$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Budowa biblioteki Fosmid została podzielona na cztery główne etapy i podzielona na kilka części (zobacz Rys.1 dla przeglądu).
Krok I (zobacz protokół "Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 μM" [3])
Część 1: Liza komórek katalizowana enzymatycznie
Część 2: Oczyszczanie środowiskowego DNA przez wirowanie w gradionym gradiorze gęstości CsCl i odzyskiwanie DNA
Część 3: Kontrola jakości ekstrahowanego DNA za pomocą elektroforezy żelowej
Krok II
Część 1: Etapy modyfikacji enzymatycznej odzyskanego DNA środowiskowego
Wszystkie odczynniki niezbędne do końcowego etapu naprawy środowiskowego DNA znajdują się w zestawie produkcyjnym biblioteki pCC1 Fosmid od EPICENTRE. Idealnie byłoby, gdyby Twoje genomowe DNA było dostosowane do 0,5 μg/μl.
- Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, połączyć następujące elementy i krótko odwirować probówkę, aby cały płyn opadł na dno:
- x μl sterylnej wody
- 8 μl 10-krotny bufor do naprawy końcowej
- 8 μl 2,5 mM dNTP mix
- 8 μl 10 mM ATP
- do 20 μg ściętego DNA (~0,5 μg/μl)
- 4 μl mieszanki enzymów do naprawy końców
- Całkowita objętość reakcyjna 80 μl
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez minimalny czas od 45 minut do 60 minut i podgrzewać, dezaktywować mieszaninę enzymów w temperaturze 70°C przez 10 minut (w międzyczasie przygotować niskotopliwy żel agarozowy w celu późniejszego wyboru wielkości naprawionego na końcu naprawionego DNA, patrz poniżej).
Część 2: Wybór wielkości genomowego DNA za pomocą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE)
- Ponownie zawiesić 1,5 g niskotopliwej agarozy w 150 ml 1,0X TAE buforu do pracy i dodać małe mieszadło magnetyczne. Przykryj kolbę folią spożywczą do kuchenki mikrofalowej i szybko gotuj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Mieszaj roztwór, aż będzie wystarczająco zimny, aby wlać go do tacki na żel (~ 60° C).
Uwaga: nie należy dodawać bromku etydyny ani SYBR Gold ani do żelu, ani do buforu bieżącego.
- Złóż tackę na żel, aby odlać żel i wybierz grzebień, który zapewni Ci wystarczająco dużo miejsca, aby załadować kompletną mieszankę do naprawy końcowej do jednej lub dwóch studzienek (80 μl plus odpowiednia ilość bufora ładującego).
- Wlej 2,2 l 1,0X TAE do komory elektroforezy i włącz maszynę, aby wprowadzić cyrkulację pracującego bufora i ustaw urządzenie chłodzące na 14°C. Pompa powinna pracować z prędkością 70 obr./min, aby zapewnić wystarczającą cyrkulację pracującego bufora i utrzymać bufor w temperaturze 14°C.
- Po ostygnięciu wlej stopioną agarozę do tacki na żel na dobrze wypoziomowaną powierzchnię i upewnij się, że unikasz bąbelków. Upewnij się, że stopiona agaroza znajduje się równo na grzebieniu żelowym, w przeciwnym razie wyjmij grzebień i włóż go z powrotem do stopionej agarozy. Gdy żel zastygnie, wyjmij grzebień i załaduj marker MidRange I PFG do czwartego dołka żelu. Wyciśnij agarozę ze strzykawki z żelem i przetnij skalpelem małą zatyczkę od końca. Umieść korek z przodu studzienki i uszczelnij stopioną agarozą. Umieść żel w komorze do elektroforezy.
