Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

Podsumowanie

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro. Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Streszczenie

Układ nerwowy morskiego Aplysia californica jest stosunkowo prosty, składa się z około 20 000 neuronów. Neurony są duże (do 1 mm średnicy) i możliwe do zidentyfikowania, o różnych rozmiarach, kształtach, pozycjach i pigmentacjach, a ciała komórek są zewnętrznie odsłonięte w pięciu sparowanych zwojach rozmieszczonych w całym ciele zwierzęcia. Właściwości te pozwoliły badaczom nakreślić obwody leżące u podstaw określonych zachowań u zwierzęcia¹. Monosynaptyczne połączenie między neuronami czuciowymi i ruchowymi jest centralnym elementem odruchu wycofania skrzeli u zwierzęcia, prostego odruchu obronnego, w którym zwierzę wycofuje skrzela w odpowiedzi na stymulację dotykową syfonu. Odruch ten podlega formom uczenia się nieasocjacyjnego i asocjacyjnego, w tym uwrażliwianiu, habituacji i warunkowaniu klasycznemu. Szczególnie korzystne dla badań plastyczności synaptycznej jest to, że synapsa czuciowo-ruchowa może zostać odtworzona w hodowli, gdzie dobrze scharakteryzowane bodźce wywołują formy plastyczności, które mają bezpośrednie korelaty w zachowaniu zwierzęcia^2,3. W szczególności stosowanie serotoniny powoduje wzmocnienie synaptyczne, które, w zależności od protokołu aplikacji, trwa przez minuty (ułatwienie krótkoterminowe), godziny (ułatwienie średnioterminowe) lub dni (ułatwienie długoterminowe). Natomiast zastosowanie przekaźnika peptydowego FMRFamidu powoduje osłabienie synaptyczne lub depresję, które, w zależności od protokołu aplikacji, może trwać od kilku minut do kilku dni (depresja długotrwała). Duży rozmiar neuronów pozwala na wielokrotne rejestrowanie siły synaptycznej za pomocą elektrod w ciągu kilku dni wraz z mikrowstrzykiwaniem wektorów ekspresyjnych, siRNA i innych związków w celu ukierunkowania na określone kaskady sygnałowe i cząsteczki, a tym samym zidentyfikowanie etapów molekularnych i biologicznych komórek, które leżą u podstaw zmian w skuteczności synaptycznej.

Dodatkową zaletą systemu hodowli Aplysia jest fakt, że neurony wykazują specyficzność synapsową w hodowli^4,5. W związku z tym neurony czuciowe nie tworzą synaps ze sobą (autapses) ani z innymi neuronami czuciowymi, ani nie tworzą synaps z neuronami ruchowymi niezidentyfikowanymi w hodowli. Żylaki, miejsca kontaktu synaptycznego między neuronami czuciowymi i ruchowymi, są wystarczająco duże (2-7 mikronów średnicy), aby umożliwić tworzenie synaps (a także zmiany w morfologii synaptycznej) z docelowymi neuronami ruchowymi na poziomie mikroskopu świetlnego.

W tym filmie pokazujemy każdy etap przygotowania kultur neuronów czuciowo-ruchowych, w tym znieczulenie dorosłych i młodocianych Aplyzji, preparowanie ich zwojów, trawienie proteazy zwojów, usuwanie tkanki łącznej przez mikrodysekcję, identyfikację zarówno neuronów czuciowych, jak i ruchowych oraz usuwanie każdego typu komórek za pomocą mikrodysekcji, powlekanie neuronu ruchowego, dodawanie neuronu czuciowego i manipulowanie neurytem czuciowym w celu nawiązania kontaktu z hodowanym neuronem ruchowym.

