Opisano konstrukcję biblioteki fosmidów z genomowego DNA środowiskowego, wyizolowanego z pionowego kontinuum głębokości sezonowo hipoksycznego fiordu. Powstała biblioteka klonów zostaje przeniesiona do płytek 384-dołkowych i zarchiwizowana w celu późniejszego sekwencjonowania oraz przesiewania funkcjonalnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu wybierania kolonii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdecydowana większość mikroorganizmów występujących w naturze pozostaje obecnie niedostępna dla tradycyjnych metod hodowli. W ciągu ostatniej dekady niezależna od hodowli środowiskowa genomika (t.j.(metagenomiczne) podejścia pozwoliły badaczom na wypełnienie tej luki w hodowli poprzez bezpośrednie pobieranie zawartości genetycznej rodzimych społeczności drobnoustrojów ze środowiska. W tym celu konstruuje się biblioteki genomowego DNA z wykorzystaniem standardowych, choć wymagających precyzji laboratoryjnych technik klonowania. W niniejszej pracy opisujemy konstrukcję biblioteki fosmidowej genomu środowiskowego z dużymi insertami, z DNA pochodzącym z pionowego przekroju głębokości sezonowo hipoksyjnego fiordu. Protokół ten jest bezpośrednio powiązany z serią powiązanych procedur, obejmujących pobieranie próbek przybrzeżnych wód morskich [1], filtrację dużych objętości biomasy drobnoustrojowej [2] oraz protokół ekstrakcji i oczyszczania DNA [3]. Na początku wysokiej jakości DNA genomowe poddawane jest naprawie końców w celu utworzenia 5'-fosforylowanych końców tępych. DNA po naprawie końców poddawane jest elektroforezie w polu pulsującym (PFGE) w celu selekcji wielkości, a następnie przeprowadza się ekstrakcję z żelu, aby odzyskać fragmenty DNA o długości od 30 do 60 tysięcy par zasad (Kb). DNA po selekcji wielkości jest oczyszczane z matrycy żelu PFGE i ligowane do potraktowanego fosfatazą wektora fosmidowego o tępych końcach CopyControl pCC1 (EPICENTREhttp://www.epibio.com/item.asp?ID=385). Liniowe konkatemery pCC1 i wstawionego DNA są następnie pakowane do cząsteczek fagowych metodą headfull przez terminazę lambda, z następującym zakażeniem opornych na fagiE. colikomórki. Pomyślnie przetransdukowane klony są odzyskiwane na płytkach z agarem LB pod selekcją antybiotykową i archiwizowane w formacie płytek 384-dołkowych przy użyciu zautomatyzowanego robota do pobierania kolonii (Qpix2, GENETIX). Niniejszy protokół opiera się na różnych źródłach, w tym na zestawie CopyControl Fosmid Library Production Kit firmy EPICENTRE oraz na publikacjach wielu grup badawczych [4-7]. Każdy krok został przedstawiony z uwzględnieniem najlepszych praktyk. Tam, gdzie to możliwe, podkreślamy subtelności w wykonaniu, aby poprawić ogólną jakość i wydajność produkcji biblioteki. Cały proces tworzenia biblioteki fosmidów i zautomatyzowanego pobierania kolonii trwa co najmniej 7-10 dni ze względu na liczne etapy inkubacji. Istnieje jednak kilka możliwych punktów przerwania pracy, które zostały wspomniane w protokole.
Protokół
Konstrukcja biblioteki fosmidów została podzielona na cztery główne etapy, które z kolei zostały podzielone na kilka części (przegląd przedstawiono na Rys. 1).
Krok I (patrz protokół „DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters” [3])
Część 1: Lizy komórek katalizowana enzymatycznie
Część 2: Oczyszczanie środowiskowego DNA za pomocą wirowania w gradiencie gęstości CsCl i odzysk DNA
Część 3: Kontrola jakości wyekstrahowanego DNA za pomocą elektroforezy żelowej
Krok II
Część 1: Etapy modyfikacji enzymatycznej odzyskanego środowiskowego DNA
Wszystkie odczynniki niezbędne do etapu naprawy końców (end-repair) środowiskowego DNA znajdują się w zestawie pCC1 Fosmid Library Production Kit firmy EPICENTRE. Idealnie stężenie Twojego DNA genomowego powinno zostać dostosowane do 0,5 μg/μl.
- Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, połączyć następujące składniki i krótko odwirować probówkę, aby cała ciecz zebrała się na dnie:
- x μl sterylnej wody
- 8 μl 10X buforu do naprawy końców (end-repair buffer)
- 8 μl 2,5 mM mieszaniny dNTP
- 8 μl 10 mM ATP
- do 20 μg pofragmentowanego DNA wstawki (~0,5 μg/μl)
- 4 μl mieszaniny enzymów do naprawy końców
- 80 μl całkowitej objętości reakcji
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez minimum 45 minut, maksymalnie do 60 minut, a następnie inaktywować termicznie mieszaninę enzymów w temperaturze 70°C przez 10 min (w międzyczasie przygotować żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia do późniejszej selekcji wielkości DNA o naprawionych końcach, patrz poniżej).
Część 2: Selekcja wielkości genomowego DNA za pomocą elektroforezy w żelu w polu pulsacyjnym (PFGE)
- Resuspendować 1,5 g agarozy niskotopliwej w 150 mL 1,0X buforu do elektroforezy TAE, dodając niewielki magnetyczny mieszadło. Kolbę przykryć folią plastikową nadającą się do użycia w kuchence mikrofalowej i szybko zagotować w mikrofalówce, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Mieszać roztwór, aż ostygnie do temperatury umożliwiającej wlanie do tacki żelowej (~ 60° C).
Uwaga: nie dodawać bromku etydinium ani SYBR Gold ani do żelu, ani do buforu do elektroforezy. - Złożyć tackę do odlewania żelu i wybrać grzebień, który zapewni wystarczającą przestrzeń do nałożenia całej mieszaniny po naprawie końców do jednego lub dwóch dołków (80 μl plus odpowiednia ilość buforu do nakładania próbek).
- Wlać 2,2 L 1,0X TAE do komory elektroforetycznej, włączyć urządzenie w celu cyrkulacji buforu i ustawić urządzenie chłodzące na 14°C. Pompa powinna pracować z prędkością 70 obr/min, aby zapewnić odpowiednią cyrkulację buforu i utrzymać jego temperaturę na poziomie 14°C.
- Po ostygnięciu wlać roztopioną agarozę do tacki żelowej ustawionej na idealnie płaskiej powierzchni, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Upewnić się, że roztopiona agaroza równomiernie pokrywa grzebień; w przeciwnym razie wyjąć grzebień i ponownie go umieścić w roztopionej agarozie. Po stężeniu żelu wyjąć grzebień i nałożyć marker MidRange I PFG do czwartego dołka żelu. Wystryknąć agarozę z strzykawki i odciąć skalpelem mały fragment z końcówki. Umieścić ten fragment przed dołkiem i uszczelnić roztopioną agarozą. Umieścić żel w komorze elektroforetycznej.
Uwaga: z żelem agarozowym należy obchodzić się bardzo ostrożnie, ponieważ żele niskotopliwe łatwo pękają. Przed nałożeniem próbek sprawdzić, czy bufor do elektroforezy schłodził się do 14°C. Jeśli dołki wydają się zablokowane przez agarozę, następnym razem przed wyjęciem grzebienia z żelu dodać 1-2 mL buforu TAE wokół grzebienia, co pozwoli uzyskać ładniejsze dołki. - Do pierwszego dołka nałożyć 5 μl trawienia λ HindIII, a następnie 1 μl markera wielkości kontrolnego fosmidu (EPICENTRE, 100 ng/μl). Do markera wielkości w probówce mikrocentryfugować dodać 10 μl sterylnej wody oraz odpowiednią ilość buforu do nakładania próbek. Większa objętość ułatwia nakładanie na żel. Bezpośrednio obok markera fosmidowego nałożyć mieszaninę po naprawie końców i inaktywacji termicznej z odpowiednią ilością buforu do nakładania próbek. Zamknąć pokrywę i zaprogramować ustawienia.
Uwaga: zaleca się nałożenie różnych ilości innych drabin DNA, aby w przybliżeniu określić ilość DNA lub zwizualizować stopień fragmentacji genomowego DNA. Idealnymi markerami wielkości są λ DNA-HindIII Digest oraz MidRange I PFG Marker (oba firmy NEB). - Zaprogramować ustawienia: użyć algorytmu Auto, jeśli system PFGE jest w niego wyposażony. Program automatycznie oblicza ustawienia niezbędne do rozdzielenia DNA o danym zakresie wielkości. Zastosowane ustawienia to: zakres wielkości DNA 2-250 Kb; współczynnik kalibracji: 1; gradient: [6 V/cm]; czas przebiegu: 12:00 godzin; kąt wtrącenia: 120°; początkowy czas przełączania: 0,1 s; końcowy czas przełączania: 21,79 s; czynnik rampowania a = liniowy.