Uwaga: z żelem agarozowym należy obchodzić się bardzo ostrożnie, ponieważ żele o niskiej temperaturze topnienia łatwo pękają. Sprawdź, czy uruchomiony bufor ostygł do 14°C, zanim zaczniesz ładować żel. Jeśli twoje studzienki wyglądają na zablokowane przez agarozę, następnym razem spróbuj wykonać następujące czynności: zanim wyjmiesz grzebień z żelu, dodaj 1-2 ml buforu TAE wokół grzebienia; Spowoduje to ładniejsze studnie.
- W pierwszym dołku załadować 5 μl trawienia λ HindIII, a następnie 1 μl znacznika wielkości kontrolnej fosmidu (EPICENTRE, 100 ng/μl). Do znacznika wielkości w probówce do mikrowirówki dodać 10 μl sterylnej wody oraz odpowiednią ilość buforu ładującego. Większa objętość ułatwia załadowanie żelu. Bezpośrednio obok znacznika fosmid załaduj naprawioną i inaktywowaną termicznie mieszankę z odpowiednią ilością bufora ładującego. Zamknij pokrywę i zaprogramuj ustawienia.
Uwaga: naprawdę zalecamy ładowanie różnych ilości innych drabinek DNA, aby z grubsza określić ilościowo ilość DNA lub zobrazować zakres ścinania genomowego DNA. Idealnymi markerami wielkości są λ DNA-HindIII Digest i MidRange I PFG Marker (oba z NEB).
- Zaprogramuj ustawienia: użyj algorytmu Auto, jeśli Twój system PFGE jest w to wyposażony. Program automatycznie oblicza ustawienie, które jest potrzebne do oddzielenia DNA o danym zakresie wielkości. Używane ustawienia to: zakres rozmiarów DNA 2-250 Kb; współczynnik kalibracji: 1; nachylenie: [6 V/cm]; czas trwania: 12:00 godzin; kąt natarcia: 120°; początkowy czas przełączania: 0,1 sek.; końcowy czas przełączania: 21,79 sek.; Współczynnik zagłębiania skośnego A = liniowy.
- Aby zobrazować swoje DNA, wlej 250 ml buforu 1,0X TAE do pojemnika i dodaj 25 μl 10 000X SYBR Gold; delikatnie wymieszaj przed umieszczeniem żelu w roztworze. Barwić żel przez 1 godzinę w ciemności, ponieważ SYBR Gold jest wrażliwy na światło.
Uwaga: z żelem agarozowym należy obchodzić się bardzo ostrożnie, ponieważ żele o niskiej temperaturze topnienia łatwo pękają.
Część 3: Odzyskiwanie DNA poprzez ekstrakcję żelu i ligację odzyskanego DNA do wektora klonowania fosmidu
Wszystkie odczynniki do tej części są zawarte w zestawie produkcyjnym biblioteki EPICENTRE fosmid.
- W międzyczasie przygotuj łaźnię wodną o temperaturze 70°C i jedną w temperaturze 45°C do etapu trawienia żelem.
- Zanieś poplamiony żel razem z pustą, wytarowaną probówką do mikrowirówki i sterylnym skalpelem do transiluminatora światła niebieskiego. Wizualizuj swoje naprawione na końcu genomowe DNA i marker wielkości kontrolnej fosmidu. Wyciąć plasterek żelu za pomocą skalpela, który migrował wraz z pozycją znacznika wielkości kontrolnej fosmidu i nieco powyżej niego (należy wyciąć plasterek żelu o szerokości 5-7 mm) i przenieść plasterek do wytarowanej probówki do mikrowirówki. Uruchom marker MidRange I PFG na żelu, ponieważ pomoże Ci to nie ciąć żelu zbyt wysoko.
Uwaga: połóż plastikową folię na transiluminatorze niebieskiego światła przed nałożeniem na niego żelu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i załóż okulary view przed włączeniem niebieskiego światła. Nie wycinaj plastrów żelu, w których genomowe DNA jest mniejsze niż marker wielkości kontrolnej fosmidu, ponieważ spowoduje to powstanie niechcianych chimerycznych klonów.
