Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Podsumowanie

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Streszczenie

Drosophilajest wiodącym modelem genetycznym w badaniach nad rozwojem embrionalnym oraz funkcjonalną neuronauką. Tradycyjnie dziedziny te są od siebie dość odizolowane, z w znacznym stopniu niezależnymi historiami i społecznościami naukowymi. Jednakże punktem styku między tymi zazwyczaj rozbieżnymi obszarami są programy rozwojowe leżące u podstaw nabywania funkcjonalnych właściwości sygnalizacji elektrycznej oraz różnicowania funkcjonalnych synaps chemicznych podczas końcowych faz formowania obwodów neuronalnych. Ten punkt styku stanowi krytycznie ważny obszar badań. WDrosophilate fazy rozwoju funkcjonalnego następują w okresie <8 godzin (w 25°C) podczas ostatniej trzeciej części embriogenezy. Ten późny okres rozwojowy przez długi czas uważano za niepodatny na badania ze względu na odkładanie się twardej, nieprzepuszczalnej kutykuli naskórkowej. Przełomem było zastosowanie wodopolimeryzującego kleju chirurgicznego, który można aplikować miejscowo na kutykulę, co umożliwia kontrolowaną sekcję embrionów w późnym stadium. Poprzez nacięcie podłużne na grzbiecie embrion można rozłożyć płasko, eksponując brzuszny sznur nerwowy oraz mięśnie ściany ciała do badań eksperymentalnych. Można wtedy zastosować techniki patch-clamp w konfiguracji whole-cell do rejestracji sygnałów z pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów i mięśni somatycznych. Konfiguracje rejestracyjne te były wykorzystywane do śledzenia pojawienia się i dojrzewania prądów jonowych oraz propagacji potencjałów czynnościowych zarówno w neuronach, jak i w mięśniach. Scharakteryzowano mutanty genetyczne wpływające na te właściwości elektryczne, aby ujawnić skład molekularny kanałów jonowych i powiązanych kompleksów sygnalizacyjnych oraz rozpocząć badanie molekularnych mechanizmów różnicowania funkcjonalnego. Szczególną uwagę poświęcono tworzeniu połączeń synaptycznych, zarówno w ośrodkowym układzie nerwowym, jak i na obwodzie. Glutaminergiczne złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest najbardziej dostępne dla kombinacji obrazowania optycznego i rejestracji elektrofizjologicznej. Szklana elektroda ssąca służy do stymulacji nerwu obwodowego, a rejestracje prądów złącza pobudzającego (EJC) przeprowadza się w mięśniu w warunkach clampowania napięcia. Konfiguracja rejestracyjna ta była wykorzystywana do mapowania różnicowania funkcjonalnego synapsy oraz śledzenia pojawienia się i dojrzewania właściwości uwalniania glutaminianu w terminalu presynaptycznym. Dodatkowo właściwości postsynaptyczne można badać niezależnie poprzez jontoforezę lub aplikację glutaminianu pod ciśnieniem bezpośrednio na powierzchnię mięśnia, aby zmierzyć pojawienie się i dojrzewanie pól receptorów glutaminianowych. W ten sposób elementy przed- i postsynaptyczne mogą być monitorowane oddzielnie lub w połączeniu podczas embrionalnej synaptogenezy. System ten był intensywnie wykorzystywany do izolacji i charakterystyki mutantów genetycznych upośledzających tworzenie synaps w okresie embrionalnym, co pozwala ujawnić molekularne mechanizmy sterujące specyfikacją i różnicowaniem połączeń synaptycznych oraz funkcjonalnymi właściwościami sygnalizacji synaptycznej.

