wysokiej i niskiej czystości i połącz je odpowiednio w osobne grupy.
- Wwiruj i przemyj dwukrotnie. Po drugim przemyciu uzupełnij objętość każdej z grup do 250 ml za pomocą medium do końcowego przemywania (Final Wash media).
- Aby ocenić połączone frakcje, pobierz dwie próbki po 1 ml z frakcji o wysokiej czystości oraz jedną próbkę 1 ml z frakcji o niskiej czystości. Przenieś każdą próbkę 1 ml do probówki stożkowej zawierającej 9 ml roztworu do przemywania.
- Następnie przenieś 1 ml z każdej probówki 15 ml do komory licznikowej. Obejrzyj i policz komórki pod mikroskopem.
- Po policzeniu komórek oblicz liczbę kolb potrzebnych do hodowli wysepek, korzystając z następującego wzoru: (całkowita liczba EIN / czystość wysepek zapisana ułamkowo) / (30 000 EIN na kolbę). Na przykład 100 000 wysepek o czystości 90% hoduje się w 4 kolbach.
- Przenieś wysepki do kolb T175 i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37˚C i przy 5% CO2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo znaczących postępów w technikach izolacji wysepek trzustkowych u ludzi, wydajność uzyskiwania wysepek pozostaje wysoce zmienna i nieprzewidywalna. Oczyszczanie strawionej tkanki trzustki jest kluczowe dla odzyskania wystarczającej masy wysepek po udanym trawieniu enzymatycznym w celu przeprowadzenia transplantacji. Zaleca się metodę oczyszczania UIC, ponieważ za pomocą tej metody wykazano lepszą odzyskiwalność wysepek ludzkich o wysokim stopniu czystości. Ponadto, w jednym cyklu oczyszczania w systemie Cobe można ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Wspierane przez fundusze z University of Illinois at Chicago, a także grant NIH dla Islet Cell Resource Center (RFA-RR 05-003), Christopher Foundation, Efroymson Foundation oraz Tellabs Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Wirówka | wyposażenie | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Procesor komórek Cobe 2991 | sprzęt | Gambro. BCT | 2556 | oczyszczanie wysepek trzustkowych |
| Mikroskop odwrócony MZ6 TLBD4.1 | wyposażenie | Leica Microsystems | 4103 | |
| Szalka do hodowli komórkowej z siatką 2 mm | wyposażenie | Nalge Nunc international | 174926 | liczenie wysepek |
| Cyfrowy celownik DS L1 | wyposażenie | Nikon Instruments | 217267 | |
| workek COBE | sprzęt jednorazowy | Roztwór O.R. | 66707003 | |
| kolba do hodowli T175 | sprzęt jednorazowy | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| roztwór University of Wisconsin (UW) | odczynnik | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) | odczynnik | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | odczynnik | Bichrom AG | L6155 | |
| podłoże M199 (roztwór do płukania) | odczynnik | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Ostatnie przemycie/pożywka hodowlana | odczynnik | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dytyzon | odczynnik | Sigma-Aldrich | D5130 |
Bibliografia
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