Protokół

Przygotowanie (zobacz sekcję rozwiązań na końcu protokołu, aby zapoznać się z kompozycją roztworów)

1. Przygotuj potrawy kulturowe. Pokryj szklaną studzienkę naczynia hodowlanego ze szklanym dnem Mattek poli-l-lizyną (wykonaną z boranu sodu). Dodaj tyle, aby całkowicie dobrze przykryć szklankę i pozostaw na > 1 godzinę (można zostawić na noc). Dokładnie usuń poli-l-lizynę, spłukując ją w sztucznej wodzie morskiej (ASW) 4-5 razy. Po usunięciu ostatniego płukania dodaj 2 ml 50% L15 (uzupełnionego solami i zawierającego L-glutaminę w końcowym stężeniu 2mM)/50% hemolimfy. Pożywka hodowlana musi znajdować się w naczyniu przez co najmniej godzinę przed posianiem komórek, tak aby hemolimfa pokryła szalkę.
2. Umyj narzędzia i naczynia Sylgard etanolem, dokładnie wypłucz je ddH₂0, a następnie umieść na >1 godzinę pod lampą UV w okapie hodowlanym.
3. Przygotuj ostre elektrody do mikrodysekcji neuronów. Za pomocą ściągacza mikroelektrod (np. Sutter Flaming Brown P-97) wyciągnij szklane elektrody do pipet o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej od 0,86 do 1,12 mm i długości 100 mm (np. katalog systemu AM #628000; Światowe instrumenty precyzyjne TW150-4, 1.55/1.12). Użyj parametrów, które wytwarzają elektrodę z długą i delikatną cienką końcówką o tak wysokiej rezystancji, że nie ma kapilarnego pobierania płynu po umieszczeniu w roztworze. Obecność płynnej menisku oznacza, że końcówka elektrody uszkodzi neuron podczas izolacji. Książka kucharska elektrod Sutter zawiera doskonałe wskazówki dotyczące konfiguracji programów elektrod. Używamy filamentu pudełkowego i jednoetapowego pociągnięcia do generowania elektrod hodowlanych.
4. Przygotować roztwór znieczulający (0,35 M MgCl2), pożywkę hodowlaną (L15 uzupełnioną solami i hemolimfą) i roztwór proteazy (1% proteazy typu IX, Sigma, 1 jednostka/mg, do końcowego stężenia 10 jednostek/ml).
5. Zwierzęta: użyć dorosłej 80-100 g Aplysia do izolacji neuronów czuciowych i neuronów ruchowych LFS. Użyj młodzieńczej 1-4 g Aplysia do izolacji neuronów ruchowych L7. Delikatnie wyjmij zwierzęta ze zbiorników z wodą morską i trzymaj w wodzie morskiej (w zlewce, wiadrze lub plastikowej torbie) nie dłużej niż 30 minut przed rozpoczęciem procedury znieczulenia i hodowli.

