Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie zarodka syncytialnego Drosophila melanogaster do badania mitozy¹. Drosophila posiada użyteczne narzędzia genetyczne z zsekwencjonowanym genomem i może być łatwo utrzymywana oraz manipulowana. Istnieje wiele mutantów mitoticznych, a muszki transgeniczne wykazujące funkcjonalne białka mitoticzne znakowane fluorescencyjnie (np. GFP) zostały i są nadal tworzone. Celowana ekspresja genów jest możliwa dzięki zastosowaniu systemu GAL4/UAS².

Wczesny embrion Drosophila przechodzi wielokrotne mitozy w bardzo szybkim tempie (czas trwania cyklu komórkowego ≈10 min). Jest on odpowiednim modelem do obrazowania mitozy, ponieważ podczas cykli 10-13 jądra dzielą się szybko i synchronicznie, bez następującej po tym cytokinezy, na powierzchni embrionu w pojedynczej warstwie bezpośrednio pod korym. Te szybko dzielące się jądra prawdopodobnie wykorzystują ten sam mechanizm mitotyczny co inne komórki, jednak są one zoptymalizowane pod kątem szybkości; powszechnie uważa się, że punkt kontrolny nie jest rygorystyczny, co umożliwia badanie białek mitotycznych, których brak spowodowałby zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach z silnym punktem kontrolnym. Embriony wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP lub poddane mikroiniekcji białek znakowanych fluorescencyjnie można łatwo obrazować w celu śledzenia dynamiki żywych komórek (Ryc. 1). Ponadto do embrionów można mikroiniekować przeciwciała blokujące funkcję lub inhibitory specyficznych białek, aby zbadać efekt utraty lub zaburzenia ich funkcji³. Odczynniki te mogą dyfundować w całym embrionie, docierając do wielu wrzecion i tworząc gradient stężenia inhibitora, co z kolei skutkuje gradientem defektów porównywalnym do serii allelicznej mutantów. Idealnie, jeśli białko docelowe jest znakowane fluorescencyjnie, gradient inhibicji można zwizualizować bezpośrednio⁴. Zakłada się, że najsilniejszy fenotyp jest porównywalny z fenotypem null, choć trudno formalnie wykluczyć możliwość, że przeciwciała mogą w rzadkich przypadkach wywoływać efekty dominujące, dlatego należy stosować rygorystyczne kontrole i ostrożną interpretację. W większej odległości od miejsca iniekcji funkcja białka jest utracona tylko częściowo, co pozwala na ujawnienie innych funkcji białka docelowego.

Protokół

Przepisy:

Szalki z sokiem winogronowym:

• 5.5g agaru bakteryjnego
• 14.5 g dekstrozy lub glukozy
• 7.15 g sacharozy
• 45 ml koncentratu soku winogronowego (100% soku)
• 204.5 ml H₂O
• 625 μl 10N NaOH

Wymieszać wszystkie składniki i podgrzewać w kuchence mikrofalowej do wrzenia.
Dodać 2.8 ml mieszaniny kwasów (mieszanina kwasów: 20.9 ml kwasu propionowego, 2.1 ml kwasu fosforowego, 27 ml H₂0)

Wymieszać i przelać do szalek Petriego o średnicy 35 mm. Pozostawić do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez jeden lub dwa dni. Jeśli szalki nie będą użyte w najbliższym czasie, zabezpieczyć je parafilmem i przechowywać w temperaturze 4°C (przed użyciem doprowadzić do wyrównania temperatury z temperaturą pokojową).

Pasta drożdżowa:

Rozpuścić około jednej łyżeczki drożdży (Sigma YSC2, drożdże z Saccharomyces cerevisiae typu II) w wodzie, aby uzyskać gęstą pastę. Bezpośrednio przed użyciem nanieść niewielką ilość pasty na każdą płytkę z sokiem winogronowym.

Bufor G-PEM:

• 80 mM Na-PIPES, pH 6.9
• 1 mM MgCl₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Bufor do wstrzykiwania:

• 150 mM aspartynianu potasu
• 10 mM fosforanu potasu
• 20 mM imidazolu, pH 7.2

Klej heptanowy:

Rozwiń dwustronną taśmę klejącą i umieść ją w butelce o pojemności 100ml, dodaj około 50ml heptanu, szczelnie zamknij butelkę i pozostaw do mieszania przez kilka dni, delikatnie nią potrząsając. Podczas używania dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty.