Protokół

Część 1: Sprzęt i materiały

1. Rejestracja elektrofizjologiczna z zarodków Drosophila wymaga w pierwszej kolejności biegłości w technikach mikrodysekcji zarodków, które opisano w innym filmie JoVE.
2. Rejestracja elektrofizjologiczna z zarodków Drosophila wykorzystuje standardowe konfiguracje zapisu metodą patch clamp. Sprzęt i oprogramowanie do rejestracji patch clamp odpowiednie dla wielu innych preparatów nadają się również do badań zarodków Drosophila. Ponieważ zarodki Drosophila są podczas dysekcji przyklejane do szkiełka nakrywkowe, komora pomiarowa powinna umożliwiać stosowanie szkiełek nakrywkowych. Grubość preparatu oraz sposób jego zamocowania do szkiełka wymagają zastosowania mikroskopu odwróconego z doskonaczną optyką DIC i obiektywem o długiej odległości roboczej.
3. Do rejestracji elektrofizjologicznej stosuje się dwa rodzaje roztworów kąpieli: 1) solanki „standardowe” (Jan and Jan, 1976a) lub „modyfikowane standardowe” (Broadie, 2000), oparte na roztworach powszechnie stosowanych do rejestracji w innych systemach bezkręgowców, oraz 2) solanki „podobne do hemolimfy” (HL) (Stewart et al 1994), stanowiące kompromis między solanką standardową a stężeniami jonowymi zmierzonymi w hemolimfie Drosophila. Należy zaznaczyć, że żadna z tych solanek nie odzwierciedla dokładnie stężeń jonowych mierzonych w hemolimfie, które są niekorzystne dla procesu rejestracji (Broadie, 2000). Solanka standardowa zawiera (w mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl₂, 1.8 CaCl2, 72 sacharozy, 5 TES, pH 7.2.

Część 2: Konfiguracja rejestracji

1. W eksperymentach fizjologicznych preparat z wypreparowanego zarodka umieszcza się w niewielkiej komorze rejestracyjnej z pleksiglasu (<0,5 ml) i obserwuje w świetle przechodzącym za pomocą pionowego mikroskopu złożonego, wyposażonego w optykę kontrastu interferencyjnego (Nomarskiego) oraz obiektyw imersyjny w wodzie 40-100X (zazwyczaj 40X) o dużej odległości roboczej (Broadie and Bate, 1993a). Rejestracje wykonuje się zazwyczaj w temperaturze poniżej pokojowej (16-22°C), gdyż przy wyższych temperaturach (22+°C) proces ten staje się trudniejszy. Osiągamy to poprzez chłodzenie pomieszczenia, a nie samego preparatu.
2. Pipety do techniki patch-clamp można wyciągać z różnych rodzajów szkła wypełnionego włóknem (np. szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1 mm), a ich końcówki należy wypolerować termicznie do końcowej rezystancji 5-10 MΩ. W kąpieli umieszcza się przewód uziemiający z chlorku srebra. Sygnały są wzmacniane za pomocą wzmacniacza patch-clamp (np. Axopatch-1D, Axon Instruments), filtrowane za pomocą 8-biegunowego filtra Bessela przy 2-10 Hz, a następnie próbkowane w czasie rzeczywistym lub zapisywane cyfrowo do późniejszej analizy.
3. Konwencjonalne rejestracje patch-clamp wykonuje się najczęściej w temperaturze 18°C, używając pipet wyciągniętych z borokrzemianowego szkła wypełnionego włóknem (końcówki wypolerowane termicznie do średnicy wewnętrznej ~1 µm). Rejestracje prądów prowadzi się z zidentyfikowanych wielojądrowych włókien mięśniowych w trybie voltage-clamp (standardowe potencjały podtrzymujące od –60 do –80 mV) (Broadie and Bate, 1993a-d; Broadie et al., 1997; Fergestad et al., 1999; Featherstone et al., 2000). Roztwór w pipecie zawiera (w mM): 120 KCl, 20 KOH, 4 MgCl₂, 0,25 CaCl₂, 5 EGTA, 4 Na₂ATP, 36 sacharozy oraz 5 TES, buforowany do pH 7,2. Elektrody rejestracyjne są napełniane wstecznie.

Część 3: Rejestracja aktywności mięśni

1. Zasada jest taka, że w tym preparacie można rejestrować aktywność dowolnego mięśnia zarodkowego. W praktyce większość pomiarów koncentrowała się na dużych, brzusznych mięśniach podłużnych w najgłębszej warstwie mięśniowej (Bate, 1990; Broadie i Bate, 1993a-c). Rejestracje przeprowadzano również z mięśni grzbietowych i bocznych tej warstwy (Kidokoro i Nishikawa, 1994; Auld et al. 1995; Nishikawa i Kidokoro, 1995; Baumgartner at al. 1996). Jednak większość eksperymentów skupia się na grupie czterech podłużnych mięśni brzusznych (6,7,12,13), w szczególności na mięśniu 6 w przedniej części odwłoka (A2-A3).
2. Przed rejestracją z mięśni w młodych zarodkach (<16 h AEL) nie jest wymagana obróbka enzymatyczna. Jednak w późniejszym stadium rozwoju zarodka (>16 h AEL) rozwija się pochewka mięśniowa, którą przed rejestracją metodą patch-clamp należy usunąć za pomocą kolagenazy (kolagenaza typu IV, 1 mg/ml w soli fizjologicznej wolnej od kationów dwuwartościowych, 0,5-2 min w RT). Po obróbce enzymatycznej rezystancje uszczelnienia na mięśniu wynoszą zazwyczaj >1 GΩ.
3. Rejestracje metodą patch-clamp z mięśni zarodkowych można przeprowadzać przy użyciu szeregu standardowych technik (Broadie i Bate 1993a-c; Broadie et al. 1994, 1995, 1997; Nishikawa i Kidokoro, 1995). Do rejestracji aktywności pojedynczych kanałów w mięśniu lub izolowanych fragmentach błony mięśniowej można zastosować dowolne standardowe warianty patch-clamp — cell-attached, inside-out, outside-out. Aktywność pojedynczych kanałów receptorów glutaminianowych (~12 pA przy -60 mV) jest zazwyczaj obserwowalna w fazie opadającej spontanicznych pobudzeniowych prądów złączy (sEJCs) rejestrowanych w konfiguracji whole-cell.
4. Większość pomiarów wykonuje się w konfiguracji whole-cell, którą łatwo uzyskać ze stanu cell-attached poprzez lekkie zassanie lub impuls elektryczny („buzz”). Z mięśni można rejestrować sygnały zarówno w konfiguracji voltage-clamp (typowe potencjały podtrzymujące od -60 do -80 mV), jak i current-clamp. Mięśni w młodszych zarodkach (<13 h AEL) nie można skutecznie kontrolować metodą voltage-clamp ze względu na silne sprzężenie między zarodkowymi miotubami (Broadie i Bate, 1993a); zazwyczaj nie stanowi to problemu w późniejszych etapach rozwoju (14+ h AEL) (Ueda i Kidokoro, 1996).
5. Rejestracja metodą patch-clamp z perforacją nystatyną może być stosowana do weryfikacji wyników uzyskanych standardowymi technikami whole-cell (Broadie i Bate, 1993a). Roztwór perforujący przygotowuje się w następujący sposób: 10 mg pluroniku F-127 (Molecular Probes p-1572) rozpuszcza się w 20 ml DMSO, a następnie w tym roztworze rozpuszcza się 10 mg nystatyny, aby otrzymać roztwór zapasowy. 100 μl roztworu zapasowego dodaje się do 5 ml przefiltrowanego roztworu do pipet, tworząc roztwór do rejestracji. Prądy whole-cell są zazwyczaj uzyskiwane <3 min po utworzeniu uszczelnienia. W większości przypadków rezystancja szeregowa jest znacznie zwiększona i komórki mogą wykazywać zwiększony prąd upływu (Broadie i Bate, 1993a).
6. Prąd bramkowany napięciowo w konfiguracji whole-cell w dojrzałym mięśniu zarodkowym (i larwalnym) składa się z pięciu głównych komponentów (Wu i Haugland, 1985; Zagotta et al. 1988; Broadie i Bate, 1993b): wewnątrzkomórkowego prądu wapniowego (I_Ca) oraz czterech zewnątrzkomórkowych prądów potasowych (Tsunoda i Salkoff, 1995), w tym dwóch szybkich prądów inaktywujących: bramkowanego napięciowo (I_A) i zależnego od wapnia (I_CF), oraz dwóch opóźnionych prądów nieinaktywujących: bramkowanego napięciowo (I_K) i zależnego od wapnia (I_CS). Do oddzielenia tych prądów z odpowiedzi whole-cell podczas voltage-clamp można wykorzystać eksperymenty z substytucją jonów (Broadie i Bate, 1993b).

Część 4: Stymulacja i rejestracja w złączu nerwowo-mięśniowym

1. Najczęstszą i najbardziej niezawodną metodą stymulacji NMJ jest zastosowanie szklanej elektrody ssącej na segmentowym nerwie obwodowym. Elektrody ssące można wyciągnąć z różnych rodzajów wypełnionych włóknami szkieł elektrodowych (średnica zewnętrzna 1-1,5 μm) i należy je wypalić w celu uzyskania pożądanej konfiguracji (średnica wewnętrzna ~5 μm). Mały odcinek (<50 μm) odpowiedniego segmentowego nerwu ruchowego jest wciągany do pipety za pomocą delikatnego ssania, aby utworzyć szczelne połączenie.
2. Powszechną praktyką jest stymulacja nienaruszonego nerwu poprzez wciągnięcie pętli nerwu w pobliżu punktu wyjścia z OUN. Podejście to umożliwia łatwą stymulację nienaruszonego preparatu, ale ma tę wadę, że spontaniczna aktywność wywołana przez OUN może nałożyć się na zastosowany paradygmat stymulacji. Alternatywą jest stymulacja przeciętego nerwu ruchowego. Można to osiągnąć po usunięciu OUN, choć procedura ta ma tendencję do rozciągania nerwu i może spowodować jego uszkodzenie. Nerw można również przeciąć ostrą szklaną mikroelektrodą, jednak procedura ta jest żmudna i trudna. Zaleca się wykonywanie pomiarów z nienaruszonego preparatu.
3. Stymulację można stosować w różnych paradygmatach. Najlepiej sprawdza się krótka stymulacja (0,2-1 msec), a intensywność stymulacji (zwykle 1-5 V) zależy od konfiguracji ssania i musi zostać określona eksperymentalnie dla każdej komórki. Stymulację ponadprogową nerwu ruchowego najlepiej osiąga się, ustawiając natężenie bodźca nieco powyżej progu (+1-2 wolty). Wywołane odpowiedzi NMJ są rejestrowane z mięśnia poddanego technice patch-clamp, zgodnie z opisem powyżej. Artefakt szokowy można znacznie zmniejszyć, stosując izolowaną wirtualną masę.
4. Mniej niezawodną alternatywą dla standardowej stymulacji nerwu elektrodą ssącą jest bezpośrednia stymulacja ośrodkowego układu nerwowego (Nishikawa and Kidokoro, 1995). Mikroelektrodę wypełnioną 3-4 M KCl (lub KAc) wprowadza się do środka zwoju brzusznego i podaje dodatnie impulsy o natężeniu ~2 microamp i czasie trwania ~2 msec (Dietcher et al. 1998). Końcówka elektrody powinna znajdować się w neuropilu najbliższym hemisegmentowi, w którym pożądana jest stymulacja. Przenoszenie synaptyczne rejestruje się w mięśniu poddanym technice patch-clamp w standardowej konfiguracji.
5. Zarodkowy NMJ jest dostępny do rejestracji metodą whole-cell patch-clamp przez cały okres różnicowania. W przypadku rejestracji pobudzających prądów złącza (EJC), sygnały są rejestrowane za pomocą standardowego wzmacniacza patch-clamp, filtrowane (zwykle przy 1-2 KHz), konwertowane na sygnał cyfrowy za pomocą interfejsu analogowo-cyfrowego i pozyskiwane przez komputer przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.

Część 5: Zastosowania chemiczne i lekowe w złączeniu nerwowo-mięśniowym

1. Każdą małą, naładowaną cząsteczkę można skutecznie wprowadzić do embrionalnego NMJ za pomocą jontoforezy (Aravamudan et al, 1999; Fergestad et al. 1999, 2001). Pipety jontoforetyczne można wyciągać w celu uzyskania konkretnych konfiguracji, stosując je przez zmienne okresy czasu przy użyciu impulsów prądu ujemnego lub dodatniego. Kluczowe jest zapobieganie wyciekom między impulsami poprzez zastosowanie odpowiedniego przeciwstawnego prądu podtrzymującego (Broadie et al. 1993d; Featherstone et al. 2002, 2005; Rohrbough et al. 2007). Wartość tego prądu podtrzymującego zmienia się w zależności od konfiguracji pipety i powinna zostać określona eksperymentalnie.
2. Wiele eksperymentów przeprowadzono z użyciem neuroprzekaźnika NMJ, L-glutaminianu (Jan and Jan, 1976b), wykorzystując roztwór stokowy 100mM (sól jednosodowa; pH 8-9)(Broadie and Bate, 1993c). Wysokoomowe pipety jontoforetyczne (100-200 MΩ) były stosowane do mapowania receptorów glutaminianu (gluR) (Broadie and Bate, 1993d), natomiast pipety o niższej oporności (20-50 MΩ) wykorzystywano do szacowania całkowitej odpowiedzi gluR (Broadie et al. 1995, 1997; Featherstone et al. 2002, 2005; Rohrbough et al. 2007). Krótkie impulsy (0,1-1 ms) prądu ujemnego (~10 nA) sprawdzają się dobrze, przy zastosowaniu niewielkiego, dodatniego prądu podtrzymującego w celu zapobiegania wyciekom.
3. Cząsteczki nieładowane i naładowane można aplikować poprzez wtryskiwanie ciśnieniowe (Fergestad and Broadie, 2001; Featherstone et al. 2001). W celu aplikacji pipetę do wtryskiwania ciśnieniowego (<5 μm średnicy wewnętrznej) zawierającą roztwór umieszcza się blisko (<10 μm) zakończenia nerwowego. Roztwór do wtryskiwania można aplikować za pomocą picospritzera (5-10 psi) lub innego źródła sprężonego powietrza (Featherstone et al., 2002). Podczas przedłużających się eksperymentów komora rejestracyjna (objętość <0,5 ml) powinna być stale perfundowana (0,1 - 0,2 ml/sec) standardowym roztworem soli fizjologicznej do kąpieli.
4. Wiele eksperymentów przeprowadzono z użyciem hiperosmotycznego roztworu soli w celu wywołania fuzji pęcherzyków synaptycznych (Broadie et al. 1995; Aravamudan, et al., 1999; Fergestad et al., 1999; Featherstone, et al., 2000, 2002). Inne eksperymenty przeprowadzono z użyciem toksyn, takich jak argiotoksyna 636 przeciwko receptorom glutaminianu oraz jad czarnej wdowy zawierający latroinsektotoksynę (Broadie et al. 1995).

Część 6: Uzupełniające techniki obrazowania witalnego złączy nerwowo-mięśniowych

1. Kinetykę pęcherzyków synaptycznych można monitorować za pomocą fluorescencyjnych lipofilnych barwników styrylowych (Fergestad and Broadie, 2001; Rohrbough et al. 2004). Można bezpośrednio obserwować rozkład pęcherzyków oraz mierzyć tempo endocytozy i egzocytozy. Stworzono kilka wariantów o różnych właściwościach fluorescencyjnych (FM1-43, podobny do fluoresceiny; FM4-64, podobny do rodaminy). Modyfikacje oryginalnego barwnika pozwoliły uzyskać produkty o zmienionych właściwościach hydrofobowych, a tym samym o innej kinetyce wypłukiwania; np. FM2-10 dysocjuje z błony znacznie szybciej.
2. Aby oznakować embrionalne NMJ barwnikami styrylowymi, można wprowadzić 10 µM FM1-43 przez 1-5 minut, stosując podwyższone stężenie potasu zewnątrzkomórkowego (50-90 mM) (Fergestad and Broadie, 2001). Bardziej fizjologiczne podejście można osiągnąć poprzez stymulację za pomocą ssącej elektrody nerwowej. Następnie preparaty wielokrotnie płucze się w buforze pozbawionym Ca²⁺ przez 5 minut, a następnie mierzy się pozostałą fluorescencję (reprezentującą zabarwione pęcherzyki synaptyczne). Aby zmierzyć egzocytozę, można usunąć barwnik, stosując albo podwyższone stężenie potasu, albo elektryczną stymulację nerwu.
3. Wyprodukowano białka fuzyjne z wariantami GFP, co pozwala na wielokolorowe znakowanie synapsy embrionalnego NMJ (Brand, 1999; Zhang et al. 2002). Dostępnych jest wiele linii transgenicznych wykazujących ekspresję białek znakowanych GFP, w tym ogólne markery błonowe (np. mCD8-GFP), markery postsynaptyczne (np. Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), cytoszkieletowe (np. actin-GFP, moesin-GFP, tubulin-GFP), mitochondrialne (np. Cytochrome C-GFP) oraz markery pęcherzyków synaptycznych (np. synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP; Zhang et al., 2002).
4. Reportery GFP znakują przedziały komórkowe o wysokiej dynamice i mogą być używane do oceny cech rozwojowych lub fenotypów mutantów (Featherstone and Broadie, 2000). Wykazano, że fotowygaszanie i późniejsza obserwacja powrotu fluorescencji (FRAP) jest możliwa, przynajmniej w NMJ larv Drosophila (Zhang et al., 2002; Yan and Broadie, 2007). Należy jednak zachować ostrożność: niektóre z tych markerów nie przywracają w pełni funkcji u mutantów null i mogą nawet zmieniać normalną fizjologię NMJ.

Część 7: Rejestracja aktywności centralnych neuronów ruchowych

1. Wiele neuronów embrionalnych można indywidualnie zidentyfikować na podstawie położenia somy i morfologii projekcji (Bate i Martinez-Arias, 1993; Goodman i Doe, 1993; Landgraf et al 1997). Ponadto system GAL4/UAS (Brand i Perrimon, 1993) umożliwia celowaną ekspresję GFP w celu wizualizacji identyfikowalnych populacji neuronów (Baines et al., 1998). Dotychczasowe badania rejestracyjne koncentrowały się na grupie pięciu powierzchownych neuronów grzbietowych w embrionalnym brzusznym sznurze nerwowym (VNC); czterech neuronach ruchowych (aCC i RP1-4) oraz jednym interneuronie pCC (Baines et al., 1998, 1999, 2001; Rohrbough i Broadie, 2002; Featherstone et al. 1995).
2. Ciała komórek zidentyfikowanych neuronów są dostępne dla elektrod do rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. W pierwszej kolejności należy usunąć osłonkę neurolemy VNC poprzez krótką, ogniskową obróbkę proteazą (Baines i Bate, 1998; Baines et al., 1999; Rohrbough i Broadie, 2002). Grzbietowe ciała komórek neuronalnych odsłania się za pomocą pipety patch o dużej średnicy (~20 µm) zawierającej 0,5-1% proteazy (typ XIV (Sigma) w soli rejestracyjnej). Materiał osłonki OUN jest wciągany przez ssanie do końcówki pipety przez 1-2 minuty, aż do momentu przerwania osłonki (Featherstone et al. 1995). Aby potwierdzić tożsamość komórkową podczas rejestracji, do roztworu patch można dodać lucifer yellow (sól dipotasowa, 1-2 mg/ml) w celu wizualizacji położenia i morfologii komórki.
3. Można przeprowadzić standardowe rejestracje metodą voltage-clamp i current-clamp w konfiguracji whole-cell (Rohrbough i Broadie, 2002; Featherstone et al., 2005). Zewnętrzna sól rejestracyjna zawiera (w mM): 140 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl₂, 4 MgCl₂, 5 HEPES, 10 sacharozy, 2 NaOH (pH 7,2). Roztwór patch zawiera (w mM): 140 K-Acetate, 2 MgCl₂, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~6 KOH (pH 7,2). Rejestracje voltage-clamp wykonuje się przy potencjałach podtrzymujących -60 mV w temperaturze 18 °C. Typowe, niekorygowane potencjały spoczynkowe mieszczą się w zakresie od -45 do –65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, średnia ± S.D., n = 78).
4. Dostępne analizy wykazują napięciowo zależne prądy jonowe (Baines i Bate, 1998), powtarzalne potencjały czynnościowe, aktywność pośredniczoną synaptycznie oraz odpowiedzi sterowane agonistą (Baines et al., 2001). Wejście synaptyczne do neuronów ruchowych rejestruje się w formie zarówno szybkich, pośredniczonych przez AP pobudzających prądów synaptycznych (ESCs), jak i okresowych, trwałych (do 1 s czasu trwania) epizodów pobudzenia występujących kilka lub więcej razy na minutę (Baines et al., 1999; Baines et al., 2001).
5. Somy komórkowe reagują na jontoforetycznie podaną acetylocholinę (ACh) oraz inhibitory neurotransmiter GABA (Baines i Bate, 1998; Featherstone et al. 2005). ACh może być podawana jontoforetycznie do somy neuronalnej za pomocą ostrej mikroelektrody zawierającej 100mM ACh w dH₂0, przy pH 4-5, aby sprzyjać jontoforezie agonisty za pomocą prądu dodatniego.

Reprezentatywne wyniki

Brzuszny mięsień podłużny 6 w segmentach A2-A3 jest najczęściej wykorzystywanym celem podczas rejestracji (Broadie and Bate, 1993a-d; Harrison et al. 1994; Sweeney at al. 1995; Renden et al. 2001; Huang et al. 2006; Mohrmann et al. 2008). W dojrzałym embrionie i nowo wyklutym pierwszym stadium larwalnym (20-21 godz. AEL przy 25°C = wykluwanie), pojemność całej komórki mięśnia 6 zazwyczaj wynosi 25-30 pF, a rezystancja wejściowa 20-40 MΩ, co zmienia się wraz z wiekiem rozwojowym. Maksymalne prądy synaptyczne NMJ wahają się od dziesiątek pikoamperów (13-14 godz. AEL) do 1-2 nA (20-21 godz. AEL), gwałtownie rosnąc w funkcji wieku. Bezpośredni pomiar prądów bramkowanych glutaminianem wykazuje maksymalne odpowiedzi od setek pikoamperów (13-14 godz. AEL) do 1,5-4 nA tuż przed wykluciem. Błędy rezystancji szeregowej (całkowity prąd X rezystancja szeregowa) są zazwyczaj <5 mV, ale w dojrzałych embrionach przed wykluciem mogą wynosić nawet ponad 10 mV, dlatego zaleca się kompensację rezystancji szeregowej. Mięśnie embrionalne o średniej średnicy 10-30 μm i średniej długości 40-80 μm wykazują niemal idealne parametry zacisku przestrzennego (space clamp). Stałe czasowe zacisku komórkowego (R_series X C_cell) średnio wynoszą mniej niż 0,25 msec.

W dojrzałym embrionie i nowo wyklutej larwie populacja grzbietowych neuronów ruchowych była poddawana bardziej ograniczonym pomiarom. Rejestracje z som neuronów wykazują pojemność całokomórkową w zakresie 1,8-2,5 pF (średnio 2,0 pF), rezystancję szeregową 40-60 MΩ oraz rezystancję wejściową ~5 GΩ (Baines and Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Komórki te wyraźnie zwiększają swój rozmiar i złożoność podczas dojrzewania embrionalnego, a wzrost ten kontynuowany jest przez cały okres rozwoju larwalnego. W trzecim stadium larwalnym pojemność całokomórkowa wynosi 17-20 pF, rezystancja szeregowa 25-37 MΩ, a średnia rezystancja wejściowa wynosi ~900 MΩ (Rohrbough and Broadie, 2002; Richard Baines, komunikacja osobista). Przewodności jonowe zwiększają się w trakcie rozwoju, jednak gęstość prądu (pA/pF) pozostaje niezwykle stała. W dojrzałych embrionach prądy synaptyczne mają średnią amplitudę 75-100pA, przy czym zarówno szybkie zdarzenia ESC, jak i prądy przedłużone trwają średnio ~500 msec (Baines and Bate, 1998; Featherstone et al 2005). W embrionach zdarzenia te występują średnio 3-5 razy na minutę, zwiększając się do ~20 razy na minutę w pierwszym stadium larwalnym (Richard Baines, komunikacja osobista). Należy zauważyć, że złożoność morfologiczna i właściwości błony neuronów Drosophila sprawiają, że właściwa metoda clampowania napięcia (voltage clamp) w znacznej części komórki poza somą jest praktycznie niemożliwa. Należy zatem interpretować rejestracje z należytą ostrożnością.

Dyskusja

Rejestracja elektrofizjologiczna z embrionów Drosophila wymaga manualnej manipulacji i mikrodysekcji. Stan preparatu, a w konsekwencji jakość rejestracji, zależy od umiejętności szybkiego i starannego przygotowania delikatnych tkanek embrionalnych do pomiaru, a następnie przeprowadzenia eksperymentu. Badacze powinni biegle opanować zarówno techniki dysekcji embrionów, jak i elektrofizjologię metodą patch clamp przed próbą jednoczesnego zastosowania obu tych metod.

Pomiary można przep...