Procedura hodowli

A. Hodowla opłucnowych neuronów czuciowych z 80-100 g Aplysia

1. Znieczulić zwierzęta w celu usunięcia zwojów: Wstrzyknąć 0,35 M MgCl₂ do dorosłej Aplysia (80-100 g) za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml z igłą 1,5 cala o rozmiarze 18. Wejdź w stopę zwierzęcia pod kątem około 35 stopni i nie wchodź zbyt głęboko. Celem jest wstrzyknięcie do hemofelu zwierzęcia bez przenikania do narządów wewnętrznych. Zwierzę powinno stać się bardzo rozdęte i zrelaksowane.
2. Wypreparuj zwoje: Przypnij znieczulone zwierzę do naczynia preparacyjnego, za pomocą szpilki (igły o rozmiarze 18 dobrze sprawdzają się w przypadku zwierząt o wadze 80-100 g) na głowie i ogonie, a stopą skierowaną do góry. Przytrzymaj stopę kleszczami zębatymi i przetnij skórę i leżącą pod nią tkankę łączną na całej długości stopy (od głowy do ogona) nożyczkami chirurgicznymi. Przypnij obie strony do dołu. Za pomocą kleszczy i nożyczek przetnij przełyk i pociągnij na bok, aby odsłonić zwoje. Za pomocą cienkich kleszczy i cienkich nożyczek wytnij zwoje pedału opłucnej (neurony czuciowe znajdują się w zwojach opłucnej). Pozostaw sporo nerwu, ponieważ ułatwia to przygwożdżenie zwojów po leczeniu proteazą.
3. Trawienie zwojów przez proteazę: Umieść zwoje w roztworze proteazy (10 mg/ml 1 jednostki/mg w L15) w inkubatorze ustawionym na 34,5°C (34-35°C jest w porządku) na 2 godziny i 15 minut. Używając kleszczyków z cienką końcówką, aby trzykrotnie przenieść i umyć zwoje w ASW. Utrzymuj zwoje w L15. Należy pamiętać, że czas inkubacji proteazy może się różnić. Celem jest umożliwienie łatwego usunięcia tkanki łącznej. Jeśli zbyt trudno jest usunąć zwoje nerwowe bez uszkodzenia neuronów, wydłuż czas inkubacji proteazy. Jeśli niezwykle łatwo jest usunąć osłonkę z zwojów, a neurony są "miękkie", skróć czas inkubacji proteazy.
4. Usuwanie osłony zwojów nerwowych: Przenieść zwoje trawione przez proteazę do naczynia o średnicy 60 mm lub 35 mm zawierającego sylgard i L15. Oglądając pod mikroskopem stereoskopowym (z zewnętrznym oświetleniem halogenowym), usuń zwoje pedału i przypnij zwoje opłucnej w szalce Sylgarda we właściwej orientacji za pomocą szpilek do owadów i cienkich kleszczy. Za pomocą cienkich kleszczyków i nożyczek chirurgicznych Vanna ostrożnie podnieś tkankę łączną i przetnij ją, aby odsłonić skupisko czuciowe. Uważaj, aby nigdy nie dotknąć ani nie uszkodzić somatów neuronalnych. Usuń nadmiar tkanki łącznej z naczynia i dodaj więcej pożywki, uważając, aby nigdy nie wystawiać zdewastowanego ganglionu na działanie powietrza.  Klaster czuciowy składa się z około 200 skupionych neuronów o średnicy 40-50 mikronów. Ustaw szpilkę, aby zrobić "słupek" w niewielkiej odległości od ganglionu (w polu widzenia).
5. Izolacja neuronów: Używając długiej, ostrej szklanej elektrody hodowlanej, wyciągnij zidentyfikowane neurony jeden po drugim, dotykając ciała komórki tuż poza środkiem (nie wbijaj na pal) i powoli i systematycznie odciągając somę komórkową wraz z aksonem od zwoju. Delikatnie dotknij szpilki, aby usunąć neurony z elektrody.
6. Posiewanie neuronów: Użyj pipetmana (P10), aby przenieść pojedyncze neurony z szalki Sylgarda do szalki hodowlanej. Przed przeniesieniem neuronów należy odpipetować pożywkę hodowlaną do końcówki, tak aby plastikowa końcówka była pokryta hemolimfą (zapobiega to przywieraniu neuronów do plastiku). Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie narażać neuronów na działanie pęcherzyków powietrza lub jakichkolwiek ekstremalnych sił (tj. należy bardzo delikatnie pobierać i usuwać neurony z pipetownika). Rozłóż neurony równomiernie w całym naczyniu. Użyj ostrej elektrody, aby delikatnie wyprostować procesy i stukać nimi do dołu.
7. Inkubacja: Pozostawić naczynia na stoliku mikroskopowym w temperaturze pokojowej na nie mniej niż 3 godziny. Rutynowo zostawiamy je na noc. Upewnij się, że stolik mikroskopu nie jest zakłócony w tym okresie. Przykryj scenę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Delikatnie przenieś je do inkubatora o temperaturze 18°C.
8. Kultury powinny przylegać do naczynia w ciągu około 3 godzin, a nowy wzrost neurytów powinien być widoczny w ciągu około 6-12 godzin. Wzrost izolowanych neuronów czuciowych osiąga plateau przez DIV 3 lub 4. Zauważ, że izolowane neurony czuciowe nie tworzą ze sobą autapsów ani synaps chemicznych, chociaż tworzą połączenia elektryczne.