Komora odwodniająca:

Należy wziąć szalkę Petriego o średnicy 100 mm, umieścić wewnątrz jedną część szalki o średnicy 35 mm, aby stworzyć „podest”, a wokół niej wsypać Drierite (bezwodny siarczan wapnia) tak, aby wysokość Drierite nie przekraczała poziomu „podestu”, a następnie przykryć całość. Przed wstrzykiwaniem szkiełko nakrywkowe z embrionami zostanie umieszczone na tym „podestcie” w celu odwodnienia. Zaleca się stosowanie przynajmniej częściowo wskaźnikowego Drierite i jego wymianę po zmianie koloru.

Protokół:

Niniejszy protokół można zastosować do wstrzykiwania niemal każdego rozpuszczalnego odczynnika do syncytialnego zarodka Drosophila: na przykład białka fluorescencyjnego do obserwacji, inhibitora białka docelowego lub obu tych substancji jednocześnie.

Przygotowanie wszystkich niezbędnych elementów:

1.- Od 2 do 3 dni przed eksperymentem przygotuj płytki z sokiem z winogron i ustaw klatkę do składania jaj: weź plastikową butelkę (6 oz, z okrągłym dnem od Applied Scientific Drosophila), wytnij dwa małe otwory (około 1cm²) po przeciwnych stronach butelki i wypełnij je kawałkiem waty (umożliwi to przepływ powietrza), przelej muchy do butelki i przykryj ją płytką z sokiem z winogron. Przechowuj w 25°C (lub w temperaturze pokojowej); muchy powinny składać embriony przez około 10 dni.

2.- Przynajmniej jeden dzień przed eksperymentem przygotować igły do iniekcji; używamy do tego wyciągacza igieł/pipet Kopf model 720 oraz cienkościennych szklanych włókien (World Precision Instruments tw100f). W przypadku iniekcji fluorescencyjnej tubuliny, igły należy przechowywać w temperaturze 4°C, aby zapobiec polimeryzacji wywołanej temperaturą wewnątrz igły.

Przygotowanie tubuliny:

Uwaga: Wszystkie prace z tubuliną należy prowadzić w temperaturze 4°C, aby zapobiec polimeryzacji.

1. Wyjąć znakowaną tubulinę z zamrażarki i pozostawić ją na lodzie od 5 do 15 minut.
2. Rozcieńczyć buforem G-PEM (od 4 do 10 razy, w zależności od wymaganej intensywności).
3. Wirować z prędkością 13k rpm w temperaturze 4°C przez 10-15 minut.
4. Nabrać 1 - 2 μl do igły.

Przeciwciało lub inhibitor chemiczny:

Przygotować igły w taki sam sposób jak dla tubuliny, stosując odpowiednie stężenie (może to wymagać wcześniejszego przetestowania). Przeciwciało może znajdować się w buforze do wstrzykiwania, buforze G-PEM lub PBS. Jeśli wymagany jest inny bufor, należy go wstrzyknąć jako kontrolę, aby upewnić się, że sam bufor nie powoduje uszkodzeń.

Uwaga: Inhibitor i fluorescencyjna tubulina mogą zostać zmieszane i wstrzyknięte razem, jeśli na to pozwalają stężenia. W przeciwnym razie należy wstrzyknąć fluorescencyjną tubulinę i odczekać od 5 do 10 minut przed wstrzyknięciem inhibitora. Podczas wykonywania podwójnej iniekcji należy rozpocząć od większej liczby embrionów, ponieważ mniejsza ich liczba powróci do normalnego stanu.

Zbiór zarodków:

1. Umieść nową płytkę z sokiem z winogron na klatce do składania jaj.
2. Zdejmij tę płytkę po godzinie; jest to pierwsza w ciągu dnia kolekcja i często nie jest ona najwyższej jakości. Można ją odrzucić.
3. Wymieniaj płytkę co godzinę, aby kontynuować zbieranie embrionów w interwałach godzinnych.

Przygotowanie szkiełek nakrywkowych:

1. Umieść szkiełko zakrywające o wymiarach 50 x 22mm po jednej stronie przedmiotu szkiełka. Przyklej cztery narożniki do przedmiotu szkiełka taśmą, aby zapobiec jego przesuwaniu się.
2. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nanieś jedną warstwę kleju heptanowego w jednej linii na szkiełko zakrywające (klej nie powinien być lepki i powinien wyschnąć w ciągu kilku sekund; w przeciwnym razie dodaj więcej heptanu).
3. Przyklej kawałek dwustronnej taśmy klejącej na przedmiocie szkiełka w kierunku szkiełka zakrywającego.

Przygotowanie embrionów:

Uwaga: Obrazowanie zarodków należy przeprowadzić około 2 godziny po rozpoczęciu ich zbierania, dlatego należy rozpocząć poniższe kroki z odpowiednim wyprzedzeniem, aby ukończyć je w tym przedziale czasowym.