Możesz kroić i przechowywać plastry żelu zawierające DNA o niższej lub wyższej masie cząsteczkowej w celu skonstruowania odpowiednio strzelby z całego genomu lub bibliotek BAC.
Przystanek I: odzyskane plastry żelu można przechowywać w temperaturze -20°C przez okres do jednego roku
- Zważyć wytarowane probówki i obliczyć masę plastrów żelu. Z 1 mg agarozy otrzyma się około 1 μl stopionej agarozy.
- Rozpuść niskotopliwą agarozę zawierającą twoje genomowe DNA w łaźni wodnej o temperaturze 70°C przez 10-15 minut (nie dodajemy buforu żelazy). Po całkowitym stopieniu plastra żelu szybko przenieś probówkę do temperatury 45°C.
Uwaga: nie wiruj próbki, aby pomóc w rozpuszczeniu, ponieważ może to spowodować ścinanie DNA.
- Dodać 1 U (1 μl) preparatu enzymatycznego GELazy na 100 μl stopionej agarozy. Inkubować w temperaturze 45°C przez 1 godzinę, a następnie dodać więcej GELazy (2-4 μl) i inkubować przez dodatkową godzinę. Podgrzewać preparat enzymatyczny GELazy w temperaturze 70°C przez 10 minut.
Umieść probówkę na lodzie na 10 minut i odwiruj probówkę z maksymalną prędkością (13 000 obr./min) przez 15 minut, aby osadzać wszelkie nierozpuszczalne cząstki. Ostrożnie usunąć górny supernatant i przenieść go do probówki Falcon o pojemności 15 ml i dodać do probówki 3 ml sterylnej wody.
Uwaga: unikać pipetowania agarozy granulowanej. Ponieważ dodajemy więcej GELazy niż jest to zawarte w zestawie, zamawiamy osobno dodatkowy preparat enzymatyczny GELazy.
- Przenieś roztwór do filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 z membraną Ultracel-10 i obracaj probówkę z prędkością 4 000 g przez 6-8 minut, a następnie odrzuć przepływ. Wirować, aż ilość roztworu na filtrze zmniejszy się do około 100 ~ 500 μl. Dodaj kolejne 3 ml sterylnej wody do pustej probówki Falcon od góry, przenieś roztwór do probówki Amicon i powtórz etap wirowania. Umyj po raz trzeci 3 ml wody i ponownie wylej przepływ. Zmniejszyć końcową objętość do 50 – 100 μl.
Uwaga: do etapu wirowania używamy wahliwego wirnika kubełkowego; wystarczy umieścić filtr odśrodkowy Amicon w probówce Falcon o pojemności 50 ml, aby utrzymać go na miejscu podczas wirowania. Filtr Amicon bezpiecznie zatrzymuje 50 μl roztworu na filtrze nawet po dłuższym wirowaniu.
- Przenieś pozostały roztwór DNA z probówki Amicon do wstępnie umytego filtra odśrodkowego Microcon YM-50 i przepłucz probówkę Amicon dodatkowymi 50 μl sterylnej wody, aby odzyskać całe DNA. Odwiruj filtr odśrodkowy Microcon YM-50 w mikrowirówce o wadze 10 000 g, aż filtr będzie nadal lekko pokryty cieczą. Co minutę sprawdzaj, czy na filtrze pozostała tylko niewielka ilość płynu. Odwróć filtr do góry nogami i odzyskaj roztwór DNA przez drugi etap wirowania przy 1,000 g przez 3 minuty w świeżej probówce do mikrowirówki. Uzyskana objętość nie powinna przekraczać łącznie 10-15 μl, w przeciwnym razie DNA może być zbyt rozcieńczone na etapie ligacji.
Uwaga: uważaj, aby nie obrócić urządzenia filtrującego do całkowitego wyschnięcia. Jeśli twoja membrana jest sucha, dodaj 10-15 μl wody na membranę, delikatnie mieszaj przez 30 sekund i odzyskaj DNA, jak opisano powyżej.
- Określ ilościowo otrzymany roztwór DNA za pomocą testu NanoDrop lub PicoGreen.
- Odzyskane, naprawione na końcu DNA jest teraz gotowe do ligacji do wektora klonowania pCC1-fosmid. Rozmrozić następujący roztwór na lodzie i upewnić się, że stosunek molowców wektora do wstawienia wynosi 10:1.
Uwaga: 0,5 μg wektora pCC1-fosmid ~ 0,09 pmoles wektor.
0,25 μg z ~40 Kb wstaw DNA ~ 0,009 pmole wstawij DNA
Zwiększenie ilości DNA używanego na etapie ligacji może być pomocne, jeśli po posianiu zakażonych komórek E. coli na płytkach selekcyjnych należy uzyskać tylko kilka klonów fosmidowych.
Dodaj odczynniki w poniższej kolejności i krótko odwiruj probówkę, aby cały płyn opadł na dno, postukaj w probówkę i ponownie zakręć:
- x μl sterylnej wody
- 1 μl 10-krotny bufor ligacyjny Fast-Link
- 1 μl 10 mM ATP
- 1 μl wektora fosmidowego pCC1 (0,5 μg/μl)
- x μl zagęszczonej insercji DNA (0,25 μg)
- 1 μl ligazy DNA Fast-Link
- 10 μl całkowitej objętości reakcyjnej
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i podgrzewać, dezaktywować enzym przez 10 minut w temperaturze 70°C.
Stop II: przechowywać mieszaninę do ligacji w temperaturze -20°C lub przejść do etapu pakowania faga.
Uwaga: Pojedyncza reakcja ligacji wytworzy 103-10 6 klonów w zależności od jakości środowiskowego DNA. Na podstawie szacowanej liczby klonów, która jest wymagana do określonego pokrycia, można zwiększyć skalę reakcji ligacji. Jeśli podwiązanie jest skalowane w górę, wówczas ilość ekstraktu z opakowania faga powinna być odpowiednio zwiększana, jak opisano poniżej.
Krok III
Część 1: Opakowanie fagowe produktu ligacji wektorowej
- Dwa lub trzy dni przed planowanym pakowaniem fagów należy rozszczepić dostarczony szczep posiewu EPI300-T1R na zwykłej płytce LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 ° C w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Płytkę tę można zapieczętować i przechowywać w temperaturze 4°C do wykorzystania w przyszłości.
- Dzień przed reakcją pakowania zaszczepić 50 ml bulionu LB + 10 mMMgSO4 (dodać 500 μl 1MMgSO4) jedną pojedynczą kolonią płytki utworzoną w kroku 1. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37°C.
- W dniu reakcji pakowania zaszczepić świeże 50 ml bulionu LB + 10 mMMgSO4 5 ml nocnej kultury przygotowanej w kroku 2. Rosnąć w temperaturze 37°C do OD600 od 0,8 do 1,0 i nie przekraczać OD600 1,0! Rozcieńczyć próbkę przed pomiarem na spektrofotometrze, aby uzyskać dokładny wynik. Przechowuj komórki na lodzie lub w temperaturze 4°C do czasu dalszego użycia.
Uwaga: Przystanek III: w razie potrzeby kultura może być przechowywana w temperaturze 4°C przez maksymalnie 72 godziny; Jednak zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżej dorosłej kultury.
- Rozmrozić na lodzie ekstrakty opakowaniowe MaxPlax Lambda, 1 tubka na każdą przeprowadzoną wcześniej reakcję ligacji. Rozmrażanie zajmie 10-15 minut. W międzyczasie umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na lodzie, który ma być wstępnie schłodzony.
Uwaga: nie pozostawiaj rozmrożonego faga na lodzie zbyt długo. W przeciwnym razie skuteczność infekcji fagowej spadnie.
- Po rozmrożeniu natychmiast przenieś 25 μl każdego ekstraktu z opakowania do drugiej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i umieść na lodzie. Zwróć pozostały ekstrakt opakowaniowy do temperatury - 80°C.
Uwaga: nie przechowuj ekstraktu z opakowania z suchym lodem ani żadnym innym źródłem CO2 .
- Dodać 10 μl reakcji ligacji do każdych 25 μl rozmrożonych ekstraktów na lodzie. Mieszać przez kilkakrotne pipetowanie roztworu, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Krótko odwirować probówki, aby cały płyn znalazł się na dnie probówki i inkubować reakcje pakowania w temperaturze 30°C przez 90 minut. Po 80 minutach inkubacji rozmrozić pozostały ekstrakt opakowaniowy na lodzie.
Uwaga: do etapu inkubacji w temperaturze 30°C należy użyć łaźni wodnej zamiast bloku grzewczego.
- Po 90 minutach reakcji pakowania dodać pozostałe 25 μl ekstraktu opakowaniowego do każdej probówki reakcyjnej. Inkubować reakcje przez dodatkowe 90 minut w temperaturze 30°C. Po 90 minutach inkubacji dodać 100 μl przygotowanego buforu rozcieńczającego fagi do każdej probówki zbiorczej i delikatnie wymieszać.
Uwaga: jeśli Twoja wydajność powinna być niska na końcu, Twoje ekstrakty fagowe mogą być zbyt stare lub zostały wystawione na działanie suchego lodu lub innego źródła CO2 . Z naszego doświadczenia wynika, że pakowanie fagów w temperaturze pokojowej (2 razy 90 min) zamiast 30°C, a następnie końcowa dodatkowa inkubacja przez 2 godziny w temperaturze 30°C zwiększyła liczbę powstałych klonów.
- Dodać 5 μl chloroformu do każdej probówki i delikatnie wymieszać, aż całkowita objętość w probówce wyniesie 165 μl. Po dodaniu chloroformu może powstać lepki osad; Nie będzie to kolidować z produkcją biblioteki. Należy jednak unikać tego osadu, jak również organicznej fazy chloroformowej podczas pipetowania cząstek fagów.
Przystanek dożylny: w tym momencie zapakowane cząstki faga mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4°C.
Uwaga: aby uzyskać najlepszą skuteczność infekcji fagowej, używaj świeżo zapakowanego faga.
Część 2: Zakażenie hosta bibliotecznego E. coli
- Dodać upakowany do komórek gospodarza EPI300-T1R (OD600 = 0,8-1,0) w stosunku 400 μl komórekR EPI300-T1 na każde 10 μl cząstek faga. Aby uniknąć pipetowania chloroformu, używamy 125 μl upakowanych cząstek faga i 5 ml przygotowanych komórek gospodarza EPI300-T1R. Delikatnie wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min.
Uwaga: należy uważać, aby nie przenieść chloroformu do komórek gospodarza podczas usuwania cząstki faga z probówki do pakowania faga. Jeśli nie masz pewności, weź mniej zapakowanych cząstek fagowych.
Część 3: Posiewanie i miareczkowanie
- Dodaj 5-7 wysterylizowanych szklanych koralików na czterech małych szalkach Petriego LB + 12,5 μg/ml chloramfenikolu.
- Rozprowadzić dwa razy po 50 μl i dwa razy po 10 μl komórekR zakażonych fagami EPI300-T1 na czterech oddzielnych płytkach. Aby zapewnić równomierne rozprowadzanie, dodaj trochę bulionu LB (~50 μl) do płytek z 10 μl komórek zakażonych fagami. Potrząśnij płytką poziomo, aby równomiernie rozprowadzić komórki na talerzu. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na 15 minut, a następnie usuń koraliki, odwracając płytkę.
Uwaga: płytki te służą do określania liczby transformantów i obliczania odpowiednich rozcieńczeń niezbędnych na etapie pobierania kolonii, aby uniknąć zbyt dużej gęstości kolonii.
- Umieść płytki do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37°C na 16 do 24 godzin do 48 godzin, aż utworzą się kolonie. Sprawdź płytki po 24 godzinach, aby zapobiec szybko rosnącym klonom wraośnym w sąsiednie kolonie.
- W międzyczasie zebrać resztki komórek pozostałe po zakażeniu 5 ml przez odwirowanie w temperaturze 3 500 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Wyrzucić supernatant. Dodać 1 ml LB / 20% glicerolu do probówki. Ponownie zawiesić osad komórkowy i podzielić go na 100 μl każdy w probówkach kriowialnych o pojemności 2 ml. Natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C do dalszego wykorzystania na etapie zbierania kolonii.
- Następnego dnia policz liczbę klonów na płytkach i określ miano. Należy upewnić się, że uwzględniono prawidłowy współczynnik rozcieńczenia, aby obliczyć całkowitą ilość fosmid-klonów.
Uwaga: ta procedura generuje w sumie od 10 000 do 50 000 klonów fosmidowych; jednak w zależności od jakości i czystości wyekstrahowanego DNA środowiskowego obserwuje się zakres od 3 000 do 80 000 klonów fosmidowych.
Krok IV
Część 1: Przygotowanie płytek agarowych i studzienkowych
- Wlać pożywkę do płytek w następujący sposób; dodać 12,5 μg chloramfenikolu na ml LB:
- Szalka Petriego 100X15mm: agar LB 25 ml
- Szalka Petriego 150X15mm: agar LB 50 ml
- Kwadratowa płytka testowa 245X245mm: agar LB 250 ml
Uwaga: ważne jest, aby wylać podłoże na dobrze wypoziomowaną powierzchnię, aby głębokość agaru była równomiernie ułożona na całej płycie. Zalecamy używanie płyt 245X245 mm dla bibliotek fosmid, dzięki czemu nie musisz obsługiwać wielu płyt .
- Rozmrozić zapas glicerolu zawierający przygotowane klony fosmidów na lodzie. Rozprowadź ilość odpowiednią dla płytki, której chcesz użyć, w oparciu o obliczone miano (przygotowanie bulionu glicerolu dodatkowo koncentruje komórki ~ 5-krotnie). Czas inkubacji do wzrostu komórek wynosi 24 godziny w temperaturze 37°C.
Stop V: po uformowaniu kolonii przechowuj szczelnie zamknięte płytki agarowe w temperaturze 4°C przez okres do jednego miesiąca, aż zostaną wykorzystane na etapie zbierania kolonii.
Uwaga: kolonie muszą być równomiernie rozłożone, wystarczająco oddalone od siebie i powinny mieć około 1 mm średnicy. Posiewanie komórek za pomocą szklanych kulek może zapewnić dobrą separację między koloniami. Na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm zwykle 150 ~ 250 kolonii to dobra gęstość dla najwyższej wydajności pobierania robota, a dla 22 x 22 cm nie należy uzyskać więcej niż 2,000 kolonii.
- W dniach zbierania kolonii należy przygotować 96 lub 384 dołkowe płytki wypełnione bulionem LB uzupełnionym 12,5 μg chloramfenikolu na ml bulionu oraz 20% glicerolem do przechowywania w bibliotece w temperaturze -80°C. Płytki studzienkowe są napełniane za pomocą automatycznego systemu napełniania płytek QFill3, jak opisano poniżej.
- Autoklaw 2 zestawy szklanych butelek (500 ml), pokrywki i silikonowe rurki. Nie sterylizować w autoklawie kolektora, w tym zespołu igły i kołnierza montażowego. Zamontuj QFill3 w pobliżu płomienia palnika Bunsena lub w okapie, aby stworzyć i utrzymać sterylne środowisko.
Uwaga: upewnij się, że silikonowa rurka jest włożona do zaworu zaciskowego, naciskając aktywator zaworu zaciskowego i całkowicie wsuwając rurkę do zaworu. (Działa to jak hamulec do dozowania medium do następnej kolumny).
- Sterylizuj igły dozujące, przepuszczając przez ~ 50 ml 1% wybielacza, autoklawowanego dH2O i 80% etanolu, pojedynczo i umieść pokrywę pudełka na końcówki na platformie, aby zebrać roztwory odpadowe. Po sterylizacji zmień na drugi zestaw składający się z butelki, pokrywki i silikonowej rurki.
- Napełnij butelkę ~300 ml pożywki. Przepuść wystarczającą ilość pożywki, aby pozbyć się pozostałego etanolu z etapu czyszczenia. Po wyczyszczeniu rurki załaduj płytkę dołkową 96/384 na platformę. Naciśnij "start", aby napełnić talerz; każdą studzienkę należy napełnić 200 μl przygotowanego bulionu LB. Aby wyczyścić igły dozujące, przepuść przez nie ~ 50 ml 80% etanolu.
Uwaga: przed napełnieniem upewnij się, że płytka studzienki jest oznaczona.
Część 2: konfiguracja robota do zbierania kolonii
- Używamy robota do kompletacji klonów QPix2 zgodnie z instrukcją obsługi. Użytkownicy powinni być zaznajomieni z obsługą robota i tym, jak wszystko ustawić, aby zagwarantować najwyższą wydajność kompletacji.
- Aby stworzyć sterylne środowisko wokół obszaru pobierania klonów, włącz światło UV na 30 minut. Gdy światło UV jest włączone, przygotuj 500 ml 1% wybielacza, 500 ml sterylnego dH2O i 500 ml 80% etanolu. Gdy światło UV zgaśnie, napełnij tace zgodnie z etykietą. Zawsze wlewaj roztwory do prawidłowo oznakowanych tacek na roztwory. Od tyłu do przodu napełnij 1% wybielaczem, a następnie autoklawizuj dH2O i 80% etanolu na przedniej tacy. Upewnij się, że są pełne. Igły do pobierania nie mogą być prawidłowo myte bez wystarczającej ilości roztworu do mycia.
Uwaga: monitoruj 80% etanolu w czasie. Wyparuje i należy go uzupełnić.
- Po ustawieniu parametrów optymalnego zbioru, należy umieścić przygotowane płytki agarowe z klonami fosmidu i płytki studzienkowe między słupkami w obszarze roboczym Q-Pix. Upewnij się, że zdjąłeś wszystkie osłony płyt!
- Talerze powinny przylegać do prawego przedniego rogu, aby nie mogły się przesuwać podczas zbierania. Następnie zamknij panel przedni.
Uwaga: Jest to niezwykle ważne!
- Po ustawieniu wszystkich parametrów można rozpocząć procedurę kompletacji. Po zakończeniu zbierania opłucz szczotki i tace wodą dejonizowaną i połóż na stole do wyschnięcia. Usuń wszelkie wycieki, które mogły wystąpić, i wytrzyj wnętrze Q-Pix 80% etanolem.
Część 3: Nocna inkubacja i przechowywanie w bibliotece
- Upewnij się, że wszystkie płytki podstawowe z glicerolem są oznaczone i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37°C na 24 godziny. Zostaw notatkę na inkubatorze, która zawiera datę, liczbę inkubowanych płytek, czas inkubacji, czas usunięcia i swoje inicjały.
- W przypadku długiego przechowywania wyhodowane przez noc inkubacje należy umieścić w zamrażarce o temperaturze -80°C.
Reprezentatywne wyniki:
Prezentowany protokół opisuje procedurę, jak wygenerować bibliotekę kofosmidów środowiskowych w celu uchwycenia zawartości genetycznej społeczności mikrobiologicznej w danym siedlisku. Protokół ten powinien stworzyć bibliotekę fosmidu, która jest reprezentatywna dla zawartości genetycznej środowiska pobierania próbek i powinna umożliwić czytelnikowi modyfikację i optymalizację krytycznych kroków, jeśli liczba klonów fosmidu uzyskanych pod koniec całej procedury jest zbyt niska.