B. Przygotowanie kokultur neuronów czuciowo-ruchowych

Neurony czuciowe tworzą synapsę z docelowymi neuronami ruchowymi w kulturze. Najczęściej stosowanymi neuronami ruchowymi są neurony ruchowe LFS i neuron ruchowy L7 ze zwoju brzusznego. Neurony ruchowe LFS są izolowane od dorosłej (80-100 g) Aplyzji, a na zwój brzuszny przypada około 20 neuronów ruchowych LFS. Neuron ruchowy L7 jest izolowany od młodych (1-4 g) zwierząt, a na zwoje brzuszne przypada tylko jeden L7. Neurony ruchowe LFS mają średnicę 40-50 mikronów, są przeplatane neuronami czuciowymi LE w pobliżu korzenia nerwu syfonowego na brzusznej powierzchni zwojów brzusznych i charakteryzują się subtelną ciemną plamką pigmentową w każdej somie. Neuron ruchowy L7 ma średnicę 100-150 mikronów i jest obecny na grzbietowej powierzchni zwoju, na środkowej krawędzi lewej strony zwoju. Chociaż bardziej ekonomiczne jest użycie neuronów ruchowych LFS, duży rozmiar neuronu ruchowego L7 jest korzystny dla niektórych eksperymentów. Neuron ruchowy L11, również na grzbietowej lewej powierzchni zwoju brzusznego, ogonowy do L7, jest neuronem ruchowym niedocelowym i może być skutecznie stosowany jako kontrola, za pomocą której neuron czuciowy faskuluje się, ale nie tworzy synaps chemicznych.