1. Za pomocą zwilżonego pędzelka ostrożnie pobierz embriony z płytki z sokiem z winogron i umieść je na dwustronnej taśmie klejącej na szkiełku przedmiotowym.
2. Używając zewnętrznej części pęsety, przetaczaj embriony po dwustronnej taśmie klejącej, aż chorion (błona zewnętrzna) pęknie.
3. Pobierz embrion, delikatnie przetaczając go po chorionie, aby przykleił się do pęsety, a następnie umieść go na kleju z heptanu na szkiełku nakrywkowym, tak aby długa oś embrionu była równoległa do długiej krawędzi szkiełka. Ustaw od 10 do 20 embrionów w jednym rzędzie.
4. Zdejmij szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze odwadniającej na 3 do 8 minut (czas ten zależy od wilgotności w pomieszczeniu oraz liczby embrionów przeznaczonych do iniekcji).
5. Umieść próbkę w metalowej komorze z smarem próżniowym.
6. Przykryj embriony olejem halokarbonowym 700, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu. Embriony są teraz gotowe do iniekcji.

Wstrzykiwanie do zarodków:

1. Zlokalizuj zarodki przy użyciu obiektywu 16x.
2. Przesuń zarodki w bok i znajdź igłę, nie zmieniając płaszczyzny ogniskowania.
3. Wycentruj igłę i przesuń ją w górę, nie zmieniając jej położenia w osi x lub y.
4. Jeśli igła jest zamknięta, wprowadź krawędź szkiełka nakrywki w pole widzenia (poza miejsce, w którym znajdzie się igła) i opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowania. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywki, aż uderzy ono w igłę i delikatnie ją otworzy. Jeśli igła jest otwarta, przejdź do kroku 5. (Igły można otworzyć kwasem fluorowodorowym przed napełnieniem).
5. Wprowadź zarodki w pole widzenia (poza miejsce, w którym znajdzie się igła), opuść igłę do oleju i upewnij się, że z igły wydobywają się wyraźne krople cieczy.
6. Ostrożnie, ale pewnie przesuń zarodek do igły, wstrzyknij kroplę do zarodka, a następnie odsuń zarodek.
7. Po wstrzyknięciu cieczy do wszystkich zarodków są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym.

Obrazowanie:

Wykonaj obrazowanie embrionów za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 60 lub 100X:
Uwagi:

1. Interwał czasowy w serii time-lapse powinien wynosić maksymalnie kilka sekund, ponieważ mitoza w zarodku przebiega bardzo szybko, w zależności od dokładnego procesu będącego przedmiotem badań.
2. W zależności od interesującego procesu można pozyskać serię 3D lub pojedynczą płaszczyznę obrazowania.
3. W przypadku szybko działających inhibitorów przeniesienie z mikroskopu do iniekcji do mikroskopu obrazującego musi odbyć się szybko.

Rycina 1: Badanie mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila. Jądra we wczesnym embrionie ulegają szybkim podziałom bez cytokinezy; podczas cykli od 10 do 13 jądra tworzą monowarstwę w korze. A. Schemat wczesnego embrionu z jądrami w korze. Embrion może ekspresować białka znakowane GFP i/lub RFP oraz może zostać poddany mikroiniekcji innych znakowanych białek i/lub inhibitorów. B. Obrazowanie time-lapse embrionu ekspresującego GFP-tubulinę i RFP-histon. C. Wykres odległości między biegunami dla cykli 11, 12 i 13 w embrionie typu dzikiego. Długość wrzeciona wykazuje okresy stałej długości (izometryczne) oraz okresy wydłużania, które są bardzo spójne i powtarzalne. D. Dynamika mikrotubul wrzeciona. Iniekcja niskiego stężenia tubuliny z rodamyną prowadzi do powstania plamek składających się z kilku podjednostek tubuliny, które mogą być wykorzystane do badania dynamiki mikrotubul.

Dyskusja

Niniejszy protokół jest stosunkowo prosty, jednak każdy krok wymaga praktyki, aby upewnić się, że zarodki nie zostaną uszkodzone. Zawsze należy przeprowadzać uważne eksperymenty kontrolne, aby zapewnić uzyskanie wiarygodnych wyników. Dobrym sposobem na rozpoczęcie jest mikroiniekcja buforu lub tubuliny z rodaminą do zarodków kontrolnych wykazujących ekspresję GFP-tubuliny, aby upewnić się, że mitoza przebiega prawidłowo we wszystkich cyklach na powierzchni zarodka (cykle od 10 do 13). W zarodkach kontrolnych nie powinno ...