Generowanie chimerycznych zarodków danio pręgowanego przez przeszczep

Podsumowanie

Przewodnik krok po kroku do generowania docelowych chimerycznych embrionów danio pręgowanego poprzez przeszczep w stadium blastuli lub gastruli.

Streszczenie

Jednym z najpotężniejszych narzędzi wykorzystywanych do uzyskania wglądu w złożone procesy rozwojowe jest analiza chimerycznych zarodków. Chimera jest definiowana jako organizm, który zawiera komórki więcej niż jednego zwierzęcia; Mozaiki to jeden z rodzajów chimer, w których mieszają się komórki z więcej niż jednego genotypu, zwykle typu dzikiego i zmutowanego. U danio pręgowanego chimery można łatwo wytworzyć poprzez przeszczepienie komórek z zarodka dawcy do zarodka gospodarza w odpowiednim stadium embrionalnym. Znakowane komórki dawcy są generowane przez wstrzyknięcie markera linii, takiego jak barwnik fluorescencyjny, do zarodka w stadium jednokomórkowym. Znakowane komórki dawcy są usuwane z zarodków dawcy i wprowadzane do nieznakowanych zarodków gospodarza za pomocą szklanej pipety kontrolowanej olejem, zamontowanej na mikroskopie złożonym lub preparacyjnym. Komórki dawcy mogą być w niektórych przypadkach ukierunkowane na określony region lub tkankę rozwijającego się zarodka gospodarza w stadium blastuli lub gastruli, wybierając miejsce przeszczepu w zarodku gospodarza na podstawie dobrze ustalonych map losu.

Protokół

Przewodnik krok po kroku do generowania docelowych chimerycznych embrionów danio pręgowanego poprzez przeszczep w stadium blastuli lub gastruli.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi używanych do uzyskania wglądu w złożone procesy rozwojowe jest analiza chimerycznych embrionów. Chimera jest definiowana jako organizm, który zawiera komórki więcej niż jednego zwierzęcia; Mozaiki to jeden z rodzajów chimer, w których mieszają się komórki z więcej niż jednego genotypu, zwykle typu dzikiego i zmutowanego. U danio pręgowanego chimery można łatwo wytworzyć poprzez przeszczepienie komórek z zarodka dawcy do zarodka gospodarza w odpowiednim stadium embrionalnym. Znakowane komórki dawcy są generowane przez wstrzyknięcie markera linii, takiego jak barwnik fluorescencyjny, do zarodka w stadium jednokomórkowym. Znakowane komórki dawcy są usuwane z zarodków dawcy i wprowadzane do nieznakowanych zarodków gospodarza za pomocą szklanej pipety kontrolowanej olejem, zamontowanej na mikroskopie złożonym lub preparacyjnym. Komórki dawcy mogą być w niektórych przypadkach ukierunkowane na określony region lub tkankę rozwijającego się zarodka gospodarza w stadium blastuli lub gastruli, wybierając miejsce przeszczepu w zarodku gospodarza na podstawie dobrze ustalonych map losu.

Część 1: Wstrzykiwanie zarodków danio pręgowanego w stadium 1-komórkowym.

1. Enzymatyczna dechorionacja zarodków w stadium 1-komórkowym.
   
   Aby proteolitycznie dekorionować zarodki, inkubuj w stadium 1-komórkowym przez ~1-5' w roztworze pronazy o stężeniu 0,5 mg/ml, jak opisano w Księdze Danio Pręgowanego 1. Dokładnie należy monitorować dechorionację i zanurzyć zarodki w pożywce zarodkowej (EM) za pomocą Pen/Strep 1, gdy tylko kosmówka zacznie się widocznie zapadać. Po uwolnieniu z kosmówek zarodki blastuli i gastruli są kruche i przyklejają się do plastiku lub rozpadają się pod wpływem powietrza. Dlatego należy przechowywać zdekorionowane zarodki zanurzone w Pen/Strep EM, przenosić między szalkami za pomocą pipety z polerowanego ogniowo szkła o szerokim otworze i utrzymywać w plastikowych naczyniach pokrytych agarem (1,2% agarozy w Pen/Strep EM) lub autoklawowanych szklanych szalkach Petriego.
   