- W celu wizualizacji DNA wlać 250 mL buforu 1,0X TAE do pojemnika i dodać 25 μl 10 000X SYBR Gold; delikatnie wymieszać przed umieszczeniem żelu w roztworze. Barwić żel przez 1 h w ciemności, ponieważ SYBR Gold jest światłoczuły.
Uwaga: z żelem agarozowym należy obchodzić się bardzo ostrożnie, ponieważ żele niskotopliwe łatwo pękają.
Część 3: Odzyskiwanie DNA poprzez ekstrakcję z żelu i ligacja odzyskanego DNA z wektorem klonującym fosmidowym
Wszystkie odczynniki do tej części są zawarte w zestawie do produkcji bibliotek fosmidów EPICENTRE.
- W międzyczasie przygotuj kąpiele wodne w temperaturze 70°C i 45°C do etapu trawienia żelu.
- Przenieś zabarwiony żel wraz z pustą, odważoną probką do mikrowirówki oraz sterylnym skalpelem na transiluminator z niebieskim światłem. Zwizualizuj DNA genomiczne z naprawionymi końcami oraz marker wielkości kontrolnej fosmidu. Wycięciem skalpela wyodrębnij fragment żelu, który migrował na poziomie lub nieco powyżej markera wielkości kontrolnej fosmidu (wycięty fragment powinien mieć szerokość 5-7 mm) i przenieś go do odważonej probki do mikrowirówki. Na żelu należy przeprowadzić Marker PFG MidRange I, co zapobiega zbyt wysokiemu wycięciu fragmentu.
Uwaga: przed położeniem żelu na transiluminatorze z niebieskim światłem należy przykryć go folią spożywczą, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej; przed włączeniem niebieskiego światła założyć okulary ochronne. Nie wycinaj fragmentów żelu, w których DNA genomiczne jest mniejsze niż marker wielkości kontrolnej fosmidu, ponieważ doprowadzi to do powstania niepożądanych klonów chimerycznych.
Można wycinać i przechowywać fragmenty żelu zawierające DNA o niższej lub wyższej masie cząsteczkowej w celu konstrukcji odpowiednio bibliotek shotgun całego genomu lub bibliotek BAC.
Stop I: odzyskane fragmenty żelu można przechowywać w temperaturze -20°C do jednego roku. - Zważ probki i oblicz masę fragmentów żelu. 1 mg agarozy odpowiada około 1 μl stopionej agarozy.
- Rozpuść agarozy niskotopliwej zawierającej DNA genomiczne w kąpieli wodnej w temperaturze 70°C przez 10-15 minut (nie dodajemy buforu GELase). Po całkowitym roztopieniu fragmentu żelu szybko przenieś probkę do kąpieli o temperaturze 45°C.
Uwaga: nie mieszaj próbek w wirówce typu vortex w celu przyspieszenia rozpuszczania, ponieważ może to doprowadzić do fragmentacji DNA. - Dodaj 1 U (1 μl) preparatu enzymu GELase na każde 100 μl stopionej agarozy. Inkubuj w temperaturze 45°C przez 1 godzinę, a następnie dodaj kolejną porcję GELase (2-4 μl) i inkubuj przez dodatkową godzinę. Inaktywuj termicznie preparat enzymu GELase w temperaturze 70°C przez 10 minut.
Umieść probkę na lodzie na 10 min i wiruj z maksymalną prędkością (13 000 obr./min) przez 15 min, aby serymować nierozpuszczalne cząstki. Ostrożnie usuń górny nadsadziew i przenieś go do probówki Falcon 15 mL, a następnie dodaj do probówki 3 mL sterylnej wody.
Uwaga: unikaj pobierania pipetą osadu z agarozy. Ponieważ dodajemy więcej GELase niż znajduje się w zestawie, dodatkowy preparat enzymu GELase zamawiamy osobno. - Przenieś roztwór do jednostki filtracyjnej odśrodkowej Amicon Ultra-4 z membraną Ultracel-10 i wiruj w temperaturze 4 000 g przez 6-8 minut, a następnie odlej przelew. Wiruj aż do zredukowania objętości roztworu na filtrze do około 100 ~ 500 μl. Dodaj kolejne 3 mL sterylnej wody do pustej probówki Falcon, przenieś roztwór do probówki Amicon i powtórz etap wirowania. Przemyj trzeci raz 3 mL wody i ponownie odlej przelew. Zredukuj końcową objętość do 50 – 100 μl.
Uwaga: do etapu wirowania używamy rotora z koszykami oscylacyjnymi; aby ustabilizować jednostkę filtracyjną Amicon podczas wirowania, należy umieścić ją w probówce Falcon 50 mL. Filtr Amicon bezpiecznie zatrzymuje 50 μl roztworu na membranie nawet po przedłużonym wirowaniu. - Przenieś pozostały roztwór DNA z probówki Amicon do uprzednio przemytej jednostki filtracyjnej odśrodkowej Microcon YM-50 i przemyj probówkę Amicon dodatkowymi 50 μl sterylnej wody, aby odzyskać całe DNA. Wiruj jednostkę filtracyjną Microcon YM-50 w mikrowirówce przy 10 000 g, aż filtr będzie wciąż lekko pokryty cieczą. Sprawdzaj co minutę, czy na filtrze pozostała tylko niewielka ilość cieczy. Odwróć filtr do góry dnem i odzyskaj roztwór DNA drugim etapem wirowania przy 1 000 g przez 3 min w nowej probówce do mikrowirówki. Uzyskana objętość nie powinna przekraczać łącznie 10-15 μl, w przeciwnym razie DNA może być zbyt rozcieńczone w etapie ligacji.
Uwaga: należy uważać, aby nie wirować urządzenia filtracyjnego do całkowitego wyschnięcia. Jeśli membrana wyschnie, dodaj na nią 10-15 μl wody, delikatnie potrząśnij przez 30 sekund i odzyskaj DNA zgodnie z powyższym opisem. - Oznacz stężenie otrzymanego roztworu DNA za pomocą NanoDrop lub testu PicoGreen.
- Odzyskane DNA z naprawionymi końcami jest teraz gotowe do ligacji z wektorem klonującym pCC1-fosmid. Rozmroź poniższy roztwór na lodzie i upewnij się, że molowy stosunek wektora do wkładki wynosi 10:1.
Uwaga: 0,5 μg wektora pCC1-fosmid ~ 0,09 pmola wektora.
0,25 μg DNA wkładki o rozmiarze ~40 Kb ~ 0,009 pmola DNA wkładki
Zwiększenie ilości DNA użytego w etapie ligacji może być pomocne, jeśli po wysianiu zainfekowanych komórek E. coli na płytki selekcyjne otrzymasz tylko kilka klonów fosmidowych.
Dodaj odczynniki w poniższej kolejności, krótko odwirowuj probkę, aby cała ciecz znalazła się na dnie, opukaj probkę i wiruj ponownie:
- x μl sterylnej wody
- 1 μl 10X buforu do ligacji Fast-Link
- 1 μl 10 mM ATP
- 1 μl wektora pCC1-fosmid (0,5 μg/μl)
- x μl skoncentrowanego DNA wkładki (0,25 μg)
- 1 μl ligazy DNA Fast-Link
- 10 μl całkowitej objętości reakcji
- Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i inaktywuj termicznie enzym przez 10 minut w temperaturze 70°C.
Stop II: przechowuj mieszaninę ligacyjną w temperaturze -20°C lub przejdź do etapu pakowania do fagów.
Uwaga: pojedyncza reakcja ligacji wyprodukuje od 103 do 106 klonów, w zależności od jakości środowiskowego DNA. W zależności od szacowanej liczby klonów wymaganej do uzyskania określonego pokrycia, można przeskalować reakcję ligacji. W przypadku skalowania ligacji należy proporcjonalnie zwiększyć ilość ekstraktu do pakowania fagów, zgodnie z opisem poniżej.
Krok III
Część 1: Pakowanie faga produktu ligacji wektora z wkładką
- Na dwa lub trzy dni przed planowanym pakowaniem fagów wysiej dostarczony szczep do płytowania EPI300-T1R na zwykłą płytkę LB i inkubuj przez noc w 37°C w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Płytkę tę można szczelnie zamknąć i przechowywać w 4°C do późniejszego użycia.
- Dzień przed reakcją pakowania zaszczep 50 mL bulionu LB + 10 mM MgSO4 (dodaj 500 μl 1M MgSO4) jedną pojedynczą kolonią z płytki przygotowanej w kroku 1. Inkubuj w wytrząsarce przy 225 rpm i 37°C przez noc.
- W dniu reakcji pakowania zaszczep świeże 50 mL bulionu LB + 10 mM MgSO4 za pomocą 5 mL kultury nocnej przygotowanej w kroku 2. Hoduj w 37°C do osiągnięcia OD600 od 0,8 do 1,0 i nie przekraczaj OD600 wynoszącej 1,0! Rozcieńcz próbkę przed pomiarem spektrofotometrem, aby uzyskać dokładny wynik. Przechowuj komórki na lodzie lub w 4°C do czasu użycia.
Uwaga: Przystanek III: kulturę można przechowywać w 4°C do 72 h w razie potrzeby; jednak wysoce zaleca się stosowanie świeżo wyhodowanej kultury. - Rozmroź na lodzie ekstrakty do pakowania fagów MaxPlax Lambda Packaging Extracts (jedna probówka na każdą wcześniej przeprowadzoną reakcję ligacji). Rozmrażanie potrwa 10-15 minut. W międzyczasie umieść probówkę 1,5 mL na lodzie w celu schłodzenia.
Uwaga: nie pozostawiaj rozmrożonych fagów na lodzie zbyt długo. W przeciwnym razie wydajność infekcji fagowej spadnie. - Po rozmrożeniu natychmiast przenieś 25 μl każdego ekstraktu do pakowania do drugiej schłodzonej probówki mikroodwirówkowej 1,5 mL i umieść na lodzie. Pozostały ekstrakt do pakowania przenieś do -80°C.
Uwaga: nie przechowuj ekstraktu do pakowania w kontakcie z suchym lodem ani jakimkolwiek innym źródłem CO2. - Dodaj 10 μl mieszaniny z reakcji ligacji do każdych 25 μl rozmrożonych ekstraktów na lodzie. Wymieszaj, pipetując roztwór kilkakrotnie, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Krótko odwiruj probówki, aby cała ciecz znalazła się na dnie, i inkubuj reakcje pakowania w 30°C przez 90 min. Po 80 min inkubacji rozmroź na lodzie pozostały ekstrakt do pakowania.
Uwaga: do etapu inkubacji w 30°C użyj łaźni wodnej zamiast bloku grzejnego. - Po 90 min, gdy reakcja pakowania zostanie zakończona, dodaj pozostałe 25 μl ekstraktu do pakowania do każdej probówki z reakcją. Inkubuj reakcje przez dodatkowe 90 min w 30°C. Po 90 min inkubacji dodaj 100 μl przygotowanego buforu do rozcieńczania fagów (Phage Dilution Buffer) do każdej probówki do pakowania i delikatnie wymieszaj.
Uwaga: jeśli wydajność na końcu będzie niska, ekstrakty fagowe mogły być zbyt stare lub wystawione na działanie suchego lodu bądź innego źródła CO2. Z naszego doświadczenia wynika, że pakowanie fagów w temperaturze pokojowej (2 razy po 90 min) zamiast w 30°C, a następnie końcowa dodatkowa inkubacja przez 2 godziny w 30°C zwiększyła liczbę uzyskanych klonów. - Dodaj 5 μl chloroformu do każdej probówki i delikatnie wymieszaj, co da całkowitą objętość 165 μl w probówce. Po dodaniu chloroformu może utworzyć się lepki osad; nie będzie on przeszkadzał w produkcji biblioteki. Należy jednak unikać tego osadu, jak i organicznej fazy chloroformowej podczas pipetowania cząsteczek fagowych.
Przystanek IV: na tym etapie spakowane cząsteczki fagowe można przechowywać przez kilka dni w 4°C.
Uwaga: dla uzyskania najlepszej wydajności infekcji fagowej używaj świeżo spakowanych fagów.
Część 2: Infekcja gospodarza biblioteki E. coli
- Dodaj zapakowane fagi do komórek gospodarza EPI300-T1R (OD600=0,8-1,0) w stosunku 400 μl komórek EPI300-T1R na każde 10 μl cząsteczek fagów. Aby uniknąć pobrania chloroformu pipetą, należy użyć 125 μl zapakowanych cząsteczek fagów i 5 mL przygotowanych komórek gospodarza EPI300-T1R. Delikatnie wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min.
Uwaga: należy uważać, aby nie przenieść chloroformu do komórek gospodarza podczas pobierania cząsteczek fagów z probówki do pakowania fagów. W przypadku niepewności należy pobrać mniejszą ilość zapakowanych cząsteczek fagów.
Część 3: Wysiewanie i miareczkowanie
- Do czterech małych szalek Petri z pożywką LB + 12,5 μg/mL chloramfenikolu dodaj po 5-7 wysterylizowanych szklanych kulek.
- Rozsiej dwukrotnie 50 μl oraz dwukrotnie 10 μl komórek EPI300-T1R zainfekowanych fagami na cztery oddzielne płytki. Aby zapewnić równomierne rozsianie, do płytek z 10 μl zainfekowanych komórek dodaj niewielką ilość bulionu LB (~50 μl). Potrząsaj płytką poziomo, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na 15 min, a następnie usuń kulki, odwracając płytkę.
Uwaga: płytki te służą do określenia liczby transformantów i obliczenia odpowiednich rozcieńczeń niezbędnych na etapie wyboru kolonii, aby uniknąć zbyt dużego zagęszczenia kolonii. - Umieść płytki dnem do góry w inkubatorze w temperaturze 37°C na okres od 16 do 24 godzin, maksymalnie do 48 godzin, aż do pojawienia się kolonii. Sprawdź płytki po 24 godzinach, aby zapobiec zrastaniu się szybko rosnących klonów z koloniami sąsiednimi.
- W tym czasie odzyskaj pozostałe komórki z infekcji 5 mL poprzez wirowanie przy 3 500 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Odlej nadsącz. Do probówki dodaj 1 mL LB/ 20% glicerolu. Resuspenduj osad komórkowy i rozdziel go do probówek kriogenicznych o pojemności 2 mL w ilościach 100 μl na probówkę. Zamroź natychmiast i przechowuj w temperaturze -80°C do dalszego wykorzystania na etapie wyboru kolonii.
- Następnego dnia policz liczbę klonów na płytkach i wyznacz miano. Pamiętaj o uwzględnieniu właściwego czynnika rozcieńczenia, aby obliczyć całkowitą liczbę klonów fosmidowych.
Uwaga: procedura ta generuje łącznie od 10 000 do 50 000 klonów fosmidowych; jednak w zależności od jakości i czystości wyekstrahowanego środowiskowego DNA obserwuje się zakres od 3 000 do 80 000 klonów fosmidowych.
Krok IV
Część 1: Przygotowanie płytek agarowych i płytek wielodołkowych
- Wlej pożywkę do szalek w następujący sposób; dodaj 12,5 μg chloramfenikolu na mL LB:
- szalka Petri 100X15mm: 25mL agaru LB
- szalka Petri 150X15mm: 50mL agaru LB
- kwadratowa płytka do biotestów 245X245mm: 250mL agaru LB
- Rozmroź na lodzie zapas glicerolowy zawierający przygotowane klony fosmidowe. Wysiej ilość odpowiednią dla wybranej szalki na podstawie obliczonego miana (przygotowanie zapasu glicerolowego dodatkowo zagęszcza komórki około 5-krotnie). Czas inkubacji dla wzrostu komórek wynosi 24 godziny w temperaturze 37°C.
Krok V: po utworzeniu się kolonii przechowuj szczelnie zamknięte szalki z agarem w temperaturze 4°C do jednego miesiąca, aż zostaną wykorzystane w etapie wyboru kolonii.
Uwaga: kolonie muszą być wysiane równomiernie, w odpowiedniej odległości od siebie i powinny osiągnąć średnicę około 1 mm. Wysiewanie komórek przy użyciu szklanych kulek pozwala uzyskać dobrą separację między koloniami. Na szalce Petri 100X15mm zazwyczaj 150~250 kolonii stanowi optymalną gęstość dla najwyższej wydajności robotycznego wyboru, a dla płytek 22 x 22 cm nie powinno być uzyskanych więcej niż 2 000 kolonii. - W dniach wyboru kolonii przygotuj płytki 96- lub 384-dołkowe wypełnione bulionem LB uzupełnionym o 12,5 μg chloramfenikolu na mL bulionu oraz 20% glicerolu do przechowywania biblioteki w temperaturze -80°C. Płytki dołkowe są wypełniane za pomocą zautomatyzowanego systemu napełniania płytek QFill3 zgodnie z poniższym opisem.
- Autoklawuj 2 zestawy szklanych butelek (500 mL), nakrętek i rurek silikonowych. Nie autoklawuj kolektora, w tym zespołu igieł i kołnierza montażowego. Zmontuj QFill3 w pobliżu płomienia palnika Bunsena lub w dygestorium, aby stworzyć i utrzymać sterylne środowisko.
Uwaga: upewnij się, że rurka silikonowa została włożona do zaworu zaciskowego poprzez naciśnięcie aktywatora zaworu i całkowite wsunięcie rurki do zaworu. (Działa to jak hamulec dla dozowania pożywki do następnej kolumny). - Sterylizuj igły dozujące, przepuszczając przez nie po kolei ~50 mL 1% wybielacza, autoklawowaną dH2O oraz 80% etanolu; na platformie umieść pokrywkę od pudełka z końcówkami, aby zbierać zużyte roztwory. Po sterylizacji zmień zestaw na drugi, składający się z butelki, nakrętki i rurki silikonowej.
- Napełnij butelkę ~300 mL pożywki. Przepuść odpowiednią ilość pożywki, aby usunąć pozostałości etanolu z etapu czyszczenia. Po oczyszczeniu rurek umieść płytkę 96/384-dołkową na platformie. Naciśnij „start”, aby napełnić płytkę; każdy dołek powinien zostać wypełniony 200 μl przygotowanego bulionu LB. Aby wyczyścić igły dozujące, przepuść przez nie ~50 mL 80% etanolu.
Uwaga: upewnij się, że płytka dołkowa jest oznakowana przed napełnieniem.
Część 2: konfiguracja robota do wyboru kolonii
- Używamy robota do wyboru klonów QPix2 zgodnie z instrukcją obsługi. Użytkownicy powinni być biegli w obsłudze robota oraz w konfiguracji wszystkich elementów, aby zagwarantować najwyższą wydajność wyboru.
- Aby stworzyć sterylne środowisko wokół obszaru wyboru klonów, włącz lampę UV na 30 minut. Podczas pracy lampy UV przygotuj 500 mL 1% wybielacza, 500 mL sterylnej dH2O oraz 500 mL 80% etanolu. Po wyłączeniu lampy UV napełnij tacki zgodnie z oznaczeniami. Zawsze wlewaj roztwory do odpowiednio oznakowanych tacek. Napełniaj je od tyłu do przodu: najpierw 1% wybielacz, następnie autoklawowana dH2O i 80% etanol w przedniej tacce. Upewnij się, że są pełne. Igły do wyboru nie mogą być prawidłowo przemyte bez wystarczającej ilości roztworu myjącego.
Uwaga: monitoruj poziom 80% etanolu w czasie. Będzie on parować i będzie wymagał uzupełniania. - Po ustawieniu parametrów optymalizujących wybór, umieść przygotowane szalki agarowe z klonami fosmidowymi oraz płytki wielodołkowe pomiędzy wspornikami w obszarze roboczym Q-Pix. Upewnij się, że zdjęto wszystkie pokrywy płytek!
- Płytki powinny być ściśle dosunięte do przedniego prawego narożnika, aby nie przesuwały się podczas pracy. Następnie zamknij przedni panel.
Uwaga: Jest to niezwykle ważne! - Po ustawieniu wszystkich parametrów można rozpocząć procedurę wyboru. Po zakończeniu całego procesu wyboru przepłucz szczoteczki i tacki wodą dejonizowaną i odstaw na blat do wyschnięcia. Usuń wszelkie ewentualne rozlane ciecze i przetrzyj wnętrze Q-Pix 80% etanolem.
Część 3: Inkubacja przez noc i przechowywanie biblioteki
- Upewnij się, że wszystkie płytki z zapasami glicerolu są odpowiednio opisane, a następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 37°C na 24 godziny. Pozostaw na inkubatorze notatkę zawierającą datę, liczbę inkubowanych płytek, czas inkubacji, czas wyjęcia oraz swój paraf.
- W celu długoterminowego przechowywania umieść wyhodowane przez noc próbki w zamrażarce o temperaturze -80°C.
Reprezentatywne wyniki:
Przedstawiony protokół opisuje procedurę tworzenia środowiskowej biblioteki fosmidów w celu uchwycenia zawartości genetycznej społeczności mikrobiologicznej w danym siedlisku. Protokół ten pozwala na stworzenie biblioteki fosmidów reprezentatywnej dla zawartości genetycznej pobranego środowiska i umożliwia czytelnikowi modyfikację oraz optymalizację krytycznych etapów, jeśli liczba klonów fosmidowych uzyskanych na koniec całej procedury okaże się zbyt niska.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano procedurę najefektywniejszego tworzenia biblioteki fosmidów z dużymi wkładkami przy użyciu DNA genomowego wyizolowanego z próbki wody przybrzeżnej. Ekstrakcja DNA genomowego poprzedzająca ten etap została opisana w oddzielnym protokole [3].
Ponieważ tworzenie biblioteki fosmidów jest procesem wieloetapowym, należy zaplanować co najmniej dwa do trzech tygodni na cały przebieg procedury, obejmujący wszystkie cztery przedstawione kroki. Ekstrakcja DNA genomowego jest najważniejszym etape...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mam nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Kanadyjskiej Fundacji Innowacji (Canadian Foundation for Innovation), Funduszowi Rozwoju Wiedzy Kolumbii Brytyjskiej (British Columbia Knowledge Development Fund) oraz Narodowej Radzie Badań Naukowych i Inżynieryjnych (NSERC) w Kanadzie za wsparcie prowadzonych badań nad obszarami o niskiej zawartości tlenu w wodach przybrzeżnych i otwartych oceanach. M.T. i S.L. otrzymali wsparcie w ramach stypendiów z Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej (CMDE), finansowanego przez fundację TULA. M.T. otrzymał również wsparcie stypendialne z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Krok II | |||
| Zestaw do tworzenia bibliotek fosmidowych CopyControl™ | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | ilość wystarczająca do wytworzenia 9-10 bibliotek fosmidowych |
| Agaroza SeaPlaque | Cambrex | 50100 | |
| mieszalnik magnetyczny z podgrzewaniem | Corning | PC-420D | |
| Bufor do elektroforezy 1,0X TAE | |||
| System elektroforezy w polu impulsowym CHEF Mapper XA z modułem chłodzącym i pompą o zmiennej prędkości | Bio-Rad | ||
| λ DNA trawione HindIII | New England Biolabs | N3012S | |
| Marker PFG MidRange I | New England Biolabs | N3551S | |
| 10 000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| folia plastikowa do mikrofalówek | Saran premium wrap | ||
| Transiluminator Safe Imager | Invitrogen | S37102 | |
| Preparat GELase do trawienia żelu agarozowego | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| skalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Odwirnik Amicon Ultra-4 z membraną Ultracel-10 | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Odwirnik Microcon YM-30 | EMD Millipore | 42410 | |
| woda wolna od nukleaz | Ambion | AM9932 | |
| Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT PicoGreen *2000 testów*# | Invitrogen | P7589 | |
| cyfrowy grzejnik blokowy | VWR international | 12621-088 | |
| łaźnia wodna | VWR international | 14231-854 | |
| wirówka | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| rotor do wirówki | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| wirówka stołowa | Eppendorf | 5415D | |
| probówki do mikrocentryfugi, 1,7 mL, przezroczyste | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| probówki do wirówki 15 mL | Fisher Scientific | 430052 | |
| Krok III | |||
| pożywka LB | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| bufor do rozcieńczania fagi | 10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| probówki kriogeniczne | Fisher Scientific | 430488 | |
| Krok IV | |||
| płytka 96-dołkowa z pokrywką | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| płytka 384-dołkowa z pokrywką | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| szalki Petriego 100 O.D. x 15 mm W | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| szalki Petriego 150 Dia. x 15 mm W | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| chloramfenikol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| pożywka LB | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Agar Difco | BD Biosciences | 214530 | |
| kuleczki szklane | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| wybielacz | Javex | ||
| etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| probówki do wirówki 15 mL | Fisher Scientific | 430052 | |
| robot do pobierania kolonii QPix | Genetix | QPix2 | |
| głowica pobierająca (E. coli) | Genetix | X4006 |
Bibliografia
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