1. Znieczulić zwierzęta w celu usunięcia zwojów. W przypadku neuronów ruchowych LFS należy postępować zgodnie z opisem dla neuronów czuciowych opłucnej. W przypadku neuronów ruchowych L7 wstrzyknąć 0,35 M MgCl₂ do młodocianej Aplysia (1-4 g) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 21.
2. Wypreparuj zwoje brzuszne: Przypnij znieczulone zwierzę do naczynia preparacyjnego, jak opisano powyżej (przy użyciu igieł o rozmiarze 21 dla młodych zwierząt). Za pomocą cienkich kleszczy i cienkich nożyczek wytnij zwoje brzucha.
3. Trawienie proteazy zwojów: Odbywa się to zgodnie z opisem dla neuronów czuciowych opłucnej, z wyjątkiem tego, że czas trawienia jest skrócony do 1 godziny 45 minut w przypadku zwojów u młodych (1-4 g) zwierząt.
4. Usuwanie osłony zwojów nerwowych: Przenieść zwoje trawione przez proteazę do naczynia o średnicy 35 lub 60 mm zawierającego sylgard i L15. Oglądanie pod mikroskopem stereoskopowym (z zewnętrznym oświetleniem halogenowym), w zwojach mózgowych w szalce Sylgarda we właściwej orientacji za pomocą szpilek na owady i cienkich kleszczyków. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek chirurgicznych Vanna ostrożnie podnieś tkankę łączną i przetnij ją, aby odsłonić ciała komórek nerwowych. Aby wyizolować neurony ruchowe LFS, przypnij zwój tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry, a następnie za pomocą kleszczy pociągnij osłonkę tkanki łącznej do tyłu, aby odsłonić całą połowę zwoju zawierającego neurony ruchowe LFS (po prawej stronie), usuń pozostałe części zwoju, usuń tkankę łączną z naczynia i dodaj więcej L15. Aby wyizolować neuron ruchowy L7 lub L11, przypnij zwój tak, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana do góry, i za pomocą kleszczy pociągnij osłonkę tkanki łącznej do tyłu, aby odsłonić połowę zwoju zawierającego zarówno L7, jak i L11 (po lewej stronie). Uważaj, aby nigdy nie dotknąć ani nie uszkodzić somatów neuronalnych. Umieść szpilkę, aby zrobić "słupek" w niewielkiej odległości od ganglionu (w polu view).
5. Izolacja neuronów: Usuń neurony za pomocą ostrej elektrody, jak opisano dla neuronów czuciowych. Neurony LFS różnią się od sąsiednich neuronów czuciowych LE na podstawie małej ciemnej plamki pigmentowej w ich somaty. Neuron L7 można odróżnić od neuronu L11 po pierwsze, ponieważ L11 jest ogonowy do L7, ponieważ ciało komórki L11 ma bardziej podłużny kształt, podczas gdy ciało komórki L7 jest bardziej okrągłe i ponieważ akson L11 ma tendencję do rozgałęziania się na dwie części blisko ciała komórki.
6. Powlekanie neuronów: Użyj pipetmana (P10), aby przenieść pojedyncze neurony z szalki Sylgarda do naczynia hodowlanego, jak opisano dla neuronów czuciowych.
7. Parowanie z neuronami czuciowymi: Pozwól neuronom ruchowym przylegać do naczynia hodowlanego przez co najmniej 1 godzinę. Następnie dodaj izolowane neurony czuciowe za pomocą pipetmana, dostarczając każdy neuron czuciowy sąsiadujący z platerowanym neuronem ruchowym. Za pomocą ostrej szklanej elektrody ostrożnie wyprostuj akson neuronu czuciowego i ustaw ciało komórki czuciowej w pozycji obok neuronu ruchowego, w odległości równej lub nieco mniejszej niż długość aksonu komórki czuciowej. Za pomocą szklanej elektrody nakłoń akson czuciowy do kontaktu z neuronem ruchowym, bardzo delikatnie używając boku stożkowej elektrody, aby w końcu akson czuciowy fizycznie zetknął się z aksonem neuronu ruchowego. Nie podnoś naczynia hodowlanego, ale raczej delikatnie przesuwaj naczynie po stoliku mikroskopu.
8. Pozostaw naczynia na stoliku mikroskopowym w temperaturze pokojowej na nie mniej niż 3 godziny i przenieś do inkubatora o temperaturze 18°C, jak opisano dla neuronów czuciowych.
9. Kultury powinny przylegać do naczynia w ciągu około 3 godzin, a nowy wzrost neurytów powinien być widoczny w ciągu około 6-12 godzin. Neurony czuciowe bardzo szybko tworzą synapsy glutaminergiczne z neuronami ruchowymi - gdy tylko komórka jest wystarczająco przylegająca, aby wykonać ostry zapis elektrody (3-5 godzin), można zarejestrować pobudzający potencjał postsynaptyczny. Łączność synaptyczna wzrasta do DIV 3, a następnie jest stabilna do DIV7. Neurony powinny wykazywać skomplikowany rozrost neurytów w ciągu pierwszych jednego do trzech dni w hodowli.

C. Przygotowanie Hemolimfy

Hemolimfa jest używana jako czynnik wzrostu w hodowli Aplysia (analogicznie do użycia surowicy płodowej cielęcej w hodowli komórek ssaków). Zbiera się go z dużych (500 g-1 kg) zwierząt, a najlepszą porą na zbieranie hemolimfy (anegdotycznie) jest wiosna (od połowy marca do czerwca). Owiń zwierzę w jednorazową podkładkę, tak aby odsłonięta była tylko niewielka część zwierzęcia, oczyść tę część skóry etanolem, a następnie trzymaj ją, podczas gdy inna osoba używa sterylnej żyletki, aby wykonać nacięcie w odsłoniętym obszarze. Ściśnij zwierzę tak, aby hemolimfa wstrzyknęła do czystej zlewki, upewniając się, że nie dotyka brudnej skóry zwierzęcia. Hemolimfa wypełnia hemocoel zwierzęcia (tj. zwierzę jest w zasadzie woreczkiem hemolimfy). Owiń zwierzę raz lub dwa razy, wykonaj nowe nacięcie i mocno ściśnij, aby zebrać jak najwięcej hemolimfy (zbierz w nowej zlewce, aby w przypadku zanieczyszczenia pierwsza kolekcja nadal nadawała się do użytku). Hemolimfa od każdego zwierzęcia powinna być przechowywana oddzielnie (tj. nie należy łączyć hemolimfy z różnych zwierząt). Wiruj hemolimfę o masie 2000 x g przez 10 minut, aby usunąć krwinki. Porcję supernatantu rozdzielić na 10 ml podwielokrotności, oznaczyć według zwierzęcia i przechowywać w temperaturze -80°C. Należy zauważyć, że hemolimfa przechowywana w temperaturze -20°C tworzy osad w pożywce. Za każdym razem, gdy przygotowywana jest pożywka, należy użyć nowej podwielokrotności hemolimfy, a podwielokrotność należy rozmrozić tuż przed przygotowaniem pożywki. Nie zamrażać ponownie po rozmrożeniu.

Dyskusja

Pomyślne przygotowanie kultur czuciowo-motorycznych Aplysia ma nieco powolną krzywą uczenia się, ponieważ obejmuje rozwój umiejętności motorycznych związanych z mikrodysekcją i manipulacją pojedynczymi neuronami oglądanymi przez stereomikroskop. Z naszego doświadczenia wynika, że potrzeba około 1-3 tygodni praktyki, aby uzyskać zdrowe, izolowane neurony czuciowe w hodowli i dodatkowe 1-3 tygodnie, aby nauczyć się łączyć neurony czuciowe z neuronami ruchowymi. Rutynowo przygotowujemy kultury w Labconco Clean Benc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory potrzebne do hodowli 0.35 M MgCl2, przechowywane w temperaturze pokojowej, używane do znieczulenia. Roztwór poli-L-lizyny, Sigma: P-1524, MW > 300 000, wykonane w 0,1 M roztworze boranu sodu o pH 8,2 do 0,5 mg / ml. Dobrze zawirować i przefiltrować sterylizować przez 0,22 μ m filtr, przechowuj go w temperaturze 4C°. Nie zamrażać-rozmrażać. L-15 Średni proszek (Leibovitz) (Sigma: L4386) uzupełniony solami jak poniżej, aby uzyskać 1 litr 22 L-15 proszek 13.8g NaCl 15,4 g D-Glukoza 6,24 g MgSO4• 7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg 5.49 g CaCl2• 2H2O 1.43g HEPES 3.53g < td>MgCl• 6HO Dodaj ddH20 do 1 litra. pH powinno wynosić około 7,4-7,5, dodać 10 ml 100X roztworu Pen/Strep i wysterylizować przez 0,22 μ m filtr. Przechowywać w temperaturze 4C0 nie dłużej niż 1 miesiąc. Roztwór do trawienia proteazy: 1% Proteaza IX (1 jednostka/mg) jest wytwarzana w L15 (uzupełniona solami jak wyżej) lub w ASW bezpośrednio przed użyciem, sterylizowana przez filtr 0,22 μ m Milipore. 5 ml powinno wystarczyć na zwoje od dwóch zwierząt (upewnij się, że zwoje są całkowicie zanurzone w roztworze proteazy). Sigma poinformowała, że zaprzestanie sprzedaży Protease IX. Proteazą zastępczą jest: Dispase II (katalog Roche Applied Science # 04942078001). Pożywka hodowlana. Bezpośrednio przed przygotowaniem kultur rozmrozić 10 ml podwielokrotności hemolimfy i wymieszać ją z 10 ml L15 (uzupełnionymi solami jak powyżej), aby uzyskać 20 ml pożywki hodowlanej. Dodaj 200 #x03BC; l 200mM L-Glutamina, dobrze wymieszaj i użyj do przygotowania kultur. Pożywka ta powinna być przygotowywana na świeżo za każdym razem, gdy wytwarzane są kultury. Sztuczna woda morska może być wytwarzana z Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) lub w następujący sposób: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, o pH dostosowanym do 7,4.