2. Wstrzykiwanie zarodków z odwążówką markera rodowego.
   
   Przygotować naczynie do wstrzykiwań, wkładając szklane szkiełko pod kątem 45 stopni w najszerszą część szalki Petriego, wypełnionej w trzech czwartych 1,2% agarozą wykonaną w Pen/Strep EM. Usunięcie szkiełka po zestaleniu agarozy pozostawia ściętą korytkę. Przenieść zdechorionowane zarodki do koryta naczynia iniekcyjnego wypełnionego wstrzykiwaczem/Strep EM. Wstrzyknąć 1nl objętości znacznika pochodzenia za pomocą precyzyjnie skalibrowanej, ciągniętej ogniowo szklanej pipety iniekcyjnej i zestawu do wstrzykiwania ciśnieniowego, zgodnie z opisem w Zebry Zebry 1. Wstrzyknij barwniki i znaczniki linii o niskiej masie cząsteczkowej bezpośrednio do żółtka zarodków z odwąówką między stadiami 1- i 4-komórkowymi. 3% roztwór fluorescencyjnego dekstranu jest wystarczający, aby umożliwić wykrycie komórek pochodzących od dawcy w chimerycznych zarodkach przez kilka dni rozwoju. Gdy markerem linii jest mRNA kodujące białko fluorescencyjne (na przykład GFP lub RFP), należy wstrzyknąć bezpośrednio do komórki zarodka we wczesnym stadium 1-komórkowym.
   
3. Wstrzykiwanie zarodków bez dekorionacji markera linii.
   
   Przygotować wielodołkowe naczynia iniekcyjne, zestalając 1,2% agarozy w EM wokół formy z dołkami o mniej więcej tej samej szerokości co średnica kosmówki. Przenieść zarodki bez dekorionacji do wielodołkowego naczynia iniekcyjnego wypełnionego do połowy wstrzykiwaczem/Strep EM. Usuń nadmiar płynu. Tak unieruchomione zarodki mogą być wstrzykiwane z 1 nl objętością markera rodowego, jak opisano powyżej.
   
4. Hodowla wstrzykniętych zarodków do przeszczepu.
   
   Hodować zarodki w niskiej gęstości (40-50 zarodków na talerz) w świeżym długopisie/paciorkowcach EM. Dość dokładnie dopasuj etapowo zarodki dawcy i gospodarza używane do przeszczepu. W przypadku przeszczepów w fazie tarczowej należy dążyć do tego, aby dawcy nieznacznie pozostawali w tyle za gospodarzami; Należy pamiętać, że wstrzykiwane zarodki są zwykle nieco opóźnione. Inkubuj zarodki w różnych temperaturach, 25°C, 28°C i 31°C, aby rozłożyć ich rozwój i zmaksymalizować okno czasowe, w którym można wykonać przeszczepy.
   

Część 2: Tworzenie chimerycznych embrionów danio pręgowanego przez przeszczep.

1. Przeszczep w stadium blastuli pod mikroskopem stereoskopowym

1. Opis platformy do przeszczepu blastuli
   
   Aparatura używana do przeszczepiania komórek u blastuli danio pręgowanego składa się ze sterowanej napędem mikrometrycznej strzykawki Hamiltona (10 l-50 l) przymocowanej za pomocą trójdrożnego kranu do zbiornika oleju mineralnego i do uchwytu na mikropipety za pomocą elastycznej rurki. Po zmontowaniu zestawu do przeszczepów napełnia się go olejem mineralnym, dbając o wyeliminowanie wszelkich pęcherzyków powietrza z układu. Obecność pęcherzyków powietrza negatywnie wpłynie na zdolność kontrolowania ssania i ciśnienia. Użyj mikroskopu stereoskopowego o dość dużym powiększeniu i dobrej optyce (najlepiej co najmniej 80-krotnym powiększeniu). Położenie uchwytu na mikropipetę i igły może być kontrolowane przez ręczny mikromanipulator Narishige, tak jak w przypadku iniekcji; jeśli jednak podstawa stereoskopu jest zbyt szeroka, aby umożliwić łatwy dostęp za pomocą mikromanipulatora, wówczas adapter, który mocuje się do korpusu mikroskopu stereoskopowego, można również kupić w Narishige. Mocowanie mikromanipulatora musi być bardzo stabilne, aby uniknąć przenoszenia drgań na igłę do przeszczepu; Do tego celu dobrze nadaje się podstawa magnetyczna.
   
2. Przygotowanie pipety do przeszczepu
   
   Igły do przeszczepów są wykonane ze szklanych pipet kapilarnych (patrz dwie opcje w tabeli odczynników poniżej), które są pobierane do delikatnego stożka na ściągaczu elektrod. Odłam końcówkę igły pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą żyletki o prostej krawędzi w miejscu, w którym wewnętrzna średnica igły jest nieco większa niż komórki, które mają być przeszczepione. Trzymaj żyletkę pod niewielkim kątem, aby utworzyć skos i sprawić, by przerwa była jak najbardziej gładka, bez postrzępionych krawędzi. W przypadku przeszczepów w stadium blastuli zewnętrzna średnica igły powinna wynosić około 50-60 mm.
   
3. Montaż zarodków do przeszczepu w foremkach agarowych
   
   Przygotuj naczynia iniekcyjne, unosząc plastikową formę z rzędami wypukłości w kształcie klina na szalce Petriego, która jest do połowy wypełniona stopioną 1,2% agarozą w EM. Gdy agaroza zastygnie, usuń szablon, pozostawiając formę agarową, która zawiera rzędy trójkątnych dołków, z których każdy jest wystarczająco duży, aby pomieścić jeden zarodek. Napełnij formę transplantacyjną długopisem/paciorkowcami EM i załaduj zarodki w stadium blastuli pojedynczo do każdej studzienki za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo, tak aby zarodki dawcy zostały umieszczone w jednej kolumnie, a zarodki gospodarza w sąsiedniej kolumnie.
   
4. Przeszczepianie komórek
   
   Umieścić zarodki w dołkach do przeszczepu na boku; W razie potrzeby podczas przeszczepu należy zmienić położenie za pomocą pipety do przeszczepu, uważając, aby nie przebić żółtka. Umieść szalkę na stoliku tak, aby gdy igła do przeszczepu wejdzie do zarodka, igła docisnęła zarodek do tylnej ściany jego studni. Za pomocą mikromanipulatora opuść igłę do przeszczepu do naczynia pod dość ostrym kątem. Idealnie byłoby, gdyby igła do przeszczepu weszła do zarodka pod kątem około 45 stopni. Gdy końcówka igły znajdzie się pod powierzchnią pożywki zarodkowej, należy wciągnąć niewielką ilość pożywki zarodkowej do igły, przekręcając napęd mikrometryczny sterujący strzykawką Hamiltona. W celu jak najdokładniejszej kontroli, granica faz między olejem mineralnym a podłożem zarodkowym powinna pozostać w cienkiej, zwężającej się części igły, ale nie za blisko końca. Delikatnie ustawić zarodek dawcy za pomocą igły, a następnie cofnąć igłę i wprowadzić do osłonki blastuli zarodka w żądanej pozycji. Szybkie, mocne uderzenie przeniknie do zarodka, nie powodując jego toczenia. Powoli i ostrożnie pobrać komórki dawcy do igły. Jeśli komórki zostaną pobrane zbyt szybko, prawdopodobnie zostaną ścinane. Unikaj również wkładania żółtka do igły, ponieważ zwiąże się ono z olejem mineralnym, który następnie zabije komórki. Po pobraniu pożądanej liczby komórek należy nieznacznie odwrócić ciśnienie, aby zatrzymać ssanie i usunąć igłę z zarodka. Ustawić zarodek gospodarza na miejscu, przesuwając szalkę do przeszczepu. Niewielkie korekty pozycji zarodka gospodarza można dokonać, delikatnie obracając go za pomocą igły do przeszczepu, o ile zachowa się ostrożność, aby nie dotknąć żółtka. Podczas wydalania komórek dawcy do zarodka gospodarza należy unikać wprowadzania dużej ilości pożywki zarodkowej lub oleju mineralnego, ponieważ może to zakłócić rozwój lub zabić zarodek. Położenie komórek wzdłuż osi zwierzęco-roślinnej wpływa na ich udział w jednym z trzech listków rozrodczych, endodermie, mezodermie i ektodermie 2,3 . W związku z tym komórki przeszczepione blisko brzegu przed rozpoczęciem gastrulacji dadzą początek preferencyjnie endodermie i mezodermie, podczas gdy komórki przeszczepione w kierunku bieguna zwierzęcego przyczynią się do losów ektodermalnych, najczęściej ektoderma powierzchniowa, przodomózgowie i oczy. W ten sposób można osiągnąć pewien stopień celowania w tkanki nawet w stadiach blastuli. Po zakończeniu transferów komórek przenieś pary dawca-gospodarz do pokrytych agarem studzienek 24-dołkowej płytki, aby dalej się rozwijać.
   

1. Przeszczep w stadiach gastruli pod mikroskopem złożonym

1. Opis platformy do przeszczepu Transfery komórek
   
   wykonywane za pomocą mikroskopu złożonego korzystają z precyzyjnej kontroli położenia igły zapewnianej przez trójosiowy mikromanipulator olejowo-hydrauliczny. Ten mikromanipulator kontroluje precyzyjne ruchy pipety do przeszczepu, podczas gdy ssanie w pipecie jest kontrolowane przez strzykawkę Hamiltona z napędem mikrometrycznym, podobną do tej używanej do przeszczepów blastuli. Pionowy mikroskop złożony ze stałym stolikiem jest preferowany do wykonywania transferów komórek, ponieważ ogniskowanie takiego mikroskopu nie powoduje ruchu zarodka względem pipety. Jeśli jednak konieczne jest użycie mikroskopu złożonego z regulowanym stolikiem, wówczas mikromanipulator można zamontować na stoliku, a nie na korpusie mikroskopu, z tym samym efektem. Adaptery, które zapewniają opcje montażu mikromanipulatora do stolika lub korpusu mikroskopów złożonych różnych producentów, są również dostępne w Narishige.
   
2. Przygotowanie pipety do przeszczepu
   
   Igły do przeszczepów są wykonane zasadniczo tak, jak opisano powyżej; W przypadku przeszczepów w stadium Gastrula idealny otwór igły wynosi 30-40 mm. Po utworzeniu osłonki warstwa otaczająca (EVL) staje się bardziej przylegająca, co utrudnia igle transplantacyjnej wniknięcie w zarodek. Aby ułatwić wprowadzanie igły, pociągnij zadzior na końcu igły za pomocą mikrokuźni. Najpierw wygładź końcówkę igły, zbliżając ją do włókna mikrokuźni; Następnie obróć igłę tak, aby krawędź natarcia skosu mogła zetknąć się z filamentem. Gdy krawędź natarcia igły zetknie się z filamentem, odciągnij go szybko, aby utworzyć zadzior lub harpun. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, zadzior powinien być prosty, a końcówka igły nie powinna się zakrzywiać
   
3. Umieszczanie zarodków do przeszczepu w metylocelulozie
   
   W przypadku przeszczepów mikroskopem złożonym, zarodki należy umieścić na szkiełku depresyjnym w 3% roztworze metylocelulozy (Sigma) rozpuszczonym w pożywce dla zarodków. Najpierw rozsmaruj pionowy pasek metylocelulozy w wgłębieniu szkiełka wgłębieniowego, a następnie zalej dużą ilością pożywki embrionalnej. Za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety przenieś jednego donora i trzech gospodarzy w stadium osłonowym pod powierzchnię EM na szkiełku wgłębieniowym po jednej stronie metylocelulozy. Wybierz zarodki dawców, które są nieco młodsze od gospodarzy (30-50% epibolii). Za pomocą małej pętli wykonanej przez przyklejenie końców krótkiej żyłki testowej o wadze 2 funtów do końca rurki kapilarnej, delikatnie zwiń zarodki dawcy i gospodarza na wierzch paska metylocelulozy i wepchnij je do metylocelulozy, aż będą bezpieczne. Jeżeli przeszczepione komórki mają być ukierunkowane na określoną domenę, znajomość mapy losu stadium tarczy 3,4 oraz położenia tkanki docelowej względem tarczy jest niezbędna, aby zarodki gospodarza mogły być prawidłowo umieszczone. Gdy zarodki gospodarza są umieszczane w metylocelulozie, zwiń je tak, aby obszar docelowy znajdował się powyżej, ponieważ podczas przeszczepu igła wejdzie w zarodek stycznie, aby dostarczyć komórki dawcy bez uszkadzania żółtka.
   
4. Przeszczepianie komórek
   
   Ustawić igłę do przeszczepu, przesuwając ją w płaszczyznę ogniskową zarodka. Najpierw skup się na zarodku dawcy za pomocą obiektywu 10x. Następnie odsuń zarodek na bok i bez regulacji płaszczyzny ogniskowej użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić ostrość końcówki igły do przeszczepu. Umieść uchwyt na mikropipetę i igłę pod dość płytkim kątem, tak aby igła znajdowała się tak blisko poziomu, jak pozwala na to krawędź wgłębienia na szkiełku. Jeśli zarodek jest prawidłowo osadzony w metylocelulozie, nie będzie się toczył podczas wprowadzania igły do przeszczepu, chyba że zarodek jest zbyt stary, aby igła mogła łatwo wbić się w nią. Warstwa otaczająca wydaje się twardnieć wraz z wiekiem zarodków, dlatego przeszczepy w stadium gastruli najlepiej wykonywać zaraz po utworzeniu tarczy. Po fazie kopuły żółtko znajduje się tuż pod komórkami czapeczki blastodermy, która stopniowo rozrzedza się w miarę postępu epibolii. Aby uniknąć przebicia żółtka, igła powinna wejść do zarodka w płaszczyźnie ogniskowej, która jest nieco głębsza niż EVL. Podczas pobierania dużej liczby komórek z zarodka dawcy należy przesuwać igłę w miarę pobierania komórek, aby uniknąć przypadkowego zassania żółtka do igły. Jeśli komórki z jednego zarodka dawcy mają być przeszczepione wielu gospodarzom, najlepiej jest wprowadzić igłę do dawcy tylko raz, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia. Komórki dawcy mogą być następnie przenoszone w żądane miejsce w maksymalnie trzech zarodkach gospodarza. W przypadku transferu komórek z dwóch lub więcej zarodków dawcy do jednego zarodka gospodarza, najlepiej jest pobrać komórki z każdego z zarodków dawcy do tej samej igły do przeszczepu przed przesadzeniem ich do zarodka gospodarza. Minimalizuje to uszkodzenia zarodka gospodarza i zapewnia, że komórki są przenoszone do tego samego obszaru zarodka, dzięki czemu można porównać ich zachowania. Między komórkami dawcy w igle do przeszczepu dochodzi do bardzo niewielkiego mieszania, dlatego komórki powinny być przenoszone do jednego gospodarza, gdy używa się więcej niż jednego dawcy. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że komórki dawcy przyczynią się do powstania pożądanej tkanki, należy wydalić komórki dawcy podczas przeciągania igły przez obszar docelowy, w przeciwieństwie do umieszczania komórek w jednym kępce. Po zakończeniu transferów komórek umieść całe szkiełko na szalce Petriego i ostrożnie zalej Pen/Strep EM. W ciągu następnych kilku godzin metyloceluloza rozpuści się, uwalniając zarodki.
   

Figure 1:Mikroskop do tworzenia chimerycznych embrionów. Odp .: Zestaw do przeszczepu pod mikroskopem preparacyjnym składa się z wypełnionej olejem strzykawki Hamiltona z napędem mikrometrycznym (a) podłączonym do zbiornika wypełnionego olejem (b) oraz pipety transplantacyjnej (c) za pomocą 3-kierunkowego kranu (d). Pipeta do przeszczepu jest zamontowana na gruboziarnistym mikromanipulatorze (e), który jest przymocowany do metalowej płyty podstawy (nie pokazano) za pomocą stopki magnetycznej (f). Przeszczepy wykonywane są na stanowisku mikroskopu stereoskopowego (g) wyposażonego w dolne oświetlenie dla optymalnej optyki. B: zestaw do przeszczepu mikroskopu złożonego składa się z podobnej wypełnionej olejem strzykawki Hamiltona i napędu mikrometrycznego (a,b), ale w tym przypadku pipeta do przeszczepu jest zamontowana na uchwycie pipety (c), której ruchy X, Y i Z mogą być kontrolowane przez mikromanipulator gruboziarnisty (d) lub drobny (e). W tym przykładzie mikromanipulator jest zamontowany na korpusie mikroskopu stałostolikowego, jednak możliwe jest również zamontowanie go na stoliku zwykłego mikroskopu. Zarodki, które są unieruchomione w metylocelulozie na szkiełku depresyjnym, są wizualizowane za pomocą obiektywu 10x (f). C: Forma transplantacyjna do unieruchamiania zarodków do przeszczepów stereomikroskopowych. Zdechorionowane zarodki wrzuca się pojedynczo do studzienek wykonanych przez odlewanie tej formy do agarozy na 90-milimetrowej szalce Petriego. Pokazane są wymiary studni.

Figure 2:Montowanie embrionów do przeszczepów w stadium gastruli. Odp .: idealny kształt pipety do przeszczepu gastruli. Faza z ostrą końcówką pomaga w penetracji zarodka. B: Unieruchamianie zarodków dawcy i gospodarza w metylocelulozie. Pasek metylocelulozy umieszcza się w studzience szkiełka depresyjnego i zalewa dużą ilością pożywki embrionalnej. Zarodki dodaje się do podłoża zarodkowego i zwija na metylocelulozę za pomocą małej pętli (C). Powiększenie zarodków D-G na ryc. 1B. D: Zarodek dawcy jest zorientowany tak, aby umożliwić najłatwiejszy dostęp do pipety, ponieważ komórki na tym etapie są jeszcze niezaangażowane. E-G: Zarodki gospodarza w stadium tarczowym są zorientowane tak, aby obszar docelowy znajdował się najwyżej. Komórki przeszczepione do obszarów pudełkowych przyczynią się do grzbietu tyłomózgowia i grzebienia nerwowego czaszki wywodzącego się z lewej (E) i prawej (G) strony lub do brzusznego tyłomózgowia i rdzenia kręgowego (F).

Figure 3: Reprezentatywne obrazy zarodków chimerycznych.
(A-C) 18hpf chimeryczne zarodki powstałe w wyniku przeszczepu w stadium tarczy, pokazane w widoku grzbietowym, z przodu po lewej stronie. Panie przewodniczący, panie i panowie! Funkcje sortowania receptora powierzchniowego EphA4 ujawnione przez analizę zarodków chimerycznych. Lewe panele: połączenie komórek dawcy znakowanych rodaminą (rod.) (czerwony) i transgenicznego GFP ulegającego ekspresji w określonych segmentach tyłomózgowia (zielony). (A) Komórki WT przyczyniają się do budowy całego tyłomózgowia kontrolnego zarodka chimerycznego. (B) Komórki dawcy zubożone w EphA4 są wykluczone z określonych segmentów w tyłomózgowiu gospodarza WT. (C) Komórki dawcy ukierunkowane na różne części cewy nerwowej w przeszczepach w fazie osłonowej. Komórki dawcy (czerwone) ukierunkowane na przodomózgowie / śródmózgowie (lewy panel) lub tyłomózgowie / rdzeń kręgowy (prawy panel) gospodarza WT wybarwione przeciwciałem EfnB2a, które oznacza przodomózgowie, granicę śródmózgowia i środkowy segment tyłomózgowia (zielony). Paski skali: 50μm.

Dyskusja

Łatwość, z jaką przeszczep może być wykorzystany do wytworzenia ukierunkowanych chimer, jest jedną z wielkich zalet danio pręgowanego jako modelu kręgowców. Modyfikacja tego protokołu, która nie została opisana powyżej, pozwala na analizę funkcji genów matczynych dla genów odgrywających istotną rolę w rozwoju zygoty. Ponieważ te zmutowane ryby nie mogą przetrwać do dorosłości, konieczne jest przeniesienie zmutowanej linii zarodkowej do zarodka gospodarza, który w przeciwnym razie byłby dzikim typem, tworząc "klony linii ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw iniekcyjny	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3	Pedał nożny można zamówić osobno
Pronase	Sigma-Aldrich	P5147	proteaza typ XIV”
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4458	100x kolba
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M-0387
Fluorescencyjne sondy	molekularne dextrans, Life Technologies	różne	Np. dekstran rodaminy utrwalany lizyną (D7162)
Pipety iniekcyjne (1,2 mm x 0,94 mm x 10 cm)	Sutter Instrument Co.	BF120-94-10
Pipeta do przeszczepów, opcja 1	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4
Pipeta do przeszczepów opcja 2	VWR international	#53508-400
mikromanipulator	Narishige International	UMJ-3FC (?)
Stojak magnetyczny mikromanipulatora	Narishige International	GJ-1
Aparat transplantacyjny	Sutter Instrument Co.	MI-10010
Drobny mikromanipulator	Narishige International	MMO-203
Szkiełka depresyjne	Fisher Scientific	12560A
Formy agarowe do wstrzykiwań i przeszczepów	AL-AN Mfg, Inc.
Reodczynniki: Przepisy na wiele odczynników używanych do tych procedur można znaleźć w The Zebrafish Book, która jest dostępna w pełnej wersji online pod adresem http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Podano tam przepisy na przygotowanie wody dla ryb, pożywki dla zarodków z antybiotykami i bez antybiotyków, pronazy do dechorionacji, dektransu fluorescencyjnego i metylocelulozy.