Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Preparaty in vivo i semi-in vivo do obrazowania wapnia zostały opracowane w naszym laboratorium przez Joerges, Küttner i Galizii ponad dziesięć lat temu w celu pomiaru aktywności wywoływanej przez zapachy w płacie antennym1. Od tego czasu były one stale udoskonalane i stosowane w różnych neuropilach mózgu pszczoły. W niniejszym materiale opisujemy preparat obecnie stosowany w laboratorium do pomiaru aktywności neuronów ciał grzybkowatych z wykorzystaniem czułego na wapń barwnika sprzężonego z dekstranem (Fura-2). Barwienie neuronów ciał grzybkowatych przeprowadzamy drogą retrogradacyjną poprzez wstrzyknięcie barwnika do ich aksonów lub obszaru somy. Skupiamy się na ograniczeniu inwazyjności, aby uzyskać preparat, w którym nadal możliwe jest szkolenie pszczoły za pomocą warunkowania PER. Jesteśmy w stanie monitorować i kwantyfikować odpowiedź behawioralną poprzez rejestrację elektromiogramów z mięśnia kontrolującego PER (M17)2.
Po eksperymencie fizjologicznym obrazowane struktury są badane bardziej szczegółowo przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej w celu zidentyfikowania neuronów.
Protokół
Przygotowanie pszczół i wypełnianie wsteczne
- Odłowić pszczoły miodne zbieraczki przy ulu i schłodzić na lodzie w celu unieruchomienia.
- Umieścić je w pleksiglasowych komorach rejestracyjnych3. Przymocować oczy i klatkę piersiową do ścianek komory rejestracyjnej za pomocą twardego wosku o niskiej temperaturze topnienia.
- Wytworzyć kapilary szklane, zgodnie z powszechną praktyką w elektrofizjologii, i przełamać je na końcach, aby uzyskać średnicę otworu ok. 10μm. Końcówkę kapilary pokryć pastą barwiącą. Pasta barwiąca składa się z mieszaniny dekstranu Fura-2 i dekstranu tetrametylorodaminy wiązanej lizyną w stosunku 10:1.
- W celu przeprowadzenia procedury barwienia unieruchomić czułki za pomocą minutiae lub n-eikozanu. Usunąć fragment kutykuli nad mózgiem i odsunąć gruczoły oraz tchawki na bok, aby uzyskać dostęp do ciał grzybowych.
- Wprowadzić kapilary do somy lub regionu aksonalnego neuronów ciał grzybowych. Można to wykonać ręcznie lub przy użyciu mikromanipulatora. Następnie przytwierdzić fragment kutykuli z powrotem do torebki głowy i zwolnić czułki.
- Nakarmić pszczoły 30% roztworem sacharozy przed umieszczeniem ich w nawilżonym pojemniku na co najmniej cztery godziny lub na całą noc w temperaturze 20°C.
Obrazowanie in vivo
- Unieruchom pszczołę, np. za pomocą małego kawałka gąbki docisniętej do odwłoka i przymocowanej klipsem lub taśmą do komory rejestracyjnej.
- Aby zapobiec przemieszczaniu się mózgu wynikającemu z pompowania przełyku, wykonaj niewielkie nacięcie w kutykuli nad labrum, a następnie ostrożnie wyciągnij przełyk wraz z otaczającymi go strukturami stałymi, aby napiąć go bez uszkodzenia przełyku4. Przykryj dwuskładnikowym silikonem.
- Wykonaj otwory igłą i wprowadź elektrody druciane do rejestracji M17.
- Usuń fragment kutykuli, tchawki oraz gruczoły znajdujące się nad mózgiem. Odsącz hemolimfę z wnętrza torebki głowowej za pomocą kawałka papieru.
- Wypełnij torebkę głowową dwuskładnikowym silikonem. Ważne jest, aby mózg był całkowicie przykryty.
- Umieść pszczołę na stole mikroskopu i nanieś kroplę wody na powierzchnię silikonu, aby zanurzyć w niej obiektyw imersyjny mikroskopu. Ustaw ostrość na zabarwionych neuronach.
Stymulacja zapachowa i rejestracja sygnałów
Olfaktometr: Używamy sterowanego komputerowo, zbudowanego na zamówienie urządzenia do stymulacji, czyli „olfaktometru”, zgodnie z opisem Galizii i Vettera3. Zapachy są rozcieńczane w stałym strumieniu powietrza skierowanym w stronę czułków. Pojedynczy bodziec składa się z 3s impulsu zapachowego 0,2ml powietrza nasyconego zapachem. Protokół stymulacji można ustawić w oprogramowaniu do rejestracji TILLVision.
Mikroskop i zestaw obrazujący: Używamy mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss. Obrazy są rejestrowane w temperaturze 25°C z częstotliwością próbkowania 5 Hz przy użyciu urządzenia obrazującego TILL-Photonics zamontowanego na mikroskopie. Sygnały wapniowe są rejestrowane za pomocą obiektywu imersyjnego Olympus X60, 0,9 W z kamerą Imago CCD (640X480 pikseli, bining 4X na chipie do 160X120 pikseli). Fura-2 jest wzbudzany monochromatycznym światłem o długości fali 340 i 380nm w celu przeprowadzenia pomiarów ratiometrycznych. Fluorescencja jest wykrywana przez lustro dichroiczne 410nm i filtr długoprzepustowy 440nm. Parametry rejestracji są ustawiane w oprogramowaniu do zapisu. Każdy pomiar trwa 10s, a czas ekspozycji dla obu długości fal można dostosować do intensywności barwienia w każdym preparacie.
Rejestracja M17: Mięsień protraktor labium (M17) jest rejestrowany pozakomórkowo w celu monitorowania odpowiedzi behawioralnych związanych z uczeniem się, tj. PER 5, 6. Wprowadź miedziany drut do mięśnia w pobliżu części gębowych. Wprowadź elektrodę uziemiającą do oka. Potencjały mięśniowe są wzmacniane przez zbudowany na zamówienie przedwzmacniacz, digitalizowane i zapisywane na komputerze. Początek bodźca jest wyzwalany przez olfaktometr.
Analiza danych
- W trakcie eksperymentu: Rejestracje sygnału wapniowego są przesyłane do komputera i zapisywane. Oprogramowanie rejestrujące TILLVision umożliwia wstępną inspekcję sygnałów, taką jak obliczenie stosunku długości fal (340nm/380nm) oraz obliczenie deltaF (odjęcie linii bazowej).
- Przetwarzanie obrazów jest wykonywane za pomocą programów napisanych w języku IDL. Oblicz stosunek sygnałów Ca2+ z pomiarów 340nm i 380nm dla każdego piksela. Wyznacz fluorescencję tła (F) poprzez uśrednienie klatek przed bodźcem i odejmij ją od sygnału ratiometrycznego (deltaF).
- W celu zdefiniowania obszaru zainteresowania (ROI): Oblicz średnią z klatek podczas podawania bodźca i zastosuj filtr dolnoprzepustowy (3X3px). Przekształć skalę szarości w skalę pseudokolorów. Wyznacz aktywność w strukturach neuronalnych jako punkty aktywności na obrazach w pseudokolorach i zdefiniuj je jako ROI.
- Oblicz dynamikę czasową obszarów aktywnych poprzez uśrednienie pikseli w ROI we wszystkich klatkach, bez stosowania filtrowania lub korekcji.
Analiza morfologiczna i rekonstrukcja
Wraz z dekstranem Fura-2 wypełniamy neurony utrwalnym barwnikiem – dekstranem rhodaminą („mini ruby”). Oba barwniki mają tę samą masę cząsteczkową, zatem powinny znajdować się w tych samych miejscach w neuronach. Obrazowanie w szerokim polu zapewnia bardzo ograniczoną rozdzielczość przestrzenną, dlatego zaleca się badanie zabarwionych struktur po zakończeniu eksperymentu przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej.
- Po pomiarach fizjologicznych wypreparować mózgi i utrwalić.
- Przepłukać w PBS, przeprowadzić stopniowe odwodnienie w etanolu i przejaśnić w salicylanie metylu.
- Do mikroskopii konfokalnej zatopić mózg w salicylanie metylu.
- Stosujemy mikroskop Leica TCS SP2. Długość fali wzbudzenia wynosi 543nm.
- Skanujemy mózg za pomocą obiektywu z imersją powietrzną lub olejową i porównujemy zabarwione struktury z danymi obrazowymi.
Reprezentatywne wyniki:
Jeśli barwienie i przygotowanie przebiegły pomyślnie, sygnał w skali kolorów sztucznych, na przykład w neuronach zewnętrznych płata alfa ciała grzybiastego, może wyglądać jak na rysunku 1.
Odpowiedź behawioralną (PER) można obliczyć jako częstotliwość impulsów podczas stymulacji minus częstotliwość impulsów przed stymulacją (rysunek 2).
Obarwione struktury można zbadać bardziej szczegółowo przy użyciu mikroskopu konfokalnego (rysunek 3).
Rycina 1: Reprezentatywne sygnały obrazowania wapnia (stymulacja heptanalem). A: Obrazowany obszar mózgu pszczoły. B: Surowy obraz fluorescencyjny widziany przez obiektyw zanurzeniowy X20 przy długości fali wzbudzenia 380nm; płat alfa ciała grzybowatego zaznaczony fioletem. Barwnik wstrzyknięto do brzuszno-bocznego brzegu płatów alfa w celu zabarwienia neuronów zewnętrznych. C: Obraz w fałszywych kolorach pochodzący z uśrednionego sygnału deltaF (340/380) podczas trwostyczego bodźca; płat alfa zaznaczony fioletem, wybrany obszar ROI zaznaczony czernią. D: Dynamika czasowa sygnału wapnia w odpowiedzi na stymulację zapachową, uśredniony sygnał z obszaru ROI wskazanego w C. E: Dynamika czasowa sygnału wapnia w odpowiedzi na stymulację sacharozą odpowiednio ipsilateralnej i kontralateralnej anteny w odniesieniu do ROI wskazanego w C.
Rysunek 2: Reprezentatywna odpowiedź M17. Po warunkowaniu węchowym pszczoła wysuwa trąbkę, gdy zapach jest prezentowany bez nagrody. Czerwona linia oznacza bodziec zapachowy. Wstawka: PER pszczoły miodnej.
Rycina 3: Reprezentatywny stos obrazów. Po zakończeniu eksperymentu obrazowania dokonano sekcji mózgu. Neuron z ryciny 1 został przeskanowany za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem imersyjnym olejowym X20; płat alfa zaznaczono kolorem fioletowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej prezentacji omówiliśmy wszystkie etapy badania sygnałów wapniowych in vivo u pszczoły miodowej. Zastosowaliśmy tę technikę w odniesieniu do neuronów ciał grzybkowatych, jednak obrazowanie można przeprowadzić na wszystkich neuronach, dla których możliwe jest opracowanie techniki barwienia. Skupiliśmy się na neuronach w drodze węchowej pszczoły miodowej. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w ciemni. Układ jest oświetlony światłem o długiej fali, które wykracza poza zakres percepcji optycznej pszc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca jest finansowana przez DFG.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| twardy wosk o niskiej temperaturze topnienia Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| sól potasowa dekstranu FURA-2, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Chronić przed światłem. |
| dekstran tetrametylorodaminowy 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Chronić przed światłem. |
| n-eikozan | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Klej Kwik Sil | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Układ obrazowania | TILL Photonics | ||
| kamera CCD | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
Bibliografia
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
