Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Podsumowanie

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Streszczenie

Jednym z najpotężniejszych narzędzi służących do zgłębienia złożonych procesów rozwojowych jest analiza embrionów chimerycznych. Chimerę definiuje się jako organizm zawierający komórki pochodzące od więcej niż jednego zwierzęcia; mozaiki są rodzajem chimery, w której zmieszane są komórki o więcej niż jednym genotypie, zazwyczaj typu dzikiego i mutanty. U danio przebrwionego chimery można łatwo uzyskać poprzez transplantację komórek z embrionu dawcy do embrionu biorcy na odpowiednim etapie rozwoju. Znakowane komórki dawcy generuje się poprzez wstrzyknięcie markera linii komórkowej, takiego jak barwnik fluorescencyjny, do embrionu w stadium jednego komórki. Znakowane komórki dawcy są pobierane z embrionów dawców i wprowadzane do nieznakowanych embrionów biorców przy użyciu szklanej pipety z kontrolą olejową, zamontowanej na mikroskopie złożonym lub stereomikroskopie. W niektórych przypadkach komórki dawcy mogą być kierowane do konkretnego regionu lub tkanki rozwijającego się embrionu biorcy w stadium blastuli lub gastruli, poprzez wybór miejsca transplantacji w embrionie biorcy w oparciu o dobrze opracowane mapy losów komórek.

Protokół

Przewodnik krok po kroku po generowaniu celowanych chimerycznych embrionów zebrafish poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi służących do poznania złożonych procesów rozwojowych jest analiza embrionów chimerycznych. Chimerę definiuje się jako organizm zawierający komórki pochodzące od więcej niż jednego zwierzęcia; mozaiki są rodzajem chimery, w której zmieszane są komórki o więcej niż jednym genotypie, zazwyczaj typu dzikiego i mutanty. U danio-przełomowego można łatwo tworzyć chimery poprzez transplantację komórek z embrionu donora do embrionu gospodarza na odpowiednim etapie rozwoju. Znakowane komórki donora otrzymuje się poprzez wstrzyknięcie markera linii komórkowej, takiego jak barwnik fluorescencyjny, do embrionu w stadium jednego komórki. Znakowane komórki donora są usuwane z embrionów donora i wprowadzane do nieznakowanych embrionów gospodarzy za pomocą szklanej pipety z kontrolą olejową, zamontowanej na mikroskopie złożonym lub stereomikroskopie. W niektórych przypadkach komórki donora mogą być celowane w konkretny region lub tkankę rozwijającego się embrionu gospodarza w stadium blastuli lub gastruli, poprzez wybór miejsca transplantacji w embrionie gospodarza w oparciu o dobrze udokumentowane mapy losów komórek.

Część 1: Iniekcja zarodków danio pręgowanego w stadium 1 komórki.

1. Enzymatyczne usuwanie otoczki z embrionów w stadium 1 komórki.
   
   Aby proteolitycznie usunąć otoczkę z embrionów, inkubować je w stadium 1 komórki przez ~1-5’ w roztworze pronazy o stężeniu 0,5 mg/ml, zgodnie z opisem w The Zebrafish Book 1. Ściśle monitorować proces usuwania otoczki i zanurzyć embriony w podłożu do embrionów (EM) z Pen/Strep 1, gdy tylko otoczki zaczną widocznie zapadać się. Po uwolnieniu z otoczek embriony w stadium blastuli i gastruli są delikatne i będą przylegać do plastiku lub ulecć dezintegracji w przypadku kontaktu z powietrzem. Należy zatem utrzymywać embriony pozbawione otoczek zanurzone w EM z Pen/Strep, przenosić je między naczyniami za pomocą szklanej pipety o szerokim ujściu, wypalanej ogniowo, oraz przechowywać w plastikowych naczyniach powlekanych agarem (1,2% agarozy w EM z Pen/Strep) lub autoklawowanych szklanych szalkach Petriego.
   
2. Iniekcja markerów linii komórkowej do embrionów pozbawionych otoczek.
   
   Przygotować naczynie do iniekcji, wkładając szkiełko przedmiotowe pod kątem 45 stopni w najszerszej części szalki Petriego wypełnionej w trzech czwartych 1,2% agarozą przygotowaną w EM z Pen/Strep. Usunięcie szkiełka po zastygnięciu agarozy pozostawia skośny rowek. Przenieść embriony pozbawione otoczek do rowka naczynia do iniekcji wypełnionego EM z Pen/Strep. Wstrzyknąć objętości 1nl markera linii komórkowej za pomocą precyzyjnie skalibrowanej, wypalanej ogniowo szklanej pipety do iniekcji oraz zestawu do iniekcji ciśnieniowej, zgodnie z opisem w The Zebrafish Book 1. Barwniki i niskocząsteczkowe znaczniki linii komórkowej wstrzykiwać bezpośrednio do żółtka embrionów pozbawionych otoczek pomiędzy stadium 1 a 4 komórek. Roztwór 3% dekstranu fluorescencyjnego jest wystarczający do detekcji komórek pochodzących od donora w embrionach chimerycznych przez kilka dni rozwoju. Gdy markerem linii komórkowej jest mRNA kodujące białko fluorescencyjne (na przykład GFP lub RFP), wstrzyknąć je bezpośrednio do komórki embrionu w wczesnym stadium 1 komórki.
   
3. Iniekcja markerów linii komórkowej do embrionów z zachowaną otoczką.
   
   Przygotować wielodołkowe naczynia do iniekcji, zastygając 1,2% agarozy w EM wokół formy z dołkami o szerokości zbliżonej do średnicy otoczki. Przenieść embriony z zachowaną otoczką do wielodołkowego naczynia do iniekcji wypełnionego w połowie EM z Pen/Strep. Usunąć nadmiar płynu. Tak unieruchomione embriony można iniekować objętościami 1nl markera linii komórkowej, jak opisano powyżej.
   
4. Hodowla iniekowanych embrionów do transplantacji.
   
   Hodować embriony przy niskiej gęstości (40-50 embrionów na naczynie) w świeżym EM z Pen/Strep. Dobrać stadium rozwoju embrionów donora i biorcy używanych do transplantacji tak, aby były do siebie zbliżone. W przypadku transplantacji w stadium tarczy (shield stage), dążyć do tego, aby donory były nieco opóźnione względem biorców; należy zauważyć, że embriony poddane iniekcji mają tendencję do lekkiego opóźnienia w rozwoju. Inkubować embriony w różnych temperaturach: 25°C, 28°C i 31°C, aby rozmieścić ich rozwój w czasie i zmaksymalizować okno czasowe, w którym można przeprowadzić transplantacje.
   

Część 2: Tworzenie chimerycznych zarodków danio pręgowanego poprzez transplantację.

1. Transplantacja w stadium blastuli pod stereomikroskopem

1. Opis zestawu do transplantacji dla blastuli
   
   Aparat używany do transplantacji komórek w blastuli danio pręgowanego składa się z strzykawki Hamiltona (10 µl-50 µl) sterowanej mikrometrycznie, połączonej za pomocą trójdrogowego zaworu z rezerwuarem oleju mineralnego oraz uchwytem do mikropipety poprzez odcinek elastycznego przewodu. Po złożeniu zestawu do transplantacji należy go napełnić olejem mineralnym, dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza z układu. Obecność pęcherzyka powietrza negatywnie wpłynie na możliwość kontrolowania ssania i ciśnienia. Należy użyć stereomikroskopu z dość dużym powiększeniem i dobrą optyką (idealnie co najmniej 80-krotne powiększenie). Pozycjonowanie uchwytu mikropipety i igły można kontrolować za pomocą manualnego mikromanipulatora Narishige, podobnie jak w przypadku iniekcji; jednak jeśli podstawa stereoskopu jest zbyt szeroka, aby umożliwić łatwy dostęp mikromanipulatorowi, można zakupić w firmie Narishige adapter mocowany do korpusu stereomikroskopu. Mocowanie mikromanipulatora musi być bardzo stabilne, aby uniknąć przenoszenia drgań na igłę transplantacyjną; w tym celu dobrze sprawdza się podstawa magnetyczna.
   
2. Przygotowanie pipety do transplantacji
   
   Igły transplantacyjne wykonuje się z szklanych pipet kapilarnych (patrz dwie opcje w poniższej tabeli odczynników), które są wyciągane w łagodny stożek za pomocą wyciągacza elektrod. Końcówkę igły należy odłamać pod mikroskopem sekcyjnym, używając prostej żyletki, w miejscu, gdzie średnica wewnętrzna igły jest nieco większa niż komórki przeznaczone do transplantacji. Żyletkę należy trzymać pod lekkim kątem, aby stworzyć skos i sprawić, by przełom był jak najgładki, bez poszarpanych krawędzi. Dla transplantacji na etapie blastuli średnica zewnętrzna igły powinna wynosić około 50-60 µm.
   
3. Mocowanie embrionów do transplantacji w formach agarowych
   
   Naczynia do iniekcji przygotowuje się poprzez umieszczenie plastikowej formy z rzędami klinowatych wypustek w płytce Petriego wypełnionej do połowy stopioną 1,2% agarozą w EM. Po zestaleniu się agarozy należy usunąć szablon, pozostawiając formę agarową zawierającą rzędy trójkątnych wgłębień, z których każde jest wystarczająco duże, aby pomieścić jeden embrion. Formę do transplantacji należy wypełnić EM z Pen/Strep i pojedynczo załadować embriony na etapie blastuli do każdego wgłębienia za pomocą wypalanej szklanej pipety, tak aby embriony dawców znajdowały się w jednej kolumnie, a embriony biorców w kolumnie sąsiedniej.
   
4. Transplantacja komórek
   
   Embriony w wgłębieniach do transplantacji należy ustawić na boku; w razie potrzeby podczas transplantacji można je repositionować za pomocą pipety transplantacyjnej, uważając, aby nie przebić żółtka. Naczynie należy ustawić na stoliku w taki sposób, aby podczas wprowadzania igły transplantacyjnej do embrionu, igła dociskała go do tylnej ścianki wgłębienia. Za pomocą mikromanipulatora należy opuścić igłę transplantacyjną do naczynia pod dość stromym kątem. Idealnie igła transplantacyjna powinna wchodzić do embrionu pod kątem około 45 stopni. Gdy końcówka igły znajdzie się poniżej powierzchni medium dla embrionów, należy wciągnąć niewielką ilość medium do igły, obracając napęd mikrometryczny sterujący strzykawką Hamiltona. Dla najprecyzyjniejszej kontroli granica między olejem mineralnym a medium dla embrionów powinna znajdować się w cienkiej, stożkowatej części igły, ale nie zbyt blisko końca. Należy delikatnie ustawić embrion dawcy za pomocą igły, a następnie wycofać igłę i wprowadzić ją do czapy blastuli embrionu w pożądanym miejscu. Szybkie, zdecydowane uderzenie pozwoli spenetrować embrion bez doprowadzenia do jego przetoczenia się. Komórki dawcy należy wciągać do igły powoli i ostrożnie. Jeśli komórki zostaną wciągnięte zbyt szybko, mogą ulec uszkodzeniu mechanicznemu. Należy również unikać wciągania żółtka do igły, ponieważ zwiąże się ono z olejem mineralnym, co doprowadzi do śmierci komórek. Po pobraniu pożądanej liczby komórek należy lekko odwrócić ciśnienie, aby przerwać ssanie i wyjąć igłę z embrionu. Embrion biorcy należy ustawić w odpowiedniej pozycji poprzez przesunięcie naczynia transplantacyjnego. Drobne korekty pozycji embrionu biorcy można wprowadzić, delikatnie obracając go igłą transplantacyjną, dbając o to, by nie dotknąć żółtka. Podczas wprowadzania komórek dawcy do embrionu biorcy należy unikać wprowadzenia dużej ilości medium dla embrionów lub jakiegokolwiek oleju mineralnego, ponieważ mogłoby to zakłócić rozwój lub zabić embrion. Pozycja komórek wzdłuż osi zwierzęco-roślinnej wpływa na ich wkład w jedną z trzech warstw zarodkowych: endodermę, mezodermę i ektodermę 2,3. W związku z tym komórki transplantowane blisko brzegu przed rozpoczęciem gastrulacji będą preferencyjnie tworzyć endodermę i mezodermę, natomiast komórki transplantowane w stronę bieguna zwierzęcego będą przyczyniać się do losów ektodermalnych, najczęściej ektodermy powierzchniowej, przedmózgowia i oczu. W ten sposób można osiągnąć pewien stopień celowania tkankowego nawet na etapach blastuli. Po zakończeniu transferów komórek, pary dawca-biorca należy przenieść do powlekanych agarem wgłębień płytki 24-dołkowej w celu dalszego rozwoju.
   

1. Transplantacja na etapach gastruli przy użyciu mikroskopu złożonego

1. Opis zestawu do transplantacji
   
   Transfery komórek wykonywane przy użyciu mikroskopu złożonego korzystają z precyzyjnej kontroli położenia igły, zapewnianej przez trójosiowy olejowy hydrauliczny mikromanipulator. Mikromanipulator ten steruje precyzyjnymi ruchami pipety transplantacyjnej, podczas gdy ssanie w pipecie jest kontrolowane przez strzykawkę Hamiltona z napędem mikrometrycznym, podobną do tej używanej przy transplantacjach blastuli. Do wykonywania transferów komórek preferowany jest pionowy mikroskop złożony z nieruchomym stolikiem, ponieważ ostrzenie takiego mikroskopu nie powoduje przemieszczania się embrionu względem pipety. Jeśli jednak konieczne jest użycie mikroskopu złożonego z regulowanym stolikiem, mikromanipulator można zamontować bezpośrednio na stoliku zamiast na korpusie mikroskopu, uzyskując ten sam efekt. Firma Narishige oferuje również adaptery umożliwiające montaż mikromanipulatora na stoliku lub korpusie mikroskopów złożonych różnych producentów.
   
2. Przygotowanie pipety transplantacyjnej
   
   Igły transplantacyjne wykonuje się zasadniczo według opisu powyżej; dla transplantacji na etapie gastruli idealna średnica otworu igły wynosi 30-40 µm. Po uformowaniu tarczy (shield stage) warstwa otaczająca (EVL) staje się bardziej przylegająca, co utrudnia penetrację embrionu przez igłę transplantacyjną. Aby ułatwić wprowadzenie igły, należy utworzyć na jej końcu zadziorek za pomocą mikrokuźni. Najpierw należy wygładzić końcówkę igły, zbliżając ją do włókna mikrokuźni, a następnie obrócić igłę tak, aby krawędź tnąca skosu mogła zetknąć się z włóknem. Gdy krawędź tnąca igły zetknie się z włóknem, należy ją gwałtownie odsunąć, aby utworzyć zadziorek, czyli harpun. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, zadziorek powinien być prosty, a końcówka igły nie powinna być zakrzywiona.
   
3. Mocowanie embrionów do transplantacji w metylocelulozie
   
   W przypadku transplantacji przy użyciu mikroskopu złożonego, embriony mocuje się na szkiełku z wgłębieniem w 3% roztworze metylocelulozy (Sigma) rozpuszczonej w medium dla embrionów. Najpierw należy nanieść pionowy pasek metylocelulozy we wgłębieniu szklanego szkiełka, a następnie zalać go obfitą ilością medium dla embrionów. Używając wypalonej pipety, należy przenieść jeden embrion dawcy i trzy embriony biorcy w stadium tarczy pod powierzchnię EM na szkiełku z wgłębieniem, po jednej stronie paska metylocelulozy. Należy wybrać embriony dawcy, które są nieco młodsze od biorców (30-50% epibolii). Używając małej pętli wykonanej z krótkiego odcinka żyłki wędkarskiej o wytrzymałości 2 lb, której końce przyklejono do końcówki rurki kapilarnej, należy delikatnie przetoczyć embriony dawcy i biorców na górę paska metylocelulozy i wcisnąć je w metylocelulozę, aż zostaną stabilnie unieruchomione. Jeśli transplantowane komórki mają trafić do konkretnej domeny, niezbędna jest znajomość mapy losów stadium tarczy 3,4 oraz położenia tkanki docelowej względem tarczy, aby embriony biorców mogły zostać ustawione prawidłowo. Podczas umieszczania embrionów biorców w metylocelulozie, należy je obrócić tak, aby docelowy obszar znajdował się na górze, ponieważ podczas transplantacji igła będzie wchodzić do embrionu stycznie, aby dostarczyć komórki dawcy bez uszkodzenia żółtka.
   
4. Transplantacja komórek
   
   Należy ustawić igłę transplantacyjną, wprowadzając ją w płaszczyznę ogniskową embrionu. Najpierw należy ustawić ostrość na embrionie dawcy, używając obiektywu 10x. Następnie należy przesunąć embrion na bok i, nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, użyć elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić ostrość na końcówce igły transplantacyjnej. Uchwyt mikropipety i igłę należy ustawić pod dość małym kątem, tak aby igła była jak najbliżej poziomu, na ile pozwala krawędź wgłębienia w szkiełku. Jeśli embrion jest prawidłowo zamocowany w metylocelulozie, nie będzie się obracać podczas wprowadzania igły transplantacyjnej, chyba że embrion jest zbyt stary, co utrudnia łatwą penetrację igły. Warstwa otaczająca wydaje się twardnieć wraz z wiekiem embrionów, dlatego transplantacje na etapie gastruli najlepiej wykonywać bezpośrednio po uformowaniu tarczy. Po etapie kopuły (dome stage) żółtko znajduje się tuż pod komórkami czapy blastodermy, która stopniowo cieńsze w miarę postępu epibolii. Aby uniknąć przebicia żółtka, igła powinna wchodzić do embrionu w płaszczyźnie ogniskowej znajdującej się nieco głębiej niż EVL. Podczas pobierania dużej liczby komórek z embrionu dawcy należy przesuwać igłę w trakcie zasysania komórek, aby uniknąć przypadkowego zassania żółtka do wnętrza igły. Jeśli komórki z jednego embrionu dawcy mają zostać przeszczepione do wielu biorców, najlepiej wprowadzić igłę do dawcy tylko raz, aby zminimalizować ryzyko uszkodzeń. Komórki dawcy można następnie przenieść w wyznaczone miejsce w maksymalnie trzech embrionach biorców. Przy przenoszeniu komórek z dwóch lub więcej embrionów dawców do jednego embrionu biorcy najlepiej pobrać komórki z każdego z dawców do tej samej igły transplantacyjnej przed ich przeszczepieniem do biorcy. Minimalizuje to uszkodzenia embrionu biorcy i zapewnia transfer komórek do tego samego obszaru embrionu, co pozwala na porównanie ich zachowania. Między komórkami dawców wewnątrz igły transplantacyjnej zachodzi bardzo małe mieszanie, dlatego w przypadku użycia więcej niż jednego dawcy, komórki powinny zostać przeniesione do jednego biorcy. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że komórki dawcy przyczynią się do powstania pożądanej tkanki, należy wypuszczać komórki podczas przeciągania igły przez obszar docelowy, zamiast osadzać je w jednej grudce. Po zakończeniu transferu komórek całe szkiełko należy umieścić w szalce Petriego i ostrożnie zalać medium EM z dodatkiem Pen/Strep. W ciągu następnych kilku godzin metyloceluloza rozpuści się, uwalniając embriony.
   

Rycina 1:Układ mikroskopowy do tworzenia embrionów chimerycznych. A: Zestaw do transplantacji przy użyciu mikroskopu dissectingowego składa się z wypełnionej olejem strzykawki Hamiltona z napędem mikrometrycznym (a) połączonej z wypełnionym olejem zbiornikiem (b) i pipetą transplantacyjną (c) za pomocą trójdrożnego kurka (d). Pipeta transplantacyjna jest zamocowana na grubym mikromanipulatorze (e), który jest przytwierdzony do metalowej płyty podstawy (nie pokazano) za pomocą magnetycznej stopki (f). Transplantacje wykonuje się na stoliku stereomikroskopu (g) wyposażonego w oświetlenie dolne dla optymalnej optyki. B: Zestaw do transplantacji przy użyciu mikroskopu złożonego składa się z podobnej wypełnionej olejem strzykawki Hamiltona i napędu mikrometrycznego (a,b), jednak w tym przypadku pipeta transplantacyjna jest zamocowana na uchwycie do pipet (c), którego ruchy w osiach X, Y i Z można kontrolować za pomocą grubego (d) lub precyzyjnego (e) mikromanipulatora. W tym przykładzie mikromanipulator jest zamontowany na korpusie mikroskopu ze stałym stolikiem, jednak można go również zamontować na stoliku zwykłego mikroskopu. Embriony, unieruchomione w metylocelulozie na szkiełku z wgłębieniem, są wizualizowane przy użyciu obiektywu 10x (f). C: Forma transplantacyjna do unieruchamiania embrionów podczas transplantacji w stereomikroskopie. Zdechorionowane embriony są pojedynczo wpuszczane do studzienek powstałych poprzez odlewanie tej formy w agarozie w szalce Petriego o średnicy 90mm. Przedstawiono wymiary studzienek.

Rycina 2:Mocowanie embrionów do przeszczepów na etapie gastruli. A: idealny kształt pipety do przeszczepów gastruli. Skośne cięcie z ostrym końcem ułatwia penetrację embrionu. B: Unieruchamianie embrionów dawcy i biorcy w metylocelulozie. Pasek metylocelulozy umieszcza się w wgłębieniu szkiełka do depresji i zalewa obfitą ilością medium dla embrionów. Embriony dodaje się do medium i przetacza na metylocelulozę za pomocą małej pętli (C). D-G powiększenie embrionów z Ryc. 1B. D: Embrion dawcy jest zorientowany tak, aby umożliwić najłatwiejszy dostęp pipetą, ponieważ komórki na tym etapie nie są jeszcze zdeterminowane. E-G: Embriony biorcy w stadium tarczy (shield-stage) są zorientowane tak, aby region docelowy znajdował się na górze. Komórki przeszczepione do zaznaczonych ramek przyczynią się do powstania grzbietowej części tylnego mózgowia i czaszkowej grzebienia neuronalnego pochodzących z lewej (E) i prawej (G) strony lub do brzusznej części tylnego mózgowia i rdzenia kręgowego (F).

Rycina 3: Reprezentatywne obrazy embrionów chimerycznych.
(A-C) 18hpf embriony chimeryczne wytworzone poprzez transplantację w stadium tarczy, przedstawione w widoku grzbietowym, z przodem po lewej stronie. (A,B) Funkcje sortowania receptora powierzchniowego komórki EphA4 ujawnione podczas analizy embrionów chimerycznych. Panele lewe: nałożenie obrazów komórek dawcy znakowanych rhodaminą (rhod. – kolor czerwony) oraz transgenicznego GFP wykazującego ekspresję w określonych segmentach tylnego mózgu (kolor zielony). (A) Komórki WT uczestniczą w tworzeniu całego tylnego mózgu kontrolnego embrionu chimerycznego. (B) Komórki dawcy pozbawione EphA4 są wykluczone z określonych segmentów tylnego mózgu gospodarza WT. (C) Komórki dawcy skierowane do różnych części rurki nerwowej w transplantacjach w stadium tarczy. Komórki dawcy (kolor czerwony) skierowane do przedniego mózgu/środkowego mózgu (panel lewy) lub tylnego mózgu/rdzenia kręgowego (panel prawy) gospodarza WT, przeciwbarwione przeciwciałem EfnB2a, które znakuje przedni mózg, granicę przedniego i tylnego mózgu oraz środkowy segment tylnego mózgu (kolor zielony). Paski skali: 50μm.

Dyskusja

Łatwość, z jaką transplantację można wykorzystać do tworzenia ukierunkowanych chimer, jest jedną z największych zalet danio pręgowanego jako modelu kręgowca. Modyfikacja tego protokołu, nieopisana powyżej, pozwala na analizę funkcji genów matczynych w przypadku genów pełniących kluczowe role w rozwoju zygoticznym. Ponieważ ryby z takimi mutacjami nie są w stanie przeżyć do wieku dorosłego, konieczne jest przeniesienie zmutowanej linii zarodkowej do zarodka gospodarza o genotypie typu dzikiego, co pozwala na stworzenie „k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie do iniekcji	Zastosowana Instrumentacja Naukowa	MPPI-3	Pedał nożny można zamówić oddzielnie
Pronaza	Sigma-Aldrich	P5147	proteaza typu XIV”
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4458	roztwór stokowy 100x
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M-0387
Fluorescejące dekstrany	Sondy molekularne, Life Technologies	różne	np. rodamina dekstran z możliwością wiązania z lizyną (D7162)
Pipety do iniekcji (1,2 mm x 0,94 mm x 10 cm)	Sutter Instrument Co.	BF120-94-10
Opcja 1 przenoszenia pipetą	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4
Opcja 2 przeniesienia pipetą	VWR international	#53508-400
mikromanipulator	Narishige International	UMJ-3FC (?)
Magnetyczna podstawa mikromanipulatora	Narishige International	GJ-1
Aparat transplantacyjny	Sutter Instrument Co.	MI-10010
Precyzyjny mikromanipulator	Narishige International	MMO-203
Slajdy dotyczące depresji	Fisher Scientific	12560A
Formy agarowe do iniekcji i transplantacji	AL-AN Mfg, Inc.
Odczynniki: Przepisy na wiele z odczynników stosowanych w tych procedurach znajdują się w książce The Zebrafish Book, która jest w całości dostępna online pod adresem http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.htmlPodano tam receptury na przygotowanie wody rybiej, pożywki dla embrionów z antybiotykami i bez nich, pronazy do usuwania błony chorionowej, dekstranów fluorescencyjnych oraz metylocelulozy.