Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie mikroiniekcji i obrazowania w wysokiej rozdzielczości w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster do badania mitozy.

Streszczenie

Ten protokół opisuje użycie zarodka syncytialnego Drosophila melanogaster do badania mitozy¹. Drosophila ma użyteczną genetykę ze zsekwencjonowanym genomem i można ją łatwo utrzymywać i manipulować. Istnieje wiele mutantów mitotycznych, a transgeniczne muszki wykazujące funkcjonalną fluorescencyjną ekspresję (np. GFP) - znakowane białka mitotyczne były i są generowane. Ukierunkowana ekspresja genów jest możliwa przy użyciu systemu GAL4/UAS².

Wczesny zarodek Drosophila przeprowadza wiele mitoz bardzo szybko (czas trwania cyklu komórkowego, ≈10 min). Dobrze nadaje się do obrazowania mitozy, ponieważ podczas cykli 10-13 jądra dzielą się szybko i synchronicznie bez ingerencji w cytokinezę na powierzchni zarodka w jednej monowarstwie tuż pod korą. Te szybko dzielące się jądra prawdopodobnie używają tej samej maszynerii mitotycznej co inne komórki, ale są zoptymalizowane pod kątem prędkości; Powszechnie uważa się, że punkt kontrolny nie jest rygorystyczny, co pozwala na badanie białek mitotycznych, których brak spowodowałby zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach z silnym punktem kontrolnym. Zarodki wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP lub mikrowstrzykiwane białkami znakowanymi fluorescencyjnie można łatwo zobrazować, aby śledzić dynamikę życia (ryc. 1). Ponadto zarodki mogą być mikrowstrzykiwane z przeciwciałami blokującymi funkcję lub inhibitorami określonych białek w celu zbadania skutków utraty lub zaburzenia ich funkcji³. Odczynniki te mogą dyfundować w całym zarodku, docierając do wielu wrzecion, aby wytworzyć gradient stężenia inhibitora, co z kolei powoduje gradient defektów porównywalny z alleliczną serią mutantów. W idealnej sytuacji, jeśli białko docelowe jest znakowane fluorescencyjnie, gradient inhibicji można bezpośrednio zwizualizować⁴. Zakłada się, że najsilniejszy fenotyp jest porównywalny z fenotypem zerowym, chociaż trudno formalnie wykluczyć możliwość, że przeciwciała mogą mieć dominujące działanie w rzadkich przypadkach, dlatego należy zastosować rygorystyczne kontrole i ostrożną interpretację. Dalej od miejsca wstrzyknięcia funkcja białka zostaje utracona tylko częściowo, co pozwala na uwidocznienie innych funkcji białka docelowego.

Protokół

Przepisy:

Talerze soku winogronowego:

• 5,5 g agaru bacto
• 14,5 g dekstrozy lub glukozy
• 7,15 g sacharozy
• 45 ml koncentratu soku winogronowego (sok 100%).
• 204,5 ml H₂0
• 625 μl 10N NaOH

Wymieszaj wszystkie składniki i mikrofalówkę aż do wrzenia.
Dodaj 2,8 ml mieszanki kwasów (mieszanka kwasów: 20,9 ml kwasu propionowego, 2,1 ml kwasu fosforowego, 27 ml H₂0)

Wymieszaj i wylej na szalki Petriego o średnicy 35 mm. Pozostaw do zestalenia w temperaturze pokojowej na jeden lub dwa dni. Jeśli płytki nie będą używane w najbliższym czasie, uszczelnij je parafilmem i utrzymuj w temperaturze 4°C (przed użyciem pozostaw do zrównoważenia do temperatury pokojowej).

Pasta drożdżowa:

Rozpuść około jednej łyżeczki drożdży (Sigma YSC2, drożdże z Saccharomyces cerevisiae typu II) w wodzie, aby uzyskać gęstą pastę. Umieść niewielką ilość tego na każdym talerzu z sokiem winogronowym tuż przed użyciem.

bufor G-PEM:

• 80 mM Na-PIPES, pH 6,9
• 1 mM MgCl₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Bufor iniekcyjne:

• 150 mM K-asparaginian
• 10 mM K-fosforan
• 20 mM imidazolu, pH 7,2

Klej heptanowy:

Rozwiń podwójną taśmę klejącą i umieść w butelce o pojemności 100 ml, dodaj około 50 ml heptanu, zamknij butelkę i bujaj się przez kilka dni. Podczas używania dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty.

Komora odwadniania:

Weź 100-milimetrową szalkę Petriego, włóż do środka jedną część szalki o średnicy 35 mm, aby utworzyć "stół" i dodaj wokół niej Drierite (bezwodny siarczan wapnia), tak aby wysokość dryrytu nie była wyższa niż "stół" i przykrycie. Szkiełko nakrywkowe z zarodkami zostanie umieszczone na tym "stole" w celu odwodnienia przed wstrzyknięciem. Dobrym pomysłem jest użycie przynajmniej części wskazującej Drierite i zmiana go, gdy zmieni kolor.

Protokół:

Ten protokół może być użyty do wstrzyknięcia praktycznie każdego rozpuszczalnego odczynnika do zarodka syncytialnego Drosophila: na przykład, albo białka fluorescencyjnego do obserwacji, albo inhibitora białka docelowego, albo obu.

Przygotowanie wszystkiego:

1.- 2 do 3 dni przed eksperymentem, przygotuj talerze z sokiem winogronowym i ustaw klatkę dla niosek: Weź plastikową butelkę (6 uncji, okrągłe dno od Applied Scientific Drosophila), wytnij dwa małe otwory (około 1 cm²) po przeciwnych stronach butelki i napełnij bawełnianym kawałkiem (pozwoli to na przepływ powietrza), włóż muchy do butelki i przykryj talerzem z sokiem winogronowym. Przechowywać w temperaturze 25°C (lub pokojowej), muchy powinny składać zarodki przez około 10 dni.

2.- Przynajmniej dzień przed eksperymentem wyciągamy igły do wstrzykiwań, używamy ściągacza do igieł/pipet Kopf model 720 i cienkościennych włókien szklanych (World Precision Instruments tw100f). W celu wstrzyknięcia tubuliny fluorescencyjnej należy trzymać igły w temperaturze 4°C, aby zapobiec polimeryzacji igły wywołanej temperaturą.

Przygotowanie tubuliny:

Uwaga: Wszystkie prace z tubuliną powinny być wykonywane w temperaturze 4°C, aby zapobiec polimeryzacji.

1. Wyjmij oznaczoną tubulinę z zamrażarki i połóż ją na lodzie na 5 do 15 minut.
2. Rozcieńczyć buforem G-PEM (4 do 10 razy w zależności od wymaganej intensywności).
3. Wirować z prędkością 13 tys. obr./min w temperaturze 4°C przez 10-15 minut.
4. Załadować 1 - 2 μl do igły.

Przeciwciało lub inhibitor chemiczny:

Przygotuj igły jak dla tubuliny, używając odpowiedniego stężenia (może to wymagać przetestowania). Przeciwciało może znajdować się w buforze do wstrzykiwań, buforze G-PEM lub PBS. Jeśli potrzebny jest inny bufor, ten bufor będzie musiał zostać wstrzyknięty jako kontrola, aby upewnić się, że ten bufor sam w sobie nie powoduje żadnych szkód.

Uwaga: Inhibitor i tubulina fluorescencyjna mogą być mieszane i wstrzykiwane razem, jeśli pozwalają na to stężenia. W przeciwnym razie wstrzyknij tubulinę fluorescencyjną i odczekaj 5 do 10 minut przed wstrzyknięciem inhibitora. Wykonując podwójne wstrzyknięcie, należy zacząć od większej liczby zarodków, ponieważ mniej zarodków normalnie się regeneruje.

Pobieranie zarodków:

1. Połóż nowy talerz z sokiem winogronowym na klatce dla niosek.
2. Usuń tę płytkę po godzinie, jest to pierwsza kolekcja w ciągu dnia i często nie jest zbyt dobra. Można go wyrzucić.
3. Zmieniaj płytkę co godzinę, aby zbierać zarodki przez jedną godzinę każdy.

Przygotowanie szkiełek nakrywkowych:

1. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 x 22 mm po jednej stronie szkiełka mikroskopowego. Przyklej cztery rogi do zjeżdżalni, aby się nie poruszała.
2. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż jedną warstwę kleju heptanowego w jednej linii na szkiełko nakrywkowe (klej nie powinien być lepki i powinien wyschnąć w ciągu kilku sekund, w przeciwnym razie dodaj więcej heptanu).
3. Umieść kawałek podwójnej taśmy klejącej na szkiełku w kierunku boku szkiełka nakrywkowego.

Przygotowanie zarodków:

Uwaga: Zarodki powinny być zobrazowane około 2 godziny po rozpoczęciu pobierania, więc rozpocznij następujące kroki, dając wystarczająco dużo czasu na ich zakończenie w tym czasie.

1. Za pomocą zwilżonej szczoteczki ostrożnie podnieś zarodki z talerza soku winogronowego i umieść na podwójnej taśmie klejącej na szkiełku.
2. Za pomocą zewnętrznej części pęsety przetocz zarodki po podwójnej taśmie klejącej, aż kosmówka (błona zewnętrzna) pęknie.
3. Podnieś zarodek, delikatnie przetaczając go po kosmówce, tak aby przykleił się do pęsety i umieść go na kleju heptanowym na szkiełku nakrywkowym tak, aby dłuższy bok zarodka był równoległy do dłuższego boku szkiełka nakrywkowego. Ustaw od 10 do 20 zarodków w jednym rzędzie.
4. Usuń szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze suszenia na 3 do 8 minut (zależy to od wilgotności w pomieszczeniu i ilości do wstrzyknięcia).
5. Umieść na metalowej komorze ze smarem próżniowym.
6. Przykryj zarodki olejem halowęglowym 700, aby uniknąć dalszego odwodnienia. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia.

Wstrzyknięcie zarodka:

1. Znajdź zarodki pod obiektywem 16x.
2. Odsuń zarodki i znajdź igłę bez przesuwania płaszczyzny ogniskowej.
3. Wyśrodkuj igłę i przesuń ją w górę, nie przesuwając jej w kierunku x lub y.
4. Jeśli igła nie jest otwarta, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view, ale nie w miejscu, w którym będzie igła, i opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż uderzy w igłę i delikatnie ją otworzy. Jeśli igła jest otwarta, przejdź do kroku 5. (Igły można otworzyć kwasem fluorowodorowym przed napełnieniem).
5. Umieść zarodki w widocznym miejscu (ale nie tam, gdzie będzie igła), opuść igłę do oleju i upewnij się, że otrzymujesz ładne krople płynu z igły.
6. Ostrożnie, ale systematycznie wsuń zarodek do igły i wstrzyknij kroplę do zarodka i odsuń zarodek. (Lub postępuj zgodnie z instrukcjami aparatu do wstrzykiwań).
7. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym.

Obrazowanie:

Obraz zarodków pod mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu 60 lub 100X:
Uwagi:

1. Odstęp czasu w serii poklatkowej powinien wynosić co najwyżej kilka sekund, ponieważ mitoza w zarodku jest bardzo szybka, w zależności od dokładnego procesu, który ma być badany.
2. Seria 3D lub pojedyncza płaszczyzna mogą być nabyte w zależności od interesującego Cię procesu.
3. W przypadku szybko działających inhibitorów przejście z mikroskopu iniekcyjnego do mikroskopu obrazowego musi być szybkie.

Rysunek 1: Badanie mitozy w zarodku syncytialnym Drosophila. Jądra we wczesnym zarodku ulegają szybkim podziałom bez cytokinezy, podczas cykli od 10 do 13 jąder tworzą monowarstwę w korze. A. Schemat wczesnego zarodka z jądrami w korze. Zarodek może wykazywać ekspresję białek znakowanych GFP i/lub RFP i może być mikrowstrzykiwany z innymi znakowanymi białkami i/lub inhibitorami. Ur. Obrazowanie poklatkowe zarodka z ekspresją GFP-tubuliny i histonu RFP. C. Wykres separacji biegun-biegun dla cykli 11, 12 i 13 w zarodku typu dzikiego. Długość wrzeciona wykazuje okresy długości izometrycznej i okresy wydłużenia, które są bardzo spójne i powtarzalne. D. Dynamika mikrotubul wrzeciona. Wstrzyknięcie tubuliny o niskim stężeniu rodaminy prowadzi do powstania plamek utworzonych z kilku podjednostek tubuliny, które można wykorzystać do badania dynamiki mikrotubul.

Dyskusja

Protokół ten jest stosunkowo prosty, jednak każdy krok wymaga praktyki, aby upewnić się, że zarodki nie są uszkodzone. Zawsze należy przeprowadzać staranne eksperymenty kontrolne, aby zapewnić uzyskanie wiarygodnych wyników. Jednym z dobrych sposobów na rozpoczęcie tego jest mikrowstrzyknięcie buforu lub tubuliny rodaminy do zarodków kontrolnych eksprymujących tubulinę GFP, aby upewnić się, że mitoza przebiega normalnie przez wszystkie cykle na powierzchni zarodka (cykle od 10 do 13). W zarodkach kontrolnych nie należy z...