Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda ta jest wykorzystywana do ekstrakcji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0,22 $\mu$M, które zostały potraktowane buforem do przechowywania/lizy i zarchiwizowane w temperaturze -80°C, a następnie do oczyszczania tego DNA przy użyciu gradientu gęstości chlorku cezu. Protokół rozpoczyna się od dwóch jedno-godzinnych etapów inkubacji w celu uwolnienia DNA z komórek i usunięcia RNA. Następnie przeprowadza się serię ekstrakcji fenol:chloroformem i chloroformem, po których następuje wirowanie w celu usunięcia białek i składników błon komórkowych, zebranie wodnego ekstraktu DNA oraz kilka etapów wymiany buforu w celu przemycia i skoncentrowania ekstraktu. Część piąta opisuje opcjonalne oczyszczanie za pomocą gradientu gęstości chlorku cezu. Aby uniknąć pomyłek i skrócić czas trwania procedury, zaleca się pracę z mniej niż 15 próbkami jednocześnie. Całkowity czas wymagany do przeprowadzenia tego protokołu zależy od liczby próbek przeznaczonych do ekstrakcji. W przypadku 10–15 próbek, przy założeniu dostępności odpowiedniego sprzętu do wirowania, cały protokół powinien zająć 3 dni. Przed rozpoczęciem procesu należy upewnić się, że piece do hybrydyzacji zostały ustawione na odpowiednią temperaturę.
Protokół
Uwaga: Wszystkie odczynniki użyte w tym protokole są porcjowane z zapasów laboratoryjnych do mniejszych zapasów roboczych – jest to bardzo ważne, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek DNA oraz zanieczyszczenia zapasów laboratoryjnych. Ponadto podczas pipetowania należy pamiętać o wymianie końcówek pipety przy każdym dodawaniu odczynnika, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
Część pierwsza: Lizy komórek i trawienie
- Protokół należy rozpocząć od rozmrożenia na lodzie filtrów Sterivex zawierających uprzednio skoncentrowaną biomasę planktoniczną. Dla uproszczenia opisano tutaj procedurę przetwarzania pojedynczego filtra. W praktyce zaleca się przetwarzanie maksymalnie 16 filtrów jednocześnie.
- Po rozmrożeniu filtra należy rozpocząć pierwszą z dwóch inkubacji: jedną w celu lizy komórek i usunięcia RNA oraz drugą w celu rozkładu białek. W pierwszej inkubacji do filtra należy dodać 100 μl lizozymu (125 mg w 1000 μl TE) oraz 20 ml RNazy A (10 μg/ml). Filtr należy ponownie uszczelnić Parafilmem i pozostawić w rotacyjnym piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37°C na 1 godzinę.
- Do kolejnej inkubacji do filtra należy dodać 100 μl Proteinazy K oraz 100 μl 20% SDS. Po ponownym uszczelnieniu Parafilmem filtr należy pozostawić w rotacyjnym piecu do hybrydyzacji na kolejne jedną do dwóch godzin, tym razem w temperaturze 55°C.
- Za pomocą strzykawki 5cc należy przenieść lizat z filtra Sterivex do probówki Falcon 15 ml. Filtr należy przepłukać 1 ml buforu do lizy, a ciecz z płukania dodać do lizatu w probówce Falcon za pomocą strzykawki 5cc. Po przeprowadzeniu lizy i trawienia komórek można przystąpić do ekstrakcji DNA.
Część druga: Ekstrakcja DNA
- Kolejnym krokiem jest zastosowanie metody fenolowo-chloroformowej w celu wyekstrahowania DNA z lizatu. Do probówki z lizatem należy dodać taką samą objętość (około 3 ml) mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylkowy (IAA), pamiętając o wymianie końcówek pipety przed każdym dodaniem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Mieszać na wortexie przez 10 sekund do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
- Wirować probówkę z prędkością 2500 g przez 5 minut, upewniając się, że wirówka jest zrównoważona. Podczas wirowania mieszanina fenolowo-chloroformowo-lizatowa powinna rozdzielić się na dwie warstwy: dolną warstwę organiczną zawierającą fenol, chloroform i białka z próbki oraz górną warstwę wodną, składającą się z DNA, wody i innych bardziej hydrofilowych cząsteczek.
- Przenieść warstwę wodną (zawierającą DNA) do nowej probówki typu Falcon o pojemności 15 ml. Należy uważać, aby końcówką pipety nie dotknąć granicy faz (zawsze należy pozostawić niewielką ilość warstwy wodnej).
- Do nowej probówki dodać taką samą objętość (ok. 3 ml) mieszaniny chloroform:IAA, pamiętając o wymianie końcówek pipety przed każdym dodaniem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Mieszać na wortexie przez 10 sekund. Krok ten pomaga usunąć pozostałości fenolu z próbki DNA.
- Wirować z prędkością 2500 g przez 5 minut lub do czasu, aż warstwa wodna stanie się klarowna. Przenieść warstwę wodną do nowej, opisanej probówki typu Falcon i dodać 1 ml buforu TE o pH 8.0, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety granicy faz (zawsze należy pozostawić niewielką ilość warstwy wodnej). Ta warstwa wodna zawiera ekstrakt DNA.
Część trzecia: Oznaczanie stężenia i przemywanie DNA
- Kolejnym krokiem jest przemycie i zagęszczenie próbki DNA w 15 ml probówce wirówkowej Amicon Ultra. Probówki Amicon składają się z filtra, który zatrzymuje cząsteczki o określonej masie cząsteczkowej lub większej (retentat), oraz probówki do zbierania przelywu (filtratu). W tym przypadku filtr zatrzymuje DNA (retentat). Przenieś ekstrakt DNA z kroku 2.5 do komory z filtrem w probówce Amicon Ultra.
- Wiruj przy 3500 g przez 10 minut. Sprawdź, czy w filtrze Amicon pozostało mniej niż 1 ml cieczy. Jeśli pozostało więcej retentatu, napełnij filtr buforem TE i wiruj ponownie. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, przy każdym dodawaniu TE używaj nowej końcówki do pipety.
- Przenieś przelew, czyli filtrat, do innej probówki Falcon i przechowuj go w lodówce do czasu potwierdzenia końcowego produktu DNA na żelu (Część czwarta).
- Dodaj 2 ml buforu TE do filtra Amicon i wiruj przy 3500 g przez 6 minut, pamiętając o użyciu nowej końcówki do pipety przy każdym dodawaniu TE w celu uniknięcia kontaminacji krzyżowej. Połącz filtrat z tym z kroku 3.3 i przechowuj w lodówce.
- Przemyj DNA dwukrotnie więcej buforem TE, tak aby łącznie wykonać trzy przemycia (zawsze używając nowej końcówki do pipety), za każdym razem zachowując filtrat (zgodnie z krokami 3.3 i 3.4). Podczas ostatniego przemycia wiruj do momentu, aż w filtrze Amicon pozostanie od 200 do 500 µl retentatu. Zanotuj końcową objętość i przenieś retentat (zawierający DNA) do opisanej probówki Eppendorf 1.5 ml.
Część czwarta: Ocena jakości DNA
- Sprawdź jakość DNA i oszacuj jego stężenie, przeprowadzając elektroforezę próbek w 0,8% żelu agarozowym zabarwionym 1ml bromkiem etydyny (EtBr) przez noc. (Zachowaj szczególną ostrożność podczas używania EtBr – jest on znanym mutagenem i podejrzewanym kancerogenem. Pamiętaj o częstej zmianie rękawiczek i unikaj przenoszenia EtBr do pozostałych części laboratorium oraz na skórę). Nałóż próbki obok markerów wielkości DNA, które służą jako standardy wielkości i intensywności (patrz następny krok).
- W pierwszych kilku studzienkach nałóż markery z prążkami o różnych masach cząsteczkowych i stężeniach. Zalecamy następujący schemat nakładania: w pierwszej i ostatniej studzience (zewnętrznych) nałóż 10 μl markera 1kb+ lub 2log o stężeniu 50ng/μl. W studzienkach 2, 3 i 4 nałóż odpowiednio 2 μl, 5 μl i 10 μl markera λHindIII o stężeniu 50ng/μl. Na koniec nałóż 5 μl ekstraktu DNA z barwnikiem do każdej z próbek w osobnych studzienkach.
- Prowadź elektroforezę przy napięciu 15 V przez około 16 godzin (zalecamy prowadzenie procesu przez noc).
- Następnego dnia wykonaj zdjęcie żelu za pomocą systemu dokumentacji żeli UV. Aby określić zakres masy cząsteczkowej oraz stężenie DNA, porównaj prążki próbek z prążkami markerów. DNA dobrej jakości będzie miało wysoką masę cząsteczkową (>36kb) i nie będzie wykazywać oznak ścinania/degradacji. Patrz Rycina 1.
Część piąta: Centryfugacja w gradiencie chlorku cezu
- Jeśli jakość DNA jest dobra, a ilość wystarczająca, można przystąpić do oczyszczania DNA poprzez wirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl). Należy pamiętać, że ten etap oczyszczania jest opcjonalny i nie jest konieczny dla wszystkich dalszych zastosowań (na przykład w przypadku tworzenia bibliotek fosmidów oczyszczanie POWINNO zostać przeprowadzone, natomiast przy zwykłym przeprowadzaniu reakcji PCR zazwyczaj nie jest ono wymagane). Najpierw należy oznakować jedną probówkę wirówkową dla każdej próbki.
- Do każdej probówki wirówkowej dodać 160 mg CsCl oraz 178 μl DNA genomowego. Po dodaniu CsCl i DNA do probówki, przykryć ją małym kawałkiem parafilmu i delikatnie odwrócić probówkę od dziesięciu do dwudziestu razy w celu wymieszania składników. Nie mieszać za pomocą pipety, ponieważ może to spowodować fragmentację DNA. Następnie dodać do probówki 10 μl EtBr w stężeniu 10 μg/μl i wymieszać w ten sam sposób. (Należy zachować szczególną ostrożność podczas używania EtBr – jest to znany mutagen i podejrzewany kancerogen. Należy często zmieniać rękawiczki i unikać przenoszenia EtBr do pozostałej części laboratorium oraz na skórę).
- Przed wirowaniem należy upewnić się, że wszystkie probówki są zrównoważone, tak aby różnice w masie między probówkami nie przekraczały 1 mg.
- Za pomocą kleszczyków hemostatycznych umieścić probówki w rotorze, zamknąć pokrywę i umieścić rotor w ultrawirówce.
- Zamknąć drzwiczki ultrawirówki. Próżnia zostanie wytworzona natychmiast po zamknięciu drzwiczek. Wirować przez noc w temperaturze 20°C przy 100,000 rpm przez 18 godzin.
- Po zakończeniu wirowania wyjąć probówki z rotora za pomocą kleszczyków hemostatycznych i umieścić je w statywie.
- Wizualizować DNA za pomocą transiluminatora światła niebieskiego lub, jeśli jest niedostępny, światła UV o długiej fali, w ciemni. Nosić okulary z filtrem bursztynowym, aby dostrzec prążek DNA. Patrz Rysunek 2.
- Używając sterylnej strzykawki 1 cm³ i igły (26G 5/8), pobrać prążek DNA i umieścić go w probówce Eppendorf 1,5 ml.
- Aby pomóc w odzyskaniu większości DNA uwięzionego w martwej przestrzeni strzykawki, przepłukać strzykawkę 100 μl TE i dodać roztwór z płukania do probówki. Należy przygotować jedną probówkę z 100 μl buforu TE na każdą próbkę, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym.
- Aby usunąć EtBr z DNA, dodać do probówki równą objętość nasyconego wodą butanolu, delikatnie odwrócić probówki od dziesięciu do dwudziestu razy, wirować przy 10000 rpm przez 1 minutę i odrzucić górną warstwę.
- Powtarzać płukanie jeszcze 3–4 razy, aż butanol stanie się przezroczysty.
- Wlać 4 ml TE do probówki wirówkowej Amicon Ultra i dodać powyższy roztwór DNA.
- Wirować przy 3500 g w temperaturze pokojowej, aż objętość DNA zostanie zredukowana do około 100-500 μl (około 6-7 minut), a następnie odrzucić filtrat.
- Dodać 2 ml TE do filtra Amicon i wirować przy 3500 g przez 6 minut, pamiętając o użyciu nowej końcówki pipety przy każdym dodawaniu, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych. Powtórzyć dwukrotnie.
- Zagęścić do końcowej objętości 50-100 μl poprzez dodatkowe wirowanie w razie potrzeby i przenieść roztwór DNA z filtra do nowej probówki Eppendorf 1,5 ml.
- Dodać 40 μl TE do filtra Amicon i pipetować w górę i w dół wzdłuż obu membran filtra, aby wypłukać pozostałe DNA. Dodać ten roztwór do probówki z punktu 5.15.
- Umieścić jednostkę filtrującą Microcon YM-30 w probówce Microcon i wstępnie wypłukać Microcon, dodając 200 μl wody autoklawowanej i wirować przy 10000 rpm przez 7 minut.
- Dodać roztwór DNA z punktu 5.16 do wstępnie wypłukanego Microconu w celu dalszej koncentracji DNA. Wirować przy 5000-10000 g przez 1-3 minuty. Sprawdzić ilość cieczy na filtrze i powtarzać wirowanie, aż ilość cieczy na filtrze zostanie zredukowana do około 50 μl.
- Umieścić jednostkę filtrującą do góry dnem w nowej probówce Microcon i wirować przy 1000 g przez 3 minuty. Idealna objętość skoncentrowanego roztworu to 50-60 μl.
- Zmierzyć i zapisać stężenie DNA za pomocą Nanodrop oraz sprawdzić jakość piku (powinien wynosić 260 nm).
- Przenieść niewielką alikwot DNA do czystej probówki Eppendorf jako zapas roboczy i zamrozić w temperaturze -20°C. Przenieść resztę DNA do drugiej czystej probówki Eppendorf i zamrozić w temperaturze -80°C.
Reprezentatywne wyniki:
Po prawidłowym wykonaniu tego protokołu, obraz żelu uzyskany po kroku 4.4 w sekcji Determination of DNA quality powinien być podobny do Rysunku 1. Rzeczywiste stężenie DNA w ekstraktach będzie się różnić w zależności od źródła próbki. Po kroku 5.7 w sekcji CsCl gradient centrifugation, genomowe DNA oświetlone niebieskim światłem powinno wyglądać podobnie do Rysunku 2.
Rycina 1. Obraz elektroforezy w 0,8% żelu agarozy dla wysokocząsteczkowego DNA pobranego z czterech głębokości w subarktycznym Oceanie Spokojnym (w duplikacie), barwionego interkalującym agentem bromkiem etydyny (10 mg/ml). Żel był prowadzony przy 15V przez ok. 16h w 1X buforze do elektroforezy TBE. Prążki próbek są dobrej jakości i wykazują niewielkie oznaki mechanicznego ścinania (widoczne są pojedyncze prążki lub smugi, w przeciwieństwie do wielu prążków), choć w ekstraktach z 10m zachowana jest pewna ilość zanieczyszczeń RNA (widoczna smuga w zakresie od 0,5 do 2,0 Kb).
Rysunek 2.Prążek genomowego DNA oświetlony niebieskim światłem po wirowaniu w gradiencie CsCl.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W zależności od liczby przetwarzanych próbek, procedura ta może być czasochłonna ze względu na dwa godzinne etapy inkubacji oraz powtarzające się etapy przemywania i wirowania. Najlepiej zaplanować na tę procedurę dwa pełne dni, aby zapewnić sobie odpowiedni zapas czasu. Jeśli podczas koncentrowania i przemywania DNA pojawią się problemy z zredukowaniem końcowej objętości ekstraktu w probówce Amicon do poziomu 200-500μl, należy spróbować przeprowadzić dodatkowe przemycia buforem TE i wirowania (powtórzyć Część Trzecią), ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Kanadyjskiej Fundacji na rzecz Innowacji (Canadian Foundation for Innovation), Funduszowi Rozwoju Wiedzy Kolumbii Brytyjskiej (British Columbia Knowledge Development Fund) oraz Narodowej Radzie Badań w dziedzinie Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) w Kanadzie za wsparcie prowadzonych badań nad obszarami o niskiej zawartości tlenu w wodach przybrzeżnych i otwartych oceanach. J.J.W. otrzymał wsparcie w formie stypendiów z NSERC, a D.A.W. otrzymał wsparcie w formie stypendiów z NSERC, Killam oraz finansowanego przez fundację TULA Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej. S.L. otrzymał wsparcie z finansowanego przez fundację TULA Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| strzykawka 1 ml (igła 26G 5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| strzykawka 1 ml (igła 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| probówki Eppendorf 1,5 ml | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| probówki 15 ml | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| strzykawka 5 ml | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Urządzenia do filtrowania odśrodkowego Ultra-4 | EMD Millipore | UFC801096 | Limit nominalnej masy cząsteczkowej 10 000 |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Nasyć go wodą (butanol:woda = 1:1) |
| Rotor wirówki, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Wirówka, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Chlorek cezu | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| bromek etydyny (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Dwuwodny dwusód etylenodiaminotetraoctanu | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Piec do hybrydyzacji | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Bufor lizujący | 0,75 M sacharozy, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3) | ||
| Lizozym | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg w 1000 μl TE |
| Microcon® Centryfużna jednostka filtrująca Ultracel YM-30 | EMD Millipore | 42410 | próg odcięcia 50 bp |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Fenol:chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinaza K | Qiagen | 19133 | |
| RNaza A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Transiluminator do światła niebieskiego | Invitrogen | S37102 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| filtry Sterivex | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Wirówka laboratoryjna nakładkowa | Eppendorf | 5415D | |
| bufor TE, pH 8,0 | |||
| Trizma® zasada | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Rotor ultrawirówki, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Probówka do ultrawirówki (7x20 mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Statyw na probówki do ultrawirówki | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentryfuga, Optima® Maksymalny | Beckman Coulter Inc. |
Bibliografia